專利名稱：癌變細(xì)胞集落的培養(yǎng)體系、檢測分析系統(tǒng)以及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌變細(xì)胞集落的檢測分析系統(tǒng)、癌變細(xì)胞集落檢測方法以及使用于癌變細(xì)胞集落檢測方法中的癌變細(xì)胞集落的培養(yǎng)體系。更加詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及含有軟瓊脂且通過軟瓊脂多層法加以實(shí)施的培養(yǎng)體系，和將使用該培養(yǎng)體系的細(xì)胞培養(yǎng)以及經(jīng)過培養(yǎng)的細(xì)胞半自動(dòng)化而檢測出癌細(xì)胞集落的系統(tǒng)及其方法。
背景技術(shù)：
雖然醫(yī)療技術(shù)已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，但在日本癌癥依然是自從1981年以來主要的死亡原因。因此，整個(gè)社會(huì)開始關(guān)注癌癥的預(yù)防工作。所以，必須在首先了解癌癥發(fā)病過程的基礎(chǔ)上才能更好地預(yù)防癌癥。
通常致癌性物質(zhì)滯留在體內(nèi)時(shí)，可以通過生物體自身的防御能力而代謝掉大部分致癌性物質(zhì)，并從體內(nèi)排出。滯留在體內(nèi)的一部分致癌物質(zhì)經(jīng)歷三個(gè)階段后將會(huì)最終導(dǎo)致癌癥。首先，這些致癌物質(zhì)在短時(shí)間(例如幾天時(shí)間)內(nèi)將會(huì)對(duì)細(xì)胞基因帶來障礙，從而導(dǎo)致產(chǎn)生變異細(xì)胞。該變異細(xì)胞經(jīng)歷數(shù)年乃至數(shù)十年的潛伏期從而成為前期癌變細(xì)胞。最后，前期癌變細(xì)胞以較快的速度(例如一年時(shí)間)增殖，從而導(dǎo)致癌癥。直至成為這樣的前期癌變細(xì)胞為止，我們自身都不會(huì)有任何感覺，而且現(xiàn)在的醫(yī)療技術(shù)也很難檢測出前期癌變細(xì)胞，所以一旦診斷為癌癥，那么剩下的時(shí)間就不多了。
另一方面，通過流行病學(xué)調(diào)查得知大部分的癌癥發(fā)病原因是由于我們生活的環(huán)境、特別是與飲食相關(guān)的生活習(xí)慣所造成的，這種看法已經(jīng)越來越受到重視；為了實(shí)現(xiàn)長壽健康的社會(huì)，已經(jīng)對(duì)“飲食與癌癥預(yù)防”的關(guān)聯(lián)性寄予了熱切的關(guān)注。
但是，如上所述從變異細(xì)胞成為癌細(xì)胞將要經(jīng)歷較長的時(shí)間，因此為了預(yù)防癌癥，必須持續(xù)性地阻礙這個(gè)較長的癌變過程?，F(xiàn)今，難以驗(yàn)證由于改善飲食所達(dá)成的癌癥預(yù)防效果，只有依靠流行病學(xué)調(diào)查來獲知預(yù)防效果。因此，迫切希望能開發(fā)出檢驗(yàn)食品材料預(yù)防癌癥有效方法以及探明其作用機(jī)理。
作為開發(fā)檢驗(yàn)食品材料預(yù)防癌癥的方法以及探明其作用機(jī)理的方法之一，在Proceedings of the National Academy of Science of the UnitedStates of America.98卷、13號(hào)、7510～7515頁上記載了一種檢驗(yàn)方法，其通過在瓊脂培養(yǎng)基中形成集落后再計(jì)算測定該集落數(shù)量，從而檢驗(yàn)由于致癌劑所造成的正常細(xì)胞癌變以及癌細(xì)胞發(fā)展。
但是，現(xiàn)有技術(shù)中在瓊脂培養(yǎng)基濃度以及厚度方面存在問題，無法獲得穩(wěn)定的細(xì)胞集落數(shù)量。而且，培養(yǎng)時(shí)間較長，需要20～30天。而且，在現(xiàn)有技術(shù)中，可以在顯微鏡下用肉眼觀察集落的檢測，雖然可以計(jì)算出集落數(shù)量，但是無法分析集落大小以及分布。而且，計(jì)算集落數(shù)量非常需要時(shí)間以及體力，同時(shí)，計(jì)數(shù)的結(jié)果會(huì)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)者的不同而出現(xiàn)個(gè)體差異，所以存有精度方面的問題，這也成為了該檢驗(yàn)方法所需解決的課題。而且，為了可以使用該檢驗(yàn)方法實(shí)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)者的熟練程度也時(shí)該檢驗(yàn)方法所需解決的課題。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種癌變細(xì)胞集落的檢測分析系統(tǒng)以及檢測分析方法，其可以迅速且正確地檢測出將會(huì)引起細(xì)胞癌變的環(huán)境中存在的細(xì)胞致癌劑和可以抑制細(xì)胞癌變的藥品或食品等。
本發(fā)明者鑒于上述課題而積極探討后，發(fā)現(xiàn)對(duì)癌變細(xì)胞的培養(yǎng)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并將依照該標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)的癌變細(xì)胞以數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)形式存入計(jì)算機(jī)等演算機(jī)構(gòu)中，然后對(duì)存入的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行特殊處理，由此可解決上述課題從而完成本發(fā)明。
第一發(fā)明是一種癌變細(xì)胞集落的培養(yǎng)體系，其特征在于其基于瓊脂多層培養(yǎng)法調(diào)制而成，并且包含底層和上層；所述上層具有2.4mm厚度，并含有培養(yǎng)基、0.5％～0.6％濃度的軟瓊脂、以及選自由致癌誘變物質(zhì)以及抗癌劑所組成組中的至少一種物質(zhì)；所述上層具有1.6mm厚度，并含有培養(yǎng)基、0.3％～0.4％濃度的軟瓊脂和細(xì)胞。
在第一發(fā)明所述的癌變細(xì)胞集落的培養(yǎng)體系中，重要的是底層與上層分別具有規(guī)定的構(gòu)成。即，將培養(yǎng)體系設(shè)為固定條件，由此可獲得具有重現(xiàn)性的檢測以及分析結(jié)果。
另外，第一發(fā)明中，優(yōu)選培養(yǎng)體系上層中含有的細(xì)胞是新生小鼠皮膚細(xì)胞JB6株。
JB6細(xì)胞是從新生小鼠皮膚的第一代培養(yǎng)細(xì)胞所確立的細(xì)胞株。該細(xì)胞具有非腫瘤性，僅通過促癌劑(TPA、TNF-α、EGF)處理即可具有形成軟瓊脂集落的能力。而且，該細(xì)胞通過TPA一段時(shí)間的處理，可以獲得集落能，再加以促進(jìn)將會(huì)處于前期癌變狀態(tài)，因此可以認(rèn)為該細(xì)胞是促癌檢測系和分析其作用機(jī)理中優(yōu)異的材料。并且，在本發(fā)明的檢測系中表現(xiàn)出癌抑制活性的多數(shù)化合物在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段已證實(shí)了同樣的致癌抑制效果。因此，現(xiàn)在該檢測系作為可以迅速檢測出促進(jìn)致癌抑制效果的方法而受到重視。
第二發(fā)明是一種癌變細(xì)胞集落的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于使用基于瓊脂多層培養(yǎng)法所調(diào)制的培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)體系包含具有規(guī)定尺寸的底層和具有規(guī)定尺寸的上層；所述底層含有培養(yǎng)基、軟瓊脂、以及選自由致癌誘變物質(zhì)以及抗癌劑所組成組中的至少一種物質(zhì)；所述上層含有培養(yǎng)基、軟瓊脂和細(xì)胞；并且該檢測分析系統(tǒng)包含光學(xué)顯微鏡，其用于觀察通過該培養(yǎng)體系所培養(yǎng)的癌變集落；包含電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，其用于將顯影在該光學(xué)顯微鏡中的集落影像轉(zhuǎn)換為電子數(shù)據(jù)；以及包含計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其用于處理通過該電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)所轉(zhuǎn)換的電子數(shù)據(jù)；該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中采用了一種圖像分析軟件，其用于灰色化該電子數(shù)據(jù)，進(jìn)行校準(zhǔn)，并通過減法和單一閾值進(jìn)行二值化，進(jìn)而分析選自由有無集落、集落數(shù)量和集落尺寸分布所組成組中的至少一種情況。
通過這樣的構(gòu)成，可以迅速且正確地檢測出環(huán)境中存在的將會(huì)引起細(xì)胞癌變的細(xì)胞致癌劑，而且可以迅速且正確地檢測出能夠抑制細(xì)胞癌變的藥品或食品。
在第二發(fā)明中，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)根據(jù)從已知的致癌誘變物質(zhì)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)而獲取分析結(jié)果，優(yōu)選該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)上述已知的致癌誘變物質(zhì)的分析結(jié)果與選自由致癌誘變物質(zhì)以及抗癌劑所組成組中的至少一種物質(zhì)的分析結(jié)果進(jìn)行比較。
將已知成分作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可以較為容易地調(diào)查出未知成分的癌變動(dòng)向。另外，本發(fā)明中所使用的專用語“癌變動(dòng)向”，其是指物質(zhì)具有癌抑制作用或者誘變作用中任何一種作用。
進(jìn)而，在第二發(fā)明中，優(yōu)選上述已知的致癌誘變物質(zhì)選自由TPA、TNF-α和活性氧源所組成的組。
這些物質(zhì)的致癌誘變動(dòng)向是眾所周知的，如果以其作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并與這些物質(zhì)相比較，則可以容易地掌握未知物質(zhì)的癌誘變動(dòng)向或者癌抑制動(dòng)向。
第三發(fā)明是一種癌變細(xì)胞集落的檢測分析方法，其特征在于使用本發(fā)明所述的檢測分析系統(tǒng)；并且含有如下階段(A)選擇具有致癌作用或者抗癌作用的物質(zhì)并調(diào)制出上述培養(yǎng)體系的階段；(B)在上述培養(yǎng)體系中根據(jù)規(guī)定條件在規(guī)定時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)癌變細(xì)胞的階段；(C)通過顯微鏡以及電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，將上述經(jīng)過培養(yǎng)的癌變細(xì)胞以電子圖像數(shù)據(jù)形式傳送到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的階段；以及(D)將上述傳送來的電子圖像數(shù)據(jù)灰度化，進(jìn)行校準(zhǔn)，并根據(jù)減法和單一閾值進(jìn)行二值化，進(jìn)而分析選自由有無集落、集落數(shù)量和集落尺寸分布所組成組中的至少一種情況的階段。
通過這樣的構(gòu)成，可以迅速且正確地檢測出環(huán)境中存在的將會(huì)引起細(xì)胞癌變的細(xì)胞致癌劑或者可以抑制細(xì)胞癌變的藥品或食品等。
在第三發(fā)明的階段(A)中，優(yōu)選具有致癌作用或者抗癌作用的物質(zhì)是食品或者源自食品的物質(zhì)。
食品的抗癌作用以及致癌性是現(xiàn)在最受重視的問題。本發(fā)明可以檢測出這些食品或源自食品的物質(zhì)的癌變動(dòng)向。
而且，在第三發(fā)明的階段(B)中，優(yōu)選培養(yǎng)體系的培養(yǎng)條件為大約37℃、5％二氧化碳?xì)怏w中培養(yǎng)15天～30天。
通過將培養(yǎng)條件標(biāo)準(zhǔn)化，從而可以在同一條件下高精度且高重現(xiàn)性地實(shí)施檢測。
進(jìn)而，在第三發(fā)明的階段(D)中，優(yōu)選使用在該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中所運(yùn)行的圖像分析軟件來實(shí)施分析，并進(jìn)行瓊脂凝膠的透明度均勻化，處理顯微鏡散射光線，然后分析選自由集落形狀、尺寸以及數(shù)量的計(jì)算測定和大小分布所組成組中的至少一種情況；并且，優(yōu)選通過圖像差分處理辨別無用物與集落的形狀，將長徑/短徑的數(shù)值小于等于1.6的細(xì)胞集落辨別為癌變細(xì)胞集落。
通過使用該圖像分析軟件，可以高精度且高重現(xiàn)性地實(shí)施檢測。而且，通過使用圖像分析軟件，無需熟練技能即可實(shí)施檢測。


圖1是表示本實(shí)施例所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)概略的模式圖。
圖2是表示使用本實(shí)施例所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)體系的底層中添加有薯汁濃縮液的情況進(jìn)行測定所得結(jié)果的曲線圖。
圖3是表示使用本實(shí)施例所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)體系的底層中添加有藍(lán)莓花青素的情況進(jìn)行測定所得結(jié)果的曲線圖。
圖4是表示使用本實(shí)施例所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)體系的底層中添加有來源于中藥大黃的大黃酸的情況進(jìn)行測定所得結(jié)果的曲線圖。
圖5是表示使用本實(shí)施例所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)體系的底層中分別添加有花色素中含有的芍藥素、錦葵色素、天竺葵色素、花青素(cyanidin)和翠雀花素的情況進(jìn)行測定所得結(jié)果的曲線圖。
具體實(shí)施例方式
以下，說明本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)。
首先，圖1簡要表示出了本發(fā)明所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)。由該圖1可知，本發(fā)明所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)主要包含培養(yǎng)體系1和檢測系2；所述培養(yǎng)體系1基于規(guī)定的瓊脂多層培養(yǎng)法調(diào)制而成；所述檢測系2用于檢測分析通過上述培養(yǎng)體系所培養(yǎng)的癌變細(xì)胞。
(培養(yǎng)體系)本發(fā)明中所使用的培養(yǎng)體系1是基于瓊脂多層培養(yǎng)法調(diào)制而成的，并且包含底層11和上層12；所述底層11具有規(guī)定的尺寸，并含有培養(yǎng)基、軟瓊脂、以及選自由致癌誘變物質(zhì)以及抗癌劑所組成組中的至少一種物質(zhì)；所述上層12具有規(guī)定的尺寸，并含有培養(yǎng)基、軟瓊脂和細(xì)胞。
底層11中所使用的培養(yǎng)基可以從現(xiàn)有公知的培養(yǎng)基中適當(dāng)選擇使用，例如可以使用EMEM(Eagle氏最小基礎(chǔ)培養(yǎng)基)加上5％牛胎兒血清。而且，關(guān)于底層11中所使用的軟瓊脂培養(yǎng)基，也可以使用現(xiàn)有公知的培養(yǎng)基，但考慮到重現(xiàn)性方面，特別優(yōu)選使用同一廠家生產(chǎn)的培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，形成底層11的軟瓊脂的濃度例如為0.5％～0.6％，優(yōu)選規(guī)定為0.5％的固定量。而且，厚度也規(guī)定為例如2.4mm的固定厚度。在這樣所構(gòu)成的底層11中，添加規(guī)定量的致癌衍生劑或者抗癌劑用于調(diào)整本發(fā)明培養(yǎng)體系1中的底層11。
另外，對(duì)于上層12以及底層11的瓊脂凝膠濃度和厚度來說，為便于顯微鏡拍攝，需要瓊脂凝膠具有一定透明度，因此要求研究瓊脂凝膠濃度和厚度，選擇不會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)造成影響并且也可以便于顯微鏡拍攝的瓊脂凝膠濃度和厚度。
至于此時(shí)所使用的致癌誘變劑，可以添加已經(jīng)充分確定致癌性的已知的致癌誘變劑，例如TPA、TNF-α、活性氧源以及未知致癌性的致癌性物質(zhì)。如后所述，添加已知的致癌性誘變劑，使用在規(guī)定條件下所調(diào)制的本發(fā)明培養(yǎng)體系1實(shí)行培養(yǎng)，使用經(jīng)過檢測分析的數(shù)據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，等量添加要求檢測分析的未知成分后與該標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)相比較，由此可以分析未知成分的致癌性。
而且，以同樣方式也可以在底層11中添加抗癌劑，例如各種醫(yī)藥用抗癌劑或食品等。進(jìn)而，例如在底層11中一起添加致癌誘變劑與抗癌劑，也可以分析該抗癌劑的抗癌作用。
本發(fā)明培養(yǎng)體系1中的上層12具有規(guī)定尺寸并含有規(guī)定濃度的軟瓊脂以及用于使癌細(xì)胞生長的細(xì)胞。
上層12中所使用的軟瓊脂需要設(shè)定為例如濃度0.3％～0.4％以及厚度1.6mm等規(guī)定條件。
本發(fā)明中對(duì)所使用的細(xì)胞沒有特別的限制，優(yōu)選JB6細(xì)胞。
JB6細(xì)胞是從新生小鼠皮膚的第一代培養(yǎng)細(xì)胞所確立的眾所周知的細(xì)胞株。(N.H.Colburn et al.，Nature，281，589(1979))。該細(xì)胞具有非腫瘤性，僅通過促癌劑(TPA、TNF-α、EGF)處理即可具有形成軟瓊脂集落的能力。而且，該細(xì)胞通過TPA一段時(shí)間的處理，可以獲得集落能，再加以促進(jìn)將會(huì)處于前期癌變狀態(tài)，因此可以認(rèn)為該細(xì)胞是檢測致癌促進(jìn)或者分析致癌促進(jìn)作用機(jī)理的優(yōu)異材料(參照Z.Dong etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，609(1994)；Z.Dong et al.，MolCarcinog.，19，204(1997)；J.J.Li et al.，Cancer Res.，57，3569(1997)；C.Huang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，156(1998)；以及J.Y.Chung et al.，Cancer Res.，59，4610(1999))。而且，在如后所述的與本發(fā)明相同的檢測系中，表現(xiàn)出癌抑制活性的多數(shù)化合物在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段已證實(shí)出同樣的致癌抑制效果(參照M.R.Young etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，9827(1999)；以及Y.Zhao etal.，Cancer Res.，61，6082(2001))。因此，現(xiàn)在使用該JB6細(xì)胞的檢測方法作為可以迅速地檢測出致癌促進(jìn)抑制效果的方法而受到重視。通過在本發(fā)明中使用該細(xì)胞，無需太多的時(shí)間和體力即可將由于實(shí)驗(yàn)者不同而造成的測定誤差減少到最小。
在本發(fā)明中，將如此構(gòu)成的軟瓊脂置于培養(yǎng)皿上，在規(guī)定溫度例如42℃溶解，從而形成培養(yǎng)體系1。
經(jīng)過如此調(diào)制的培養(yǎng)體系1在規(guī)定條件下加以培養(yǎng)。通過規(guī)定該培養(yǎng)體系1的培養(yǎng)條件，可以在短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定地實(shí)施癌細(xì)胞的組織培養(yǎng)，可以獲得具有重現(xiàn)性的檢測分析結(jié)果。
例如，在本發(fā)明中，培養(yǎng)條件是在大約37℃的溫度、5％二氧化碳?xì)怏w中培養(yǎng)15～30天，優(yōu)選在恒溫箱中培養(yǎng)15天，從而可以實(shí)施具有重現(xiàn)性的檢測分析。
(檢測系)
本發(fā)明癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)中的檢測系2主要包含顯微鏡21、與該顯微鏡21相連接的電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)即數(shù)碼相機(jī)22以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)23。
本發(fā)明中所使用的顯微鏡21是具有已知放大倍率的光學(xué)顯微鏡，只要可以與數(shù)碼相機(jī)22等電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)相連接，就沒有特別限制。
數(shù)碼相機(jī)22是電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，將使用顯微鏡21放大的模擬圖像轉(zhuǎn)換為作為電子數(shù)據(jù)的數(shù)字圖像數(shù)據(jù)，例如JPEG、TIFF、PCX、GIF格式等數(shù)字圖像數(shù)據(jù)。通過數(shù)碼相機(jī)22，數(shù)字圖像數(shù)據(jù)將會(huì)保存在內(nèi)置于數(shù)碼相機(jī)22中的記錄介質(zhì)上，經(jīng)由該記錄介質(zhì)可以存入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)23中，優(yōu)選經(jīng)由例如USB(通用串行總線)等接口直接傳送到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)23中。
本發(fā)明檢測系2中所使用的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)23主要包含存儲(chǔ)器，用于運(yùn)行保持在存儲(chǔ)器中的程序的演算處理裝置(CPU，中央處理單元)、RAM(隨機(jī)存儲(chǔ)器)、用于存取數(shù)碼相機(jī)22所拍攝的數(shù)字圖像數(shù)據(jù)的接口例如USB接口或記憶卡讀寫器等存取內(nèi)置于數(shù)碼相機(jī)22中的記錄介質(zhì)的機(jī)構(gòu)等。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)23的存儲(chǔ)器中保存有操作系統(tǒng)、圖像分析軟件等程序和數(shù)字圖像數(shù)據(jù)等。
在本發(fā)明中，從數(shù)碼相機(jī)22中讀取的培養(yǎng)結(jié)果即數(shù)字圖像數(shù)據(jù)可以通過圖像分析軟件加以分析。該圖像分析軟件例如可以將數(shù)字圖像數(shù)據(jù)灰度化，進(jìn)行校準(zhǔn)，并根據(jù)減法和單一閾值進(jìn)行二值化，進(jìn)而分析有無集落、集落數(shù)量和/或集落尺寸分布。此時(shí)，優(yōu)選根據(jù)顯微鏡拍攝的目的而使瓊脂凝膠的透明度均勻，并處理顯微鏡散射光線，更優(yōu)選通過在該技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的方法實(shí)施圖像差分處理，由此辨別無用物和癌變細(xì)胞集落的形狀。此時(shí)，細(xì)胞癌變集落通常為圓形，因此如果癌變細(xì)胞集落判定條件中長徑/短徑的數(shù)值小于等于1.6，則可以在除去細(xì)長的無用物等后再實(shí)施分析。
另外，在顯微鏡拍攝時(shí)，必然是中心部的光量較多，在中心部周邊視野較暗。因此，為了校正光量分布的影響而實(shí)行圖像差分處理。至于圖像差分處理的方法，是先拍攝未加入細(xì)胞的瓊脂凝膠培養(yǎng)皿，再將該數(shù)字圖像數(shù)據(jù)作為對(duì)照?qǐng)D像。如果從作為檢測分析對(duì)象的樣本圖像中除去該對(duì)照?qǐng)D像，則可以獲得亮度均勻化的樣本圖像。
通過如此構(gòu)成，可以有效地且高重現(xiàn)性地檢測以及分析在培養(yǎng)體系1中根據(jù)規(guī)定條件所培養(yǎng)的細(xì)胞。
其次，列舉出使用本發(fā)明癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)時(shí)與使用現(xiàn)有系統(tǒng)時(shí)實(shí)施檢測分析的差異。
現(xiàn)有系統(tǒng)與本發(fā)明系統(tǒng)的差異調(diào)制樣本、培養(yǎng)細(xì)胞↓誘發(fā)細(xì)胞癌變(37℃、5％CO2、14天時(shí)間)↓ ↓癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng) 現(xiàn)有的計(jì)算測定法集落顯微鏡拍攝裝置 在顯微鏡下肉眼計(jì)數(shù)↓ ↓結(jié)果 結(jié)果(數(shù)量、形狀、大小、分布) (僅有集落數(shù)量)評(píng)估結(jié)果精度提高、時(shí)間縮短 計(jì)算測定者的個(gè)體差異分析項(xiàng)目增加 分析項(xiàng)目受限大量分析的容易 大量分析的困難改善研究環(huán)境 體力勞動(dòng)[實(shí)施例]其次，使用本發(fā)明所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)，在培養(yǎng)體系1的底層11中添加具有抗癌作用的源自食品的物質(zhì)后加以培養(yǎng)，在下述實(shí)施例中表示檢測分析癌變細(xì)胞集落后的結(jié)果。
(實(shí)施例1)在實(shí)施例1中，在底層11的瓊脂中添加薯汁濃縮液和TPA并調(diào)制出培養(yǎng)體系1。在規(guī)定條件下培養(yǎng)該培養(yǎng)體系1，在圖2中表示使用本發(fā)明所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)而檢測分析出的結(jié)果。圖2中所示的曲線圖中，縱軸表示癌變抑制率，橫軸表示薯汁濃度，并繪制出各濃度薯汁的癌變抑制率。
根據(jù)圖2中所示的曲線圖可以獲知如果薯汁濃度增加，則癌變抑制率得到提高。
(實(shí)施例2)在實(shí)施例2中，在底層11的瓊脂中添加藍(lán)莓中含有的藍(lán)莓花青素并調(diào)制出培養(yǎng)體系1。在規(guī)定條件下培養(yǎng)該培養(yǎng)體系1，在圖3中表示使用本發(fā)明所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)而檢測分析出的結(jié)果。圖3中所示的曲線圖與圖2中所示的曲線圖一樣，其中縱軸表示癌變抑制率，橫軸表示藍(lán)莓花青素濃度，并繪制出各濃度藍(lán)莓花青素的癌變抑制率。
根據(jù)該曲線圖可以獲知如果藍(lán)莓花青素濃度增加，則癌變抑制率得到提高。
(實(shí)施例3)在實(shí)施例3中，在底層11的瓊脂中添加源自中藥中大黃的大黃酸并調(diào)制出培養(yǎng)體系1。在規(guī)定條件下培養(yǎng)該培養(yǎng)體系1，在圖4中表示使用本發(fā)明所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)而檢測分析出的結(jié)果。圖4中所示的曲線圖與圖2中所示的曲線圖一樣，其中縱軸表示癌變抑制率，橫軸表示大黃酸濃度，并繪制出各濃度大黃酸的癌變抑制率。
根據(jù)該曲線圖可以獲知如果源自大黃的大黃酸濃度增加，則癌變抑制率得到提高。
(實(shí)施例4)在實(shí)施例4中，在底層11的瓊脂中分別添加花色素中含有的芍藥素、錦葵色素、天竺葵色素、花青素和翠雀花素并分別調(diào)制出培養(yǎng)體系1。在規(guī)定條件下分別培養(yǎng)培養(yǎng)體系1，在圖5中表示使用本發(fā)明所述的癌變細(xì)胞集落檢測分析系統(tǒng)而檢測分析出的結(jié)果。圖5中所示的曲線圖與圖2中所示的曲線圖一樣，其中縱軸表示癌變抑制率，橫軸表示源自花色素的各成分濃度，并繪制出各成分在各濃度的癌變抑制率。
根據(jù)該曲線圖可以獲知如果整體上各成分濃度增加，則癌變抑制率得到提高?？梢垣@知其中翠雀花素的細(xì)胞癌變抑制效果特別高。
以上，如實(shí)施例1至實(shí)施例4所述可知通過使用本發(fā)明的培養(yǎng)體系以及系統(tǒng)，可以定量性地測定癌細(xì)胞抑制率。
根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種檢驗(yàn)方法，其可以迅速且正確地檢測出環(huán)境中存在的將會(huì)引起細(xì)胞癌變的細(xì)胞致癌劑和可以抑制細(xì)胞癌變的藥品或食品，面向長壽健康的社會(huì)，能夠通過食品材料而有效預(yù)防癌癥。
權(quán)利要求
1.一種癌變細(xì)胞集落的培養(yǎng)體系，其特征在于其基于瓊脂多層培養(yǎng)法調(diào)制而成；并包含底層，其含有培養(yǎng)基、0.5％～0.6％濃度的軟瓊脂、以及選自由致癌誘變物質(zhì)以及抗癌劑所組成組中的至少一種物質(zhì)且具有2.4mm厚度；以及上層，其含有培養(yǎng)基、0.3％～0.4％濃度的軟瓊脂和細(xì)胞且具有1.6mm厚度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌變細(xì)胞集落的培養(yǎng)體系，其特征在于所述上層中所含有的細(xì)胞是新生小鼠皮膚細(xì)胞JB6株。
3.一種癌變細(xì)胞集落的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于使用基于瓊脂多層培養(yǎng)法所調(diào)制的培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)體系包含底層，其含有培養(yǎng)基、軟瓊脂、以及選自由致癌誘變物質(zhì)以及抗癌劑所組成組中的至少一種物質(zhì)且具有規(guī)定尺寸，以及上層，其含有培養(yǎng)基、軟瓊脂和細(xì)胞且具有規(guī)定尺寸；并且所述檢測分析系統(tǒng)包含光學(xué)顯微鏡，其用于觀察通過所述培養(yǎng)體系所培養(yǎng)的癌變集落；電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，其用于將顯影在所述光學(xué)顯微鏡中的集落影像轉(zhuǎn)換為電子數(shù)據(jù)；以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其用于處理所述電子數(shù)據(jù)；所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中采用了一種圖像分析軟件，其用于將所述電子數(shù)據(jù)灰度化，進(jìn)行校準(zhǔn)，并根據(jù)減法和單一閾值進(jìn)行二值化，進(jìn)而分析選自由有無集落、集落數(shù)量和集落尺寸分布所組成組中的至少一種情況。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的癌變細(xì)胞集落的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)用于比較已知的致癌誘變物質(zhì)的分析結(jié)果與選自由致癌誘變物質(zhì)以及抗癌劑所組成組中的至少一種物質(zhì)的分析結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的癌變細(xì)胞集落的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于所述已知的致癌誘變物質(zhì)選自由TPA、TNF-α和活性氧源所組成的組。
6.一種癌變細(xì)胞集落的檢測分析方法，其特征在于使用根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一權(quán)利要求所述的檢測分析系統(tǒng)；并且包括(A)選擇具有致癌作用或者抗癌作用的物質(zhì)并調(diào)制所述培養(yǎng)體系的階段；(B)在所述培養(yǎng)體系中根據(jù)規(guī)定條件在規(guī)定時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)癌變細(xì)胞的階段；(C)通過顯微鏡以及電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，將所述經(jīng)過培養(yǎng)的癌變細(xì)胞以電子圖像數(shù)據(jù)的形式傳送到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的階段；以及(D)將已經(jīng)傳送的所述電子圖像數(shù)據(jù)灰度化，進(jìn)行校準(zhǔn)，并根據(jù)減法和單一閾值進(jìn)行二值化，進(jìn)而分析選自由有無集落、集落數(shù)量和集落尺寸所組成組中的至少一種情況的階段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的癌變細(xì)胞集落的檢測分析方法，其特征在于在所述階段(A)中，所述具有致癌作用或者抗癌作用的物質(zhì)是食品或者源自食品的物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的癌變細(xì)胞集落的檢測分析方法，其特征在于在所述階段(B)中，所述培養(yǎng)體系的培養(yǎng)條件是在37℃、5％二氧化碳?xì)怏w中培養(yǎng)15天～30天。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的癌變細(xì)胞集落的檢測分析方法，其特征在于在所述階段(D)中，通過在所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中所運(yùn)行的圖像分析軟件實(shí)施所述分析，并且在使瓊脂凝膠的透明度均勻、對(duì)顯微鏡散射光線進(jìn)行處理后，分析選自由集落形狀、尺寸以及數(shù)量的計(jì)算測定和大小分布所組成組中的至少一種情況。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的癌變細(xì)胞集落的檢測分析方法，其特征在于在所述階段(D)中，所述分析通過圖像差分處理辨別無用物與癌變細(xì)胞集落的形狀，將長徑/短徑的數(shù)值小于等于1.6的細(xì)胞辨別為癌變細(xì)胞集落。
全文摘要
本發(fā)明提供一種癌變細(xì)胞集落的檢測分析系統(tǒng)以及癌變細(xì)胞集落的檢測分析方法，該系統(tǒng)和方法可以迅速且正確地檢測出環(huán)境中存在的將會(huì)引起細(xì)胞癌變的細(xì)胞致癌劑和可以抑制細(xì)胞癌變的藥品或食品，因此本發(fā)明的目的在于提供一種癌變細(xì)胞集落的檢測分析系統(tǒng)，其使用基于瓊脂多層培養(yǎng)法所調(diào)制的培養(yǎng)體系(1)且包含光學(xué)顯微鏡(21)、數(shù)碼相機(jī)等電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)(22)以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(23)，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(23)用于處理通過電子數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)(22)所轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)；上述培養(yǎng)體系(1)包含底層(11)以及上層(12)，底層(11)具有規(guī)定尺寸并含有培養(yǎng)基、軟瓊脂、致癌誘變物質(zhì)和/或抗癌劑，上層(12)具有規(guī)定尺寸并含有培養(yǎng)基、軟瓊脂和細(xì)胞。在該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(23)中采用了一種圖像分析軟件，其用于將電子數(shù)據(jù)灰度化，進(jìn)行校準(zhǔn)，并根據(jù)減法和單一閾值進(jìn)行二值化，進(jìn)而分析有無集落、集落數(shù)量和集落尺寸分布等。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1678751SQ03820519
公開日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2003年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月28日
發(fā)明者侯德興, 藤井信 申請(qǐng)人:侯德興, 藤井信, 自然路有限公司