專利名稱：識(shí)別分子化合物的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及定性及定量檢出分子間相互作用的方法和設(shè)備。
相關(guān)技術(shù)的說(shuō)明為了幫助描述現(xiàn)有的技術(shù)及本發(fā)明，提供在這里使用的術(shù)語(yǔ)表是有益的。“探針”傾向于指或者固定的或者自由移動(dòng)的已知實(shí)體?！鞍小被颉芭潴w”是“未知”實(shí)體，該實(shí)體同特異性探針有已知的、特異的互補(bǔ)或反應(yīng)關(guān)系。探針-靶的聯(lián)合體可以被稱作“復(fù)合物”或“配對(duì)物”。
“一級(jí)放大器”(primary amplifier)或“質(zhì)量加強(qiáng)單位”(mass enhancing unit)是“大體積的”(bulky)實(shí)體，它同配對(duì)物或者與所述配對(duì)物鍵合的連接元件之間有相互作用或鍵合?！岸?jí)放大器”(secondary amplifier)同一級(jí)放大器或者一級(jí)放大器-探針-靶配對(duì)復(fù)合物的聯(lián)合體相互作用以形成新的聯(lián)合體?！叭?jí)放大器”是任何連續(xù)的質(zhì)量加強(qiáng)器，它可以同一級(jí)放大器-探針-靶配對(duì)復(fù)合物或者放大器相互作用。
“體積因子(bulk factor)”是放大器和探針-靶配對(duì)物的分子量比值。然而，在加強(qiáng)探針-靶配對(duì)物的識(shí)別時(shí)體積或質(zhì)量并不總是主要參數(shù)。其他參數(shù)，如光學(xué)或電學(xué)性質(zhì)，對(duì)于檢測(cè)裝置來(lái)說(shuō)是重要的。
用探針-靶反應(yīng)來(lái)鑒定“未知的”分析物的研究者，通常依賴于給“靶”化合物加上標(biāo)記或者標(biāo)簽(tag)來(lái)檢測(cè)或用信號(hào)表示探針和靶分子之間的反應(yīng)。傳統(tǒng)的技術(shù)包括使用可以結(jié)合或附著熒光的、放射性的或者“有色的”標(biāo)簽或標(biāo)記的連接化合物。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了檢測(cè)和用信號(hào)顯示這些標(biāo)記的技術(shù)。結(jié)果，這些試驗(yàn)總是需要額外的包括進(jìn)行標(biāo)簽或標(biāo)記的步驟。
在共同受讓人的在先共同待審申請(qǐng)中，已經(jīng)描述了發(fā)生在一個(gè)全內(nèi)反射(total internal reflecting)(TIR)表面的漸逝場(chǎng)(evanescent-field)中的分子反應(yīng)可以用偏振光束和附加的光學(xué)元件檢出，所述元件可以響應(yīng)漸逝場(chǎng)的變化來(lái)提供鑒別性的顯示，光學(xué)檢測(cè)器如CCD照相機(jī)芯片可以識(shí)別這種顯示。其他檢測(cè)裝置包括分光計(jì)、重量分析裝置、尺寸排阻裝置和荷質(zhì)比分離裝置。
在先申請(qǐng)包括2000年7月7日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?9/614,503，2001年4月19日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?9/838,700，2002年12月12日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?0/046,620的申請(qǐng)，其中的描述在此引入作為參考。
在這些申請(qǐng)中，反應(yīng)發(fā)生在全內(nèi)反射(TIR)表面的漸逝場(chǎng)中的表面上。一束偏振光束射向該表面并從那里被完全反射。漸逝場(chǎng)里物質(zhì)的存在改變了反射光束的偏振性質(zhì)。
在反應(yīng)前、反應(yīng)中和反應(yīng)后，將得到的光束對(duì)準(zhǔn)檢測(cè)器，例如CCD芯片/照相機(jī)，該檢測(cè)器可以把整個(gè)感興趣的表面顯現(xiàn)出來(lái)。然后反應(yīng)的區(qū)域就會(huì)提供同非反應(yīng)區(qū)域不同的特征。該特征的特異位置鑒定出產(chǎn)生這種特征的反應(yīng)。
如果試劑、反應(yīng)區(qū)域和非反應(yīng)區(qū)域足夠小以致于需要極度靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)則檢出獨(dú)特的特征就構(gòu)成挑戰(zhàn)。通常，現(xiàn)有的技術(shù)依賴于進(jìn)行標(biāo)簽或標(biāo)記來(lái)鑒定反應(yīng)。在共同轉(zhuǎn)讓給本發(fā)明受讓人的申請(qǐng)中，進(jìn)行標(biāo)記或標(biāo)簽的步驟是不必要的。但是，需要高靈敏度的技術(shù)來(lái)檢測(cè)反應(yīng)和鑒定反應(yīng)物。
發(fā)明概述本發(fā)明用可以是任何反應(yīng)的結(jié)果的復(fù)合產(chǎn)物(如生物活性材料情況下是一種抗體)來(lái)顯示(develop)、加強(qiáng)或“放大”探針-靶反應(yīng)，因此得到的化合物可以用較不靈敏的設(shè)備檢出，或者使靈敏儀器的檢出極限有效降低，來(lái)檢出更少量的靶。
例如，已知“探針”分子對(duì)“靶”分子有排他的或特異的親和力因而形成探針-靶配對(duì)物。進(jìn)一步地，存在有“放大器”分子或化合物，其對(duì)一類探針-靶配對(duì)物或?qū)σ活愄结?靶配對(duì)物的一個(gè)特定子集有特異的吸引力或親和力。
核酸探針可以同互補(bǔ)的RNA或DNA序列反應(yīng)以雜交，形成雙鏈序列。一旦雜交發(fā)生，加入對(duì)雙鏈核酸材料的長(zhǎng)度特異的抗體并溫育。通常，該抗體的分子量和體積是探針和靶的許多倍，得到擴(kuò)大并增強(qiáng)的探針-靶聯(lián)合體，這種聯(lián)合體即使用較不靈敏的光學(xué)或其他系統(tǒng)也更易被檢出。
Carter等的專利號(hào)為4,508,832的專利描述了橢圓偏振測(cè)量術(shù)(ellipsometry)結(jié)合生物測(cè)定方法的使用。正如Carter等描述的，生物測(cè)定或免疫測(cè)定是基于生物活性物質(zhì)(或“抗原”)和與該生物活性物質(zhì)偶聯(lián)的特異復(fù)合物(或“抗體”)的反應(yīng)。相信本發(fā)明對(duì)于進(jìn)行生物測(cè)定或免疫測(cè)定會(huì)非常有用。而且，授予Ipraim等的美國(guó)專利號(hào)6,228,578的專利，在此引入全部?jī)?nèi)容作為參考，描述了使用對(duì)DNA探針/RNA靶的雜合體有特異的親和力的免疫球蛋白來(lái)識(shí)別雜合體。只有通過(guò)進(jìn)一步的加工引起化學(xué)發(fā)光，或者使用同雜合體特異性的免疫球蛋白特異結(jié)合的二級(jí)熒光免疫球蛋白才能檢出探針-靶-放大器。
在本發(fā)明中，通過(guò)質(zhì)量放大提供逐漸增加的靈敏度，在雜交中或雜交后的任何一點(diǎn)可以進(jìn)行檢測(cè)。在用于說(shuō)明本發(fā)明方法的具體實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案中，單鏈DNA(“ssDNA”)是探針?？梢灾苽涓街颂结樉仃?matrix)的表面，每個(gè)具有不同的序列。矩陣中每個(gè)探針元件的x-y位置是已知的。將未知的靶化合物制備為ssDNA，并與探針材料發(fā)生反應(yīng)。如果探針和靶有互補(bǔ)序列，在該位置將會(huì)發(fā)生反應(yīng)，兩條單鏈的DNA樣本將會(huì)雜交成一條雙鏈的DNA(“dsDNA”)鏈。發(fā)生在任何具體x-y位置的反應(yīng)唯一地鑒定試驗(yàn)中的未知物或“靶”。
現(xiàn)在將抗原是dsDNA的一級(jí)放大抗體(primary amplifying antibody)加到矩陣表面。放大抗體是根據(jù)它們對(duì)dsDNA的特異性選擇的，這種特異性由抗體可變區(qū)的結(jié)構(gòu)決定。放大抗體的大小的數(shù)量級(jí)通常要比雜交配對(duì)高。具體種類的所有抗體，即IgA，IgM，IgG等，都有不同的分子結(jié)構(gòu)和質(zhì)量，而且體積都比較大。在發(fā)生雜交的位點(diǎn)，放大抗體將會(huì)同dsDNA結(jié)合。在某些條件下，放大抗體會(huì)以結(jié)合到探針-靶配對(duì)物的抗體為核而聚集或團(tuán)聚，從而得到尺寸和體積巨大的結(jié)構(gòu)?；蛘?，通過(guò)用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶切割可以從免疫球蛋白中分別分離有活性的Fab片段或F(ab’)2片段，提供更小的、空間和動(dòng)力學(xué)上有利的識(shí)別單位。在這種情況下，對(duì)抗體片段的生物素化可以為親和素或含有親和素的大體積化合物提供鍵合。
或者，可以加入對(duì)于一級(jí)放大抗體特異的二級(jí)放大抗體(secondaryamplifying antibody)，它將同一級(jí)抗體結(jié)合，在具體的x-y位置產(chǎn)生更大的對(duì)象，這個(gè)對(duì)象可以用較不靈敏的設(shè)備(如相對(duì)不靈敏的光學(xué)設(shè)備)檢出，并用能顯現(xiàn)整個(gè)矩陣的照相機(jī)輕易識(shí)別。這樣的聚集或團(tuán)聚除其它表面技術(shù)之外可以通過(guò)原子力(atomic force)顯微鏡檢出，這種技術(shù)可以測(cè)定高度外形的改變。
在一個(gè)可選的申請(qǐng)中，非人IgG和人免疫球蛋白是探針-靶配對(duì)物，以此為工具可檢出人血清中的抗體從而測(cè)定一個(gè)人是否曾接觸了具體的抗原。如果使用IgM作為一級(jí)放大抗體，所述IgM對(duì)于非人的抗人免疫球蛋白的復(fù)合物是特異的，或甚至只對(duì)人免疫球蛋白是特異的，那么配對(duì)物的體積就能增加2.5倍。其他的探針-靶配對(duì)物也可以用能夠同那些配對(duì)物一起使用的放大抗體來(lái)鑒定。
在附加的可選實(shí)施方案中，也可以使用其他的帶有或不帶有標(biāo)記的二級(jí)放大抗體，它們同雜交對(duì)或一級(jí)放大抗體反應(yīng)，通過(guò)使用基于質(zhì)量區(qū)分的分離方法的技術(shù)來(lái)提高發(fā)生反應(yīng)的配對(duì)物的可檢測(cè)性。
本發(fā)明可以用于其他感興趣的分析物。在這樣其他的實(shí)施方案中，可以用電鏡或傳統(tǒng)顯微鏡、比色法、重量分析、色譜法和分光術(shù)觀察結(jié)果。如果想使用標(biāo)簽或標(biāo)記，也可以在低得多的靈敏度的水平使用現(xiàn)有的其他技術(shù)。
因此，本發(fā)明的目的是提供更易鑒定的探針-靶聯(lián)合體(combination)，這種聯(lián)合體可以用較不靈敏的技術(shù)來(lái)分析結(jié)果。
本發(fā)明的另一目的是提供更易鑒定的靶-探針聯(lián)合體，這種聯(lián)合體對(duì)于靈敏的檢測(cè)設(shè)備顯示出較低的檢出水平。本發(fā)明的再一個(gè)目的是放大探針-靶相互作用的結(jié)果，允許使用較不靈敏的檢測(cè)方案。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是放大探針-靶相互作用的結(jié)果從而降低檢出的極限。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是使用對(duì)于分子探針-靶復(fù)合物特異的化合物來(lái)“放大”對(duì)探針-靶反應(yīng)的信號(hào)響應(yīng)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是使用二級(jí)放大化合物，其能夠結(jié)合同特異的探針-靶反應(yīng)結(jié)合的一級(jí)放大化合物，或者，理想的是探針-靶-一級(jí)放大器復(fù)合物。
通過(guò)以下描述結(jié)合附圖，其中舉例說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，將可以理解本發(fā)明特有的新特征，包括結(jié)構(gòu)和操作方法，連同更多的目的和優(yōu)點(diǎn)。但是要理解清楚的是，附圖只是用于說(shuō)明和描述的目的，并不用來(lái)限定本發(fā)明的范圍。
附圖簡(jiǎn)述參考以下詳細(xì)描述結(jié)合附圖，會(huì)進(jìn)一步理解本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)，附圖中


圖1為基于放射性或熒光標(biāo)記的現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)方案的圖示。
圖2為根據(jù)本發(fā)明的示例檢測(cè)技術(shù)的圖示。
圖3為將尺寸和不同的階段關(guān)聯(lián)起來(lái)的表，參考根據(jù)本發(fā)明方法和設(shè)備的示例實(shí)施方案可知。
圖4和圖5描述了通過(guò)全內(nèi)反射的光學(xué)觀察結(jié)果，其為根據(jù)本發(fā)明方法和設(shè)備的示例實(shí)施方案的一個(gè)方面。
圖6為將層的厚度與不同的探針-靶配對(duì)物聯(lián)系起來(lái)的表，其為根據(jù)本發(fā)明方法和設(shè)備的示例實(shí)施方案的一個(gè)方面。
圖7為將層的厚度與不同的探針-靶配對(duì)物聯(lián)系起來(lái)的圖，其為根據(jù)本發(fā)明方法和設(shè)備的示例實(shí)施方案的一個(gè)方面。
圖8為使用根據(jù)本發(fā)明方法和設(shè)備的示例方法的總結(jié)表。
優(yōu)選實(shí)施方案圖1顯示了主要的現(xiàn)有技術(shù)的順序，其中靶11同結(jié)合在基底(substrate)15上的探針13雜交，形成探針-靶配對(duì)物17，所述特性將被確定的配對(duì)物是可檢出的。在現(xiàn)有的技術(shù)中通常的做法是加入特異性的接頭19，它可以與有標(biāo)簽或標(biāo)記23的放大器21結(jié)合。標(biāo)簽或標(biāo)記23的存在通常是單獨(dú)的加工步驟的結(jié)果，該步驟可能包括將連接配體加到靶上。然而，是標(biāo)簽或標(biāo)記的存在使得探針-靶配對(duì)物17可以檢出。對(duì)標(biāo)簽或標(biāo)記23靈敏的設(shè)備可以唯一地鑒定靶。
圖2顯示對(duì)于根據(jù)本發(fā)明方法和設(shè)備的示例實(shí)施方案，其中可以是ssDNA片段的探針元件12結(jié)合在基底10上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基底10可以是玻璃載玻片。
繼續(xù)參照?qǐng)D2顯示，在一系列的步驟中，探針ssDNA 12同靶ssDNA 14的聯(lián)合體雜交形成dsDNA對(duì)16。對(duì)于這樣雜交的dsDNA對(duì)16，存在抗體或一級(jí)放大體30。這些一級(jí)放大體30只能同雜交的dsDNA對(duì)16結(jié)合而不是同ssDNA探針12或靶元件14結(jié)合。
這樣在探針-靶配對(duì)物的位點(diǎn)可能聚集或團(tuán)聚相當(dāng)大的結(jié)構(gòu)，使得在矩陣中存在單個(gè)的、獨(dú)特的、大的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)通過(guò)使用較不靈敏的檢測(cè)器，包括但不局限于光學(xué)的、電學(xué)的、拓?fù)涞?、重量分析的或其他的質(zhì)量區(qū)分技術(shù)和其他的技術(shù)，能夠更容易地檢出。
圖3表明了從帶有固定的探針12的基底10開(kāi)始，所得的不同聯(lián)合體的相對(duì)尺寸的漸進(jìn)過(guò)程。如圖所示，探針-靶配對(duì)物16可以以基底10表面上的膜層厚度的納米的分?jǐn)?shù)(fraction)來(lái)測(cè)量。加上一級(jí)放大體30后，刻度(scale)增加到30納米的范圍，該刻度可以用靈敏的系統(tǒng)如原子力顯微鏡，或用共同受讓人共同待審的申請(qǐng)中的技術(shù)檢出。其他”精細(xì)的”檢測(cè)系統(tǒng)，如分光計(jì)或重量分析裝置通過(guò)這些值也能表明探針-靶反應(yīng)的證據(jù)。
本發(fā)明的技術(shù)對(duì)于可鑒定特異性放大器化合物的任何探針-靶配對(duì)物都是有用的。據(jù)信在任何涉及分子級(jí)未知材料或靶的情況下都可以使用本發(fā)明的技術(shù)，該材料或靶可以同具有相當(dāng)尺寸的探針?lè)磻?yīng)。可以鑒定能夠同探針-靶聯(lián)合體結(jié)合的放大材料。
例1寡核苷酸探針和靶；IgM一級(jí)放大體本發(fā)明有用的一個(gè)領(lǐng)域是在醛衍生的玻璃基底上干燥狀態(tài)表面掃描(dry state surface scanning)檢測(cè)寡核苷酸探針-靶配對(duì)物。這個(gè)過(guò)程包括以下步驟用氮?dú)饬髑鍧嵆?Superaldehyde)載玻片(Telechem International)；用Tris-EDTA-NaCl緩沖液(“TE-NaCl緩沖液”)在載玻片表面點(diǎn)上(spot)3’端C6氨基修飾的30聚體(30mer)寡核苷酸作為探針。
將探針在室溫(25℃)，相對(duì)濕度＜30％干燥12個(gè)小時(shí)。
將基底在0.2％SDS(十二烷基硫酸鈉)中劇烈攪動(dòng)兩分鐘以漂洗兩次，以去除未結(jié)合的寡核苷酸(DNA)。
將基底在雙蒸水(ddH2O)中劇烈攪動(dòng)兩分鐘以漂洗一次。
用氮?dú)饬鞲稍锼龌住?br> 將1.5gNaBH4溶解在450ml磷酸鹽緩沖液(PBS)制備新鮮的硼氫化鈉溶液中。加入133ml 10％的乙醇。
將基底用此溶液室溫處理5分鐘以減少游離醛。
在室溫將基底在0.2％SDS中漂洗兩次，每次一分鐘。
在室溫將基底在ddH2O中漂洗一次，時(shí)間一分鐘。
用氮?dú)饬鞲稍锼鲋苽涞幕住?br> 在室溫將基底浸泡在含有互補(bǔ)寡核苷酸靶的TE-NaCl(Tris-EDTA，1MNaCl)緩沖液中12個(gè)小時(shí)。
用氮?dú)饬鞲稍锼鲋苽涞幕住?br> 在室溫將基底浸泡在含有抗dsDNA放大抗體溶液的PBS緩沖液溶液中一個(gè)小時(shí)。
用氮?dú)饬鞲稍锼鲋苽涞幕住?br> 然后可以用原子力顯微鏡“讀出”所述制備的基底，它將檢出雜交對(duì)和與其相關(guān)的放大器。
尺寸從25nm到1000nm的衍生形式的聚苯乙烯微球可以從Bangs實(shí)驗(yàn)室公司(9025 Technology Drive，F(xiàn)ishers，IN46038-2886；www.bangslabs.com)獲取，IgG由客戶提供。IgG通過(guò)Fc部分附著，其可變區(qū)暴露并可以與抗原偶聯(lián)。100nm的球體是優(yōu)選的首選。如果想使用光學(xué)的探測(cè)方法，可以將微球染色以吸收已知波長(zhǎng)的光。可以將微球與作為一級(jí)放大抗體的二級(jí)放大器的羊抗小鼠IgM偶聯(lián)。優(yōu)選方法如下如實(shí)施例1闡明，制備雜交表面并加入IgM。
用PBS稀釋10×貯存液制備稀釋的微球溶液。
將表面用10微升稀釋液溫育30分鐘用PBS漂洗用dH2O漂洗(可選的，如果用干燥讀取的方法)觀察結(jié)果至少10×信號(hào)增強(qiáng)。
如果使用SEQUENCE SEEKERTM商業(yè)化的序列特異性的聚酰胺產(chǎn)品來(lái)結(jié)合雙鏈的探針-靶配對(duì)物，那么優(yōu)選鏈親和素包被的聚苯乙烯微球(視需要為染色的或非染色的)(SEQUENCE SEEKERTM，Prolinx，Inc.，Bothell，WA；www.prolix.com)。
制備雜交的基底將干燥的SEQUENCE SEEKERTM稀釋在質(zhì)量等體積的無(wú)水乙醇中。
將SEQUENCE SEEKERTM用TE緩沖液稀釋到0.1％質(zhì)量/體積。超聲處理有助于溶解。
將表面用10微升該溶液溫育30分鐘。
用TE緩沖液漂洗表面以去除未結(jié)合的SEQUENCE SEEKERTM。
用PBS稀釋10×貯存液制備稀釋的微球溶液。
將表面用10微升的所述稀釋溶液溫育30分鐘。
用TE緩沖液漂洗。
觀察結(jié)果至少10×的信號(hào)增強(qiáng)。
(可選的，如果使用干燥的讀取方法)用dH2O漂洗。
除了使用可以結(jié)合雜交的或dsDNA的抗體，也可以使用商業(yè)化可得到的聚酰胺，它在商業(yè)上被稱作SEQUENCE SEEKER”(Prolinx，Inc.，Bothell，WA；www.prolix.com)，它可以同特異的化合物(如生物素)接合。SEQUENCE SEEKERTM被拉到雜交的DNA鏈旁，并且如果所述序列包括五個(gè)堿基對(duì)的合適序列，聚酰胺就會(huì)結(jié)合到dsDNA的小溝中。
在這個(gè)例子中，序列搜索物(sequence seeker)不是放大器，而是起到“識(shí)別單位”的作用，同負(fù)責(zé)特異性的抗體可變區(qū)中特異的肽結(jié)構(gòu)相似。生物素結(jié)合到序列搜索物上作為與鏈親和素或鏈親和素偶聯(lián)的化合物的連接化合物，所述鏈親和素或鏈親和素偶聯(lián)的化合物可以起到質(zhì)量放大器的作用。優(yōu)選方法如下將干燥的生物素化的SEQUENCE SEEKERTM稀釋在質(zhì)量等體積的無(wú)水乙醇中。
將SEQUENCE SEEKERTM用TE緩沖液稀釋到0.1％質(zhì)量/體積。超聲處理有助于溶解。
將表面用10微升所述溶液溫育30分鐘。
用TE緩沖液漂洗表面以去除未結(jié)合的SEQUENCE SEEKERTM。
如果使用鏈親和素作為放大器用TE緩沖液制備100微摩爾的鏈親和素溶液。
將表面用10μl的所述稀釋液溫育10分鐘。
用TE緩沖液漂洗。
(可選的，如果使用干燥的讀取方法)用dH2O漂洗。
觀察結(jié)果信號(hào)以圖表說(shuō)明的比例增強(qiáng)，或者直到表面飽和。
如果使用鏈親和素偶聯(lián)的微球用PBS稀釋10×的貯存液以制備稀釋的微球(鏈親和素微球，BangsLabs)溶液。
將表面用10微升的所述稀釋液溫育30分鐘。
用TE緩沖液漂洗。
(可選的，如果使用干燥的讀取方法)用dH2O漂洗。
觀察結(jié)果信號(hào)應(yīng)增強(qiáng)50倍，直到所述微球的表面飽和點(diǎn)。
一些一級(jí)放大體30可以結(jié)合或團(tuán)聚到已經(jīng)結(jié)合到探針-靶配對(duì)物上的一級(jí)放大體上。
再次參照?qǐng)D2和圖3，也可見(jiàn)可以同結(jié)合到雜交的探針-靶配對(duì)物16的一級(jí)放大體30結(jié)合的二級(jí)放大體32。于是在探針-靶對(duì)反應(yīng)的位置就可以聚集或團(tuán)聚相當(dāng)大的結(jié)構(gòu)，從而在矩陣中存在單個(gè)的、獨(dú)特的、大的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)通過(guò)使用較不靈敏的檢測(cè)器，包括但不局限于光學(xué)的、電學(xué)的、拓?fù)涞?、重量分析的或其他的質(zhì)量區(qū)分技術(shù)和其他的技術(shù)，能夠更容易地檢出。
二級(jí)放大器32的加入使尺寸增加了大約2.5倍。優(yōu)選方法如下用PBS稀釋10×的抗體貯存液，制備10微升。
將先前制備的探針-靶-IgM基底用所述溶液溫育30分鐘。
用PBS漂洗(可選的，如果使用干燥的讀取方法)用dH2O漂洗。
觀察結(jié)果如果四個(gè)IgG附著于表面上的每個(gè)IgM，信號(hào)幾乎加倍。
鏈親和素是對(duì)生物素有親和力的蛋白質(zhì)(Kassoc＝1015)，一種或多個(gè)分子的鏈親和素可以結(jié)合到SEQUENCE SEEKERTM攜帶的生物素上。鏈親和素本身比dsDNA探針-靶配對(duì)物更大(68千道爾頓)，起到了初步質(zhì)量放大的作用。
以非免疫球蛋白抗原作為靶的例子包括用于證明被加工食品沒(méi)有污染的過(guò)敏原GMOs的蛋白質(zhì)陣列，其對(duì)于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)有重大意義。警察機(jī)關(guān)和國(guó)家安全機(jī)構(gòu)可望用本發(fā)明改進(jìn)檢出爆炸物如TNT的現(xiàn)有的陣列。
優(yōu)選地，探針元件12是其他的、不同探針(或ssDNA片段)的矩陣的一部分。已知的矩陣排列能夠給未知的靶探針或ssDNA提供匹配，其身份要通過(guò)試驗(yàn)鑒定。
這個(gè)示例實(shí)施方案的方法包括上面實(shí)施例1關(guān)于寡探針?biāo)龅牟襟E，除了有許多不同的探針置于多孔板(如396孔板)中。板被置于點(diǎn)樣機(jī)器人(robot)內(nèi)，機(jī)器以軟件和實(shí)驗(yàn)者決定的陣列的模式將寡探針印跡在載玻片上。
如共同受讓人的在先專利申請(qǐng)所述，基底可具有全內(nèi)反射(TIR)，將探針元件置于漸逝場(chǎng)(evanescent field)中。
再次參照?qǐng)D2和3，也可見(jiàn)于二級(jí)放大體32結(jié)合的三級(jí)放大器34，在探針-靶反應(yīng)的位置形成更大的聯(lián)合體，降低了許多檢測(cè)方案中的檢出閾值。
能夠?qū)⑷?jí)放大器34結(jié)合到位點(diǎn)上會(huì)使起始的探針-靶厚度值額外增加20倍大小。二級(jí)和三級(jí)放大體或放大器的加入使“大致(gross)”檢出系統(tǒng)如顯微鏡方法、過(guò)濾或其他的尺寸排阻技術(shù)或任何基于質(zhì)量的分離系統(tǒng)可用。
容易獲取偶聯(lián)到多種材料如聚苯乙烯、聚苯胺或甚至更大的金屬微球上的鏈親和素。除此之外，鏈親和素有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，可以附著生物素化的抗體或生物素化的微球作為二級(jí)放大體，鏈親和素本身也可以作為抗體的特異性靶，所述抗體在那種情況為二級(jí)放大體。
圖5是用納米(nm)表示的相對(duì)高度的條形圖。如圖所見(jiàn)，裸露的醛(aldehyde)載玻片表面高度為2.2nm。在附著了1μM的DNA探針后，高度增加到2.4nm。1μM DNA探針和1μM DNA靶的探針-靶配對(duì)物的高度為3.9nm。加入一級(jí)放大器——0.1μl的抗體后，高度增加到7.2nm。然而，如果加入過(guò)量的抗體作為一級(jí)放大器，高度將增加10倍到72nm。
為了確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，1μM DNA探針和1μl抗體的高度僅為2.3nm，單單抗體在裸露的載玻片上時(shí)的高度僅為2.6nm。這張圖表清楚表明，雜交的探針-靶配對(duì)物在存在足夠的一級(jí)放大材料時(shí)將顯示出容易檢出的顯著高度變化。
表1的圖表(見(jiàn)圖8，第六頁(yè))列出了合適的探針-靶聯(lián)合體和對(duì)每種聯(lián)合體適合的一級(jí)的、二級(jí)的以及某些情況下的三級(jí)放大器。
同樣要說(shuō)明的是，作為替代SEQUENCE SEEKERTM的另一種選擇，通過(guò)已知為“鎖定的核酸”(locked nuleic acid)的一種類型的核酸類似物(“(LNATM”，Proligo LLC，www.proligo.com；subsidiary of Degussa AG，www.degussa.com)，也可以特異性地鑒定特定的雙鏈核酸序列。
圖4顯示了本發(fā)明的示例實(shí)施方案，其中用全內(nèi)反射(TIR)來(lái)觀察放大的結(jié)果。偏振光源裝置112包含光源126、光束形成部分128(如果光源的性質(zhì)使得光束形成有用或必要的話)、偏光器(polarizer)130和光學(xué)擋板(retarder)132。全內(nèi)光反射裝置114有光學(xué)元件134，該元件有光學(xué)表面136。圖4還顯示在光學(xué)表面136上有樣本載玻片138，它們之間存在指數(shù)匹配的物質(zhì)140。因?yàn)橹笖?shù)匹配，全內(nèi)反射表面(TIR表面)被定義為樣本載玻片138的上表面139。樣本142在載玻片138的TIR表面139上。
光學(xué)元件134是在與入射光束120和出射光束122的關(guān)系上沿指數(shù)匹配的載玻片138設(shè)置的棱鏡，這樣，光束只在TIR表面139反射了一次，就射出了棱鏡。如果樣本直接置于光學(xué)表面136上，那么光學(xué)表面136將是TIR表面。但通常不這樣應(yīng)用，因?yàn)橥ǔ颖?如生物芯片)在樣本載玻片138上制備更為方便，然后置于設(shè)備中。
在任何情況下，不管怎樣構(gòu)建，都存在有TIR表面的光學(xué)結(jié)構(gòu)，光束在進(jìn)入和離開(kāi)這個(gè)光學(xué)結(jié)構(gòu)之間僅在TIR表面上反射一次。換句話說(shuō)，存在同樣本有光學(xué)接觸的TIR表面，所以同全內(nèi)反射相關(guān)的漸逝場(chǎng)與樣本相互作用，并在該TIR表面上僅有一次反射。
反射后檢測(cè)器裝置116包含偏光器144和二維陣列檢測(cè)器146，優(yōu)選為CCD型的照相機(jī)。處理器118是特定程序化的計(jì)算機(jī)和輸出工具，用于將圖像處理為在成相的區(qū)域空間地分析(resolve)出的膜層厚度變化的顯示。通過(guò)檢測(cè)全內(nèi)反射引起的光束橫截面中局部偏光狀態(tài)空間分布的變化來(lái)獲取圖像。這為表面上每個(gè)可分析的點(diǎn)提供了關(guān)于基底表面上物質(zhì)陣列的存在和組成的信息。不同的偏光狀態(tài)變化被包括在反射光束的橫截面中，指示樣本上物質(zhì)位于對(duì)應(yīng)于檢測(cè)器中位置的樣本陣列的位置中。處理器118接收作為電信號(hào)124的數(shù)據(jù)，相對(duì)于二維陣列空間地表征偏光狀態(tài)的變化。在處理器118中，一個(gè)實(shí)施方案中的分析和處理是通過(guò)比較從光處理裝置112發(fā)出的入射光的已知偏光狀態(tài)和反射光122的改變了的偏光狀態(tài)完成的，在光束內(nèi)二維地進(jìn)行空間分析，為樣本陣列中的點(diǎn)提供了空間分布點(diǎn)圖。用處理器118分析偏光漂移，提供化學(xué)樣本中元素的存在和性質(zhì)的信息。其他已知的技術(shù)，如零處理(null processing)和階段調(diào)制(phase modulation)可用于測(cè)定偏光狀態(tài)的變化。
可選地，光源余燼126可以是發(fā)光的二極管(LED)，超冷光二極管(superluminescent diode)(SLD)，白熾光源或激光。如果使用LED或SLD，圖4顯示的裝配是適當(dāng)?shù)?，其中光束形成部?28是一個(gè)準(zhǔn)直儀管。如果使用白熾光源，也要使用光學(xué)濾鏡。
在一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)備的光源126是中等帶寬的準(zhǔn)單色光源。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的光源126是中等帶寬的LED。優(yōu)選地，帶寬是范圍在約10-50納米內(nèi)的全寬(full width)半最大波長(zhǎng)，更優(yōu)選地是范圍在約30-50納米內(nèi)的全寬半最大波長(zhǎng)。
參照?qǐng)D4顯示的光學(xué)擋板132，在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，相反光學(xué)擋板還可以置于偏光器144前的出射光路122中。參照?qǐng)D5顯示了可選的實(shí)施方案，當(dāng)光源是激光150，移動(dòng)的擴(kuò)散器152被改裝成可以發(fā)出在由激光導(dǎo)致的斑點(diǎn)模式的(speckle pattern)最大值和最小值的斑點(diǎn)偏置波動(dòng)(speckleoffsetting fluctuation)。移動(dòng)的擴(kuò)散器152附著在機(jī)械激活器(actuator)154上，該激活器優(yōu)選發(fā)動(dòng)機(jī)和伺服設(shè)備，用于提供斑點(diǎn)偏置波動(dòng)。然后光束120通過(guò)光束形成元件128，偏光器130和光學(xué)擋板132，射出光源裝置120。
對(duì)于用電化學(xué)的或介電常數(shù)儀器的檢測(cè)，可以使用偶聯(lián)到識(shí)別單位、一級(jí)放大器或二級(jí)放大器上的金屬毫微球(nanospere)。在一項(xiàng)已開(kāi)發(fā)的方法學(xué)中，鏈親和素偶聯(lián)的金毫微球用膠體銀包被后，用于放大生物素化的生物分子。
如果使用生物素化的DNA、RNA或蛋白質(zhì)靶，用鏈親和素-金毫微顆粒增強(qiáng)，不管用不用膠體銀增強(qiáng)，當(dāng)用橢圓偏光法、反射計(jì)、漸逝技術(shù)、光顯微鏡、高分辨率掃描、掃描型電氣化學(xué)探測(cè)顯微鏡和AFM探測(cè)時(shí)，都會(huì)放大信號(hào)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)具體探針-靶系統(tǒng)調(diào)整的一般程序如下將雜交的陣列與用含有1％BSA的PBS以1∶200到1∶500的比例稀釋的鏈親和素-Nanogold(Nanoprobes，Inc.，Yaphank，NY；www.nanoprobes.com)在室溫溫育60分鐘。
用含有0.1％魚(yú)膠(fish gelatin)和0.1％Tween-20的PBS洗3次，每次5分鐘。
重復(fù)用蒸餾水洗總共至少10分鐘，最后兩次漂洗用超純水(EM-grade)。
制備溶液A和B溶液A將80mg醋酸銀(code 85140；Fluka，Buchs，Switzerland)溶于40mL玻璃雙蒸水中(通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)大約15分鐘可以使醋酸銀晶體溶解)。
溶液B將200mg對(duì)苯二酚溶于40mL檸檬酸鹽緩沖液中。
臨用前混合溶液A和溶液B。
將金-鏈親和素增強(qiáng)的陣列同增強(qiáng)溶液混合30分鐘。
用蒸餾水洗3遍。
用優(yōu)選的檢測(cè)方法探測(cè)陣列。使用密封的流式細(xì)胞儀和適配的檢測(cè)系統(tǒng)，原位的加工和探測(cè)將使雜交和加工中的探測(cè)可行，允許動(dòng)態(tài)測(cè)量，同時(shí)減少操作的人工假象。
這樣，以上已經(jīng)顯示并描述了在相對(duì)較低靈敏度的水平上檢出探針-靶聯(lián)合體的方法和材料。質(zhì)量放大器被加到探針-靶對(duì)上(有或沒(méi)有連接元件)。在沒(méi)有其他的處理步驟時(shí)，質(zhì)量放大器的存在使得探針-靶對(duì)可以被檢出。附加的質(zhì)量放大器，如二級(jí)和三級(jí)放大器，為使用較不靈敏的檢測(cè)設(shè)備和/或較低濃度的靶材料創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。
本領(lǐng)域的專家將會(huì)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的技術(shù)在別的領(lǐng)域的適用性，并將使用這些教導(dǎo)將所述觀念應(yīng)用到別的感興趣的分析物上。因此，本發(fā)明應(yīng)僅受所附帶的權(quán)利要求范圍的限制。
權(quán)利要求
1.一種區(qū)別分子探針的結(jié)合和非結(jié)合分子靶的方法，該方法包含以下步驟提供基底，所述基底形成了表面和鄰近該表面的漸逝光學(xué)場(chǎng)；在所述表面固定分子探針；使所述分子探針暴露于含有所述分子靶的溶液；僅在所述分子靶已經(jīng)結(jié)合到所述分子探針時(shí)選擇性地干擾所述漸逝光學(xué)場(chǎng)；觀察所述漸逝場(chǎng)；將所述漸逝場(chǎng)的干擾和所述分子靶和所述分子探針的結(jié)合關(guān)聯(lián)起來(lái)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底利用全內(nèi)反射來(lái)形成所述漸逝場(chǎng)；所述分子探針包含具有單鏈片段的核酸；所述分子靶包含具有單鏈片段的核酸，所述核酸傾向于同所述分子探針的單鏈片段雜交，從而形成雙鏈片段；并且所述選擇性干擾所述漸逝光學(xué)場(chǎng)的步驟包括使所述表面暴露于含有免疫球蛋白的溶液的步驟，所述免疫球蛋白傾向于選擇性地同所述雙鏈片段結(jié)合。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述選擇性地干擾所述漸逝光學(xué)場(chǎng)的步驟進(jìn)一步包括將所述表面暴露于溶液的步驟，該溶液含有傾向于選擇性地同所述免疫球蛋白結(jié)合的材料。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底利用全內(nèi)反射來(lái)形成所述漸逝場(chǎng)；所述分子探針包含免疫球蛋白；并且所述分子靶包含傾向于同所述免疫球蛋白結(jié)合從而形成復(fù)合物的抗原。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述選擇性干擾所述漸逝光學(xué)場(chǎng)的步驟進(jìn)一步包括將所述表面暴露于溶液的步驟，該溶液含有傾向于選擇性地同所述復(fù)合物結(jié)合的材料。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底利用全內(nèi)反射來(lái)形成所述漸逝場(chǎng)；所述分子探針包含具有單鏈片段的核酸；所述分子靶包含單鏈片段的核酸，所述核酸傾向于同所述分子探針的單鏈片段雜交，從而形成雙鏈片段；并且所述選擇性干擾所述漸逝光學(xué)場(chǎng)的步驟包括使所述表面暴露于含有質(zhì)量放大成分的混合物的步驟，所述質(zhì)量放大成分包含序列特異性的聚酰胺，該聚酰胺傾向于選擇性地同所述雙鏈片段結(jié)合。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述序列特異性聚酰胺結(jié)合在選自如下的成分上生物素、金屬微球、金屬膠體、聚苯乙烯微球、毫微球、親和素、鏈親和素或免疫球蛋白。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述免疫球蛋白是傾向于選擇性地同雙鏈DNA結(jié)合的小鼠IgM。
9.一種區(qū)別分子探針的結(jié)合和非結(jié)合分子靶的方法，該方法包含以下步驟提供基底，所述基底形成了表面；在所述表面固定分子探針；使所述分子探針暴露于含有所述分子靶的溶液；僅在所述分子靶已經(jīng)結(jié)合到所述分子探針時(shí)選擇性地在所述表面上聚集至少一種高分子量成分；檢測(cè)該表面上的高分子量成分；和將檢出所述高分子量成分同所述分子靶和所述分子探針的結(jié)合關(guān)聯(lián)起來(lái)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述包含平面載玻片；所述分子探針包含具有單鏈片段的核酸；所述分子靶包含具有單鏈片段的核酸，所述核酸傾向于同所述分子探針的單鏈片段雜交從而形成雙鏈片段；并且在所述表面上選擇性地聚集至少一種高分子量成分，包含使所述表面暴露于含有傾向于選擇性地同所述雙鏈DNA片段結(jié)合的免疫球蛋白的溶液的步驟。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述選擇性地在所述表面上聚集至少一種高分子量成分的步驟，還包括使所述表面暴露于含有傾向于選擇性地同所述免疫球蛋白結(jié)合的材料的溶液的步驟。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述包含平面載玻片；所述分子探針包含免疫球蛋白；并且所述分子靶包含傾向于同所述免疫球蛋白結(jié)合從而形成復(fù)合物的抗原。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述在所述表面上選擇性地聚集至少一種高分子量成分的步驟，還包括使所述表面暴露于含有傾向于選擇性地同所述復(fù)合物結(jié)合的材料的溶液的步驟。
14.權(quán)利要求9的方法，其中所述包含平面載玻片；所述分子探針包含具有單鏈片段的核酸；所述分子靶包含具有單鏈片段的核酸，所述核酸傾向于同所述分子探針的所述單鏈片段雜交從而形成雙鏈片段；并且所述在所述表面上選擇性地聚集至少一種高分子量成分的步驟，包含使所述表面暴露于含有質(zhì)量放大成分的混合物的步驟，所述質(zhì)量放大成分包含序列特異性的聚酰胺，該聚酰胺傾向于選擇性地同所述雙鏈片段結(jié)合。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述序列特異性聚酰胺結(jié)合到選自如下的成分聚乙二醇、生物素、金屬微球、金屬膠體、聚苯乙烯微球、毫微球、親和素、鏈親和素或免疫球蛋白。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述免疫球蛋白是傾向于選擇性地同雙鏈DNA結(jié)合的小鼠IgM。
17.鑒定樣本中活性物質(zhì)的方法，該方法是通過(guò)一種活性物質(zhì)(靶)同它的特異性結(jié)合配體(探針)的反應(yīng)，該方法包含以下步驟a.將樣本探針材料加到基底上；b.使所述探針材料暴露于靶材料；c.加入質(zhì)量放大器材料，所述材料特異地結(jié)合所述探針和靶材料的聯(lián)合體，從而探針-靶聯(lián)合所得到的產(chǎn)物是所述質(zhì)量放大器材料的結(jié)合位點(diǎn)，所述質(zhì)量放大器材料提供了在探針-靶結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)質(zhì)上更大的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)更易被檢測(cè)裝置識(shí)別。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述探針材料是寡核苷酸，并且所述靶材料是同該探針材料互補(bǔ)的寡核苷酸。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述質(zhì)量放大器材料是抗雙鏈DNA的小鼠IgM。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述質(zhì)量放大器材料是鍵合到微球上的。
21.權(quán)利要求18的方法，包括在所述加入質(zhì)量放大器材料的步驟之前，加入與生物素鍵合的dsDNA序列特異性的小溝結(jié)合分子的附加步驟。
22.權(quán)利要求17的方法，包括將二級(jí)放大器材料加入探針-靶-放大器聯(lián)合體上，以提供更大的聯(lián)合體的附加步驟。
23.權(quán)利要求19的方法，包括加入抗小鼠IgM的山羊IgG作為二級(jí)放大器材料的附加步驟。
24.權(quán)利要求21的方法，包括加入鏈親和素作為質(zhì)量放大器材料的附加步驟。
25.權(quán)利要求17的方法，其中所述探針材料是非人的IgG，所述靶材料是人的IgG，并且所述質(zhì)量放大器材料是非人的抗人IgG的IgG。
26.權(quán)利要求17的方法，其中所述探針材料是非人的IgG，所述靶材料是人的IgG，并且所述質(zhì)量放大器材料是非人的抗人IgG的IgM。
27.鑒定生物活性物質(zhì)(抗原)的生物測(cè)定方法，其包含以下步驟a.將所述生物活性物質(zhì)(抗原)的探針(抗體)固定到基底上；b.將所述生物活性物質(zhì)(抗原)加入到該基底上所述探針(抗體)的位置上，以形成所述抗原和所述抗體的反應(yīng)復(fù)合物；和c.加入放大復(fù)合物(初級(jí)放大抗體)，該放大復(fù)合物的質(zhì)量和體積實(shí)質(zhì)上比所述生物活性物質(zhì)(抗原)或所述探針(抗體)都大，并且該放大復(fù)合物對(duì)該抗原和抗體的反應(yīng)復(fù)合物有親和力；從而該生物活性物質(zhì)和探針的反應(yīng)復(fù)合物為所述放大復(fù)合物提供了結(jié)合位點(diǎn)，以形成實(shí)質(zhì)上質(zhì)量和體積都比所述反應(yīng)復(fù)合物大的聚集結(jié)構(gòu)。
28.權(quán)利要求27的方法，還包括加入二級(jí)放大復(fù)合物(二級(jí)放大抗體)的步驟，該二級(jí)放大復(fù)合物的質(zhì)量和體積實(shí)質(zhì)上比所述生物活性物質(zhì)(抗原)或所述放大復(fù)合物(初級(jí)放大抗體)都大；所述二級(jí)放大復(fù)合物(二級(jí)放大抗體)結(jié)合到所述反應(yīng)的聯(lián)合體和所述復(fù)合物(初級(jí)放大抗體)上以進(jìn)一步增加在反應(yīng)復(fù)合物位置的質(zhì)量和體積。
29.鑒定未知靶材料的設(shè)備，包含a.有第一表面的載體；b.多個(gè)探針，其中每個(gè)對(duì)排列在可鑒定子集內(nèi)的具體靶材料具有特異性；c.一定量的質(zhì)量增強(qiáng)放大器材料，以在探針-靶相互作用位點(diǎn)形成探針-靶-質(zhì)量增強(qiáng)放大器的復(fù)合物，從而在具體探針位點(diǎn)存在探針-靶相互作用可以指示靶材料的性質(zhì)。
30.鑒定未知靶材料的設(shè)備，其包含以下材料的組合a.有平的表面的載體；b.固定在所述表面上的探針陣列，每個(gè)所述探針同不同的靶都顯示出已知的反應(yīng)；c.質(zhì)量增強(qiáng)放大器材料，所述材料對(duì)所述探針和各自對(duì)應(yīng)的靶的聯(lián)合體有已知的獨(dú)特的吸引，從而與所述探針陣列之一反應(yīng)的未知靶材料結(jié)合到所述質(zhì)量增強(qiáng)放大器材料上，以在反應(yīng)位點(diǎn)產(chǎn)生易區(qū)分的質(zhì)量增加的反應(yīng)產(chǎn)物，因而通過(guò)所述陣列內(nèi)反應(yīng)位點(diǎn)的定位來(lái)唯一地鑒定所述未知靶材料。
31.權(quán)利要求30的設(shè)備，其中所述載體是玻璃載玻片。
32.權(quán)利要求30的設(shè)備，還包括光學(xué)讀數(shù)器，該讀數(shù)器包括有第一折射指數(shù)并從其表面形成全內(nèi)反射的透明工具，其中所述載體具有同所述全內(nèi)反射表面并列的第二表面。
33.權(quán)利要求30的設(shè)備，其中所述載體具有被選擇來(lái)同所述光學(xué)讀數(shù)器折射指數(shù)相同的折射指數(shù)。
34.權(quán)利要求30的設(shè)備，其中所述探針選自包括如下的一類物質(zhì)寡核苷酸、單鏈DNA(ssDNA)、非人的IgG、聚合物、DNA-RNA雜合體、鎖定的核酸、多糖或蛋白質(zhì)；其中所述靶選自一類對(duì)所述探針有獨(dú)特親和力的材料；其中所述質(zhì)量增強(qiáng)質(zhì)量放大器材料選自一類對(duì)探針-靶聯(lián)合體有獨(dú)特親和力的材料，包括抗雙鏈DNA的小鼠IgM、與微球偶聯(lián)的抗雙鏈DNA的小鼠IgM、與生物素偶聯(lián)的序列搜索物聚酰胺、與聚乙二醇偶聯(lián)的序列搜索物、與抗雙鏈DNA小鼠IgM偶聯(lián)的序列搜索物聚酰胺、與微球偶聯(lián)的序列搜索物聚酰胺、抗DNA-RNA雜合體的小鼠IgG、抗人IgG的非人IgG和非人的抗人IgG、IgGM，在每種情況下探針和靶的聯(lián)合都能夠產(chǎn)生探針-靶配對(duì)物，所述配對(duì)物對(duì)選自所述種類的質(zhì)量增強(qiáng)放大器材料有獨(dú)特吸引。
35.鑒定未知靶材料的方法，其包含以下步驟a.固定探針陣列，每個(gè)探針對(duì)不同的靶材料具有特異性；b.將未知靶材料應(yīng)用到所述陣列以形成至少一個(gè)探針-靶配對(duì)物；c.加入適合同任何已形成的探針-靶配對(duì)物結(jié)合的質(zhì)量增強(qiáng)放大器材料；從而形成的任何探針-靶配對(duì)物通過(guò)與只附著到所述探針-靶配對(duì)物的質(zhì)量增強(qiáng)放大器材料的聯(lián)合而更易于檢出。
36.權(quán)利要求35的方法，還包括施加二級(jí)質(zhì)量增強(qiáng)放大器材料的步驟，所述二級(jí)質(zhì)量增加放大器材料適合鍵合到已形成的探針-靶配對(duì)物，所述配對(duì)物已經(jīng)附著了質(zhì)量增加放大器材料以提供更易于被檢測(cè)裝置鑒別的明顯更大的探針-靶位點(diǎn)。
37.鑒定生物活性物質(zhì)(抗體)的生物測(cè)定方法，其包含以下步驟a.將所述生物活性物質(zhì)(抗體)的探針(抗原)固定到基底上；b.將所述生物活性物質(zhì)(抗體)施加到基底上所述探針(抗原)所在的位置，以形成所述抗原和所述抗體的反應(yīng)復(fù)合物；c.加入放大復(fù)合物(初級(jí)放大抗原)，所述復(fù)合物的質(zhì)量和體積實(shí)質(zhì)上比所述生物活性物質(zhì)(抗體)或所述探針(抗原)都大，所述放大復(fù)合物同所述抗原和所述抗體的所述反應(yīng)復(fù)合物有親和力；從而所述生物活性物質(zhì)和所述探針的反應(yīng)復(fù)合物為所述放大復(fù)合物提供了結(jié)合位點(diǎn)，以提供質(zhì)量和體積實(shí)質(zhì)上比所述反應(yīng)復(fù)合物大的聚集結(jié)構(gòu)。
38.權(quán)利要求37的方法，還包括加入二級(jí)放大復(fù)合物(二級(jí)放大抗原)的步驟，該復(fù)合物的質(zhì)量和體積實(shí)質(zhì)上比所述生物活性物質(zhì)(抗體)或所述放大復(fù)合物(一級(jí)放大抗原)都大；所述二級(jí)放大復(fù)合物(二級(jí)放大抗原)結(jié)合到所述反應(yīng)的聯(lián)合體和所述復(fù)合物(一級(jí)放大抗原)上以進(jìn)一步增加所述反應(yīng)復(fù)合物位點(diǎn)的質(zhì)量和體積。
39.權(quán)利要求22的方法，包括加入對(duì)二級(jí)放大器材料特異的免疫球蛋白作為三級(jí)放大器材料的附加步驟。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述三級(jí)放大器材料包括IgM。
41.權(quán)利要求24的方法，包括加入對(duì)鏈親和素有親和力的分子作為三級(jí)放大器材料的附加步驟。
42.一種設(shè)備，其包含a.具有第一表面的載玻片；b.固定在所述表面上的DNA片段(寡聚體)陣列；c.與所述寡聚體偶聯(lián)以在那里形成雙鏈雜交復(fù)合物的匹配的DNA片段；d.附著到所述雜交復(fù)合物的IgM分子。
43.權(quán)利要求42的設(shè)備，其中所述IgM分子是熒光標(biāo)記的分子。
44.權(quán)利要求42的設(shè)備，其中所述IgM分子是磁標(biāo)記的分子。
45.權(quán)利要求42的設(shè)備，其中所述IgM分子是顏色標(biāo)記的分子。
46.權(quán)利要求42的設(shè)備，其中所述IgM分子標(biāo)記了高電滲分子。
47.權(quán)利要求42的設(shè)備，其中所述陣列包括子陣列，每個(gè)所述子陣列上固定了不同的DNA寡聚體，與至少一個(gè)所述子陣列的寡聚體偶聯(lián)以在那里形成雙鏈雜交復(fù)合物的不同的DNA匹配片段，所述設(shè)備也包括只與至少一個(gè)所述子陣列的雜交復(fù)合物附著的IgM分子。
48.權(quán)利要求43的設(shè)備，其中所述陣列包括子陣列，每個(gè)所述子陣列上固定了不同的DNA寡聚體，與至少一個(gè)所述子陣列的寡聚體偶聯(lián)以在那里形成雙鏈雜交復(fù)合物的不同的DNA匹配片段，所述設(shè)備也包括只與至少一個(gè)所述子陣列的雜交復(fù)合物附著的IgM分子。
49.權(quán)利要求44的設(shè)備，其中所述陣列包括子陣列，每個(gè)所述子陣列上都固定了不同的DNA寡聚體，與至少一個(gè)所述子陣列的寡聚體偶聯(lián)以形成雙鏈雜交復(fù)合物的不同的DNA匹配片段，所述設(shè)備也包括只與至少一個(gè)所述子陣列的雜交復(fù)合物附著的IgM分子。
50.權(quán)利要求45的設(shè)備，其中所述陣列包括子陣列，每個(gè)所述子陣列上固定了不同的DNA寡聚體，與至少一個(gè)所述子陣列的寡聚體偶聯(lián)以形成雙鏈雜交復(fù)合物的不同的DNA匹配片段，所述設(shè)備也包括只與至少一個(gè)所述子陣列的雜交復(fù)合物附著的IgM分子。
51.權(quán)利要求46的設(shè)備，其中所述陣列包括子陣列，每個(gè)所述子陣列上固定了不同的DNA寡聚體，與至少一個(gè)所述子陣列的寡聚體偶聯(lián)以形成雙鏈雜交復(fù)合物的不同的DNA匹配片段，所述設(shè)備也包括只與至少一個(gè)所述子陣列的雜交復(fù)合物附著的IgM分子。
52.鑒定樣本中活性物質(zhì)的方法，該方法是通過(guò)所述活性物質(zhì)(靶)同其特異性的結(jié)合配偶體(探針)的反應(yīng)，其中所述探針是DNA片段(寡聚體)，所述靶是能夠和所述探針形成雜交(雙鏈)復(fù)合物的匹配的DNA片段，所述方法包含以下步驟a.將DNA片段(探針)固定在載體上；b.使所述的探針暴露于應(yīng)用的靶以形成雜交復(fù)合物；和c.加入依其具有僅附著到雜交復(fù)合物的能力而被選擇的IgM分子。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述IgM是熒光標(biāo)記的。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述IgM是磁標(biāo)記的分子。
55.權(quán)利要求52的方法，其中所述IgM是顏色標(biāo)記的分子。
56.權(quán)利要求52的方法，其中所述IgM標(biāo)記了高電滲分子。
57.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針包含鎖定的核酸。
58.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底利用全內(nèi)反射來(lái)形成所述漸逝場(chǎng)；所述分子探針包含具有單鏈片段的核酸；所述分子靶包含具有單鏈片段的核酸，所述核酸傾向于同所述分子探針的單鏈片段雜交從而形成雙鏈片段；并且所述選擇性干擾該漸逝光學(xué)場(chǎng)的步驟包括使所述表面暴露于含有傾向于選擇性地同所述雙鏈片段結(jié)合的分子的溶液的步驟。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述傾向于選擇性地同所述雙鏈片段結(jié)合的分子包含選自下列的分子dsDNA特異的IgG，dsDNA特異的Fab片段，dsDNA特異的F(ab’)2片段，DNA-RNA雜合體特異的IgG，DNA-RNA雜合體特異的Fab片段，DNA-RNA雜合體特異的F(ab’)2片段，DNA-LNA雜合體特異的IgG，DNA-LNA雜合體特異的Fab片段，DNA-LNA雜合體特異的F(ab’)2片段，dsDNA特異的IgM四聚物，dsDNA特異的IgM單體，dsDNA特異的IgM Fab片段，或dsDNA特異的IgM F(ab’)2片段。
60.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底利用全內(nèi)反射來(lái)形成所述漸逝場(chǎng)；所述分子探針包含多糖；和所述分子靶包含傾向于同該分子探針結(jié)合從而形成復(fù)合物的免疫球蛋白。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述選擇性地干擾所述漸逝光學(xué)場(chǎng)的步驟還包括使所述表面暴露于含有傾向于選擇性地同所述復(fù)合物結(jié)合的材料的溶液的步驟。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)提供增強(qiáng)質(zhì)量和/或干擾漸逝場(chǎng)的放大器元件來(lái)更容易地識(shí)別探針－靶的反應(yīng)，該元件與探針－靶的配對(duì)物特異性地反應(yīng)并結(jié)合來(lái)使質(zhì)量增加。當(dāng)所述探針－靶配對(duì)物是雜交的dsDNA時(shí)，適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量增強(qiáng)放大器是抗雙鏈DNA的小鼠IgM。在足夠的序列對(duì)存在于探針－靶結(jié)合的例子中，可使用攜帶生物素的序列特異性結(jié)合小溝的聚酰胺，其能通過(guò)鏈親合素在合適的載體中被放大。優(yōu)選實(shí)施方案中，多個(gè)探針被固定在微陣列的多個(gè)位點(diǎn)，其中每個(gè)探針對(duì)不同的靶均是特異的。本發(fā)明描述了使用全內(nèi)反射的光學(xué)來(lái)觀察漸逝場(chǎng)干擾。
文檔編號(hào)G01N33/00GK1823085SQ03826863
公開(kāi)日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2003年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月28日
發(fā)明者威廉姆·拉斯曼, 戴維·拉林, 周飛夢(mèng), 韓書(shū)博 申請(qǐng)人:專家技術(shù)公司