專(zhuān)利名稱(chēng)：胞內(nèi)勞森氏菌培養(yǎng)、抗該菌的疫苗和診斷試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗胞內(nèi)勞森氏菌(Lawsonia.intracellularis)疫苗以及防治和診斷LI感染的方法。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法部分是由我們發(fā)現(xiàn)的大規(guī)模培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌的改良方法所導(dǎo)致的結(jié)果。
背景技術(shù)：
胞內(nèi)勞森氏菌是豬增殖性腸病(porcine proliferative enteropathy，PPE)的致病原，它影響幾乎所有動(dòng)物，包括人、兔、白鼬、倉(cāng)鼠、狐貍、馬和其他各種不同動(dòng)物如鴕鳥(niǎo)和美洲鴕等。
胞內(nèi)勞森氏菌是豬群中造成損失的特別重要的原因。在美國(guó)對(duì)PPE的發(fā)生率和感染率的估計(jì)是，高達(dá)20％的豬群被感染并且每年損失$2000萬(wàn)。
PPE的一個(gè)固定特征是在被感染的腸部分的腸細(xì)胞中存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的、非膜結(jié)合的彎曲桿菌。與PPE相關(guān)的細(xì)菌已被稱(chēng)為“彎曲桿菌樣生物(Campylobacter-likeorgansims)”S.McOrist et al.，Vet.Pathol.，Vol.26，260-64(1989)。隨后，致病細(xì)菌被鑒別為一種新的分類(lèi)屬和種，在本國(guó)語(yǔ)中被稱(chēng)為“Ilealsymbiont(IS)intracellularis”(胞內(nèi)回腸共生生物，ISi)。C.Gebhart et al.，Int’l.J.of Systemic Bacteriology，Vol.43，No.3，533-38(1993)。最近，這些新細(xì)菌被賦予分類(lèi)名Lawsonia(L.)intracellularis。S.McOrist et al.，Int’lJ.ofSystemic Bateriology，Vol.45，No.4，820-25(1995)。這3種名稱(chēng)可互換使用，都指此處描述和進(jìn)一步鑒別的相同生物體。我們盡量在本發(fā)明的論述中使用分類(lèi)名胞內(nèi)勞森氏菌(L.intracellularis)。
胞內(nèi)勞森氏菌是一種專(zhuān)性的、細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，它不能在常規(guī)的無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基中用通常的細(xì)菌學(xué)方法培養(yǎng)，而且一直認(rèn)為需要附著在上皮細(xì)胞才能生長(zhǎng)。S.McOrist etal.在Infection and Immunity，Vol.61，No.10，4286-92(1993)和G.Lawson et al.在J.of Clinical Microbiology，Vol.31，No 5，1136-42(1993)中論述，用IEC-18大鼠的腸上皮細(xì)胞單層在常規(guī)組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌。此外，H.Stills在Infection and Immunity，Vol.59，No.9，3227-36(1991)中論述，在常規(guī)組織培養(yǎng)瓶中使用腸407人胚胎腸細(xì)胞單層和GPC-16豚鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞單層。這些已有的培養(yǎng)方法費(fèi)力而且不適合大規(guī)模培養(yǎng)。
由于在體外培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌需要苛刻的生長(zhǎng)條件，所以目前對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌感染的認(rèn)識(shí)以及對(duì)該疾病的治療和有效控制都受到阻礙。因此目前需要一種改良的培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌的方法。還需要抗胞內(nèi)勞森氏菌疫苗和診斷胞內(nèi)勞森氏菌感染的有效工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抗胞內(nèi)勞森氏菌疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供在生物樣品中檢測(cè)抗胞內(nèi)勞森氏菌抗體存在與否的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種改良的培養(yǎng)方法，它能大規(guī)模地培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌以用于生產(chǎn)疫苗和診斷試劑。
為了實(shí)現(xiàn)這些和其他目的，以及與本文廣泛描述和體現(xiàn)的本發(fā)明意圖相一致，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌的方法并用該方法得到大量的細(xì)菌原料。根據(jù)該方法，胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌在氧濃度為約0-18％下孵育，同時(shí)攪拌細(xì)菌以培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌并維持細(xì)菌懸浮。
根據(jù)另一例子，提供了一種培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌的方法，即通過(guò)用含胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌的接種物接種HEp-2、McCoys或IEC-18細(xì)胞單層(其匯合度約為30％)，使細(xì)菌感染細(xì)胞。接著感染的細(xì)胞在約36-38℃溫度，氧濃度為約0-8.0％下孵育，直至細(xì)胞得到匯合。然后將感染細(xì)胞和生長(zhǎng)培養(yǎng)基置于發(fā)酵器、生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)瓶(spinner flask)或其他適合維持細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)的容器中。感染細(xì)胞在孵育時(shí)應(yīng)攪拌細(xì)胞，以便培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌并維持感染的細(xì)胞懸浮。一部分培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌再傳代至新鮮的培養(yǎng)細(xì)胞以增加胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌的產(chǎn)量。
本發(fā)明提供抗胞內(nèi)勞森氏菌疫苗和產(chǎn)生針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的疫苗的方法。通過(guò)將培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌傳代足夠多次數(shù)并選擇減毒菌株，或者通過(guò)將培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行化學(xué)減毒，從而產(chǎn)生無(wú)毒力的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌。用本發(fā)明的培養(yǎng)方法還可制備滅活的胞內(nèi)勞森氏菌疫苗。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例，細(xì)菌被連續(xù)培養(yǎng)至少6-8月，同時(shí)被傳代至少約7-12次以產(chǎn)生可用作疫苗的減毒菌株。然后將減毒細(xì)菌與藥學(xué)上可接受的載體混合，并以有效量施用給動(dòng)物以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。我們已經(jīng)將目前的優(yōu)選減毒菌株(N343NP40wk)保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)基保藏中心(ATCC)。
本發(fā)明還提供了一種確定在生物樣品中是否存在與胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌特異性反應(yīng)的抗體的方法，即通過(guò)收獲至少一部分培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌，用收獲的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌或其組份與來(lái)自動(dòng)物的生物樣品在生物樣品中存在的抗體會(huì)與胞內(nèi)勞森氏菌或組份反應(yīng)的條件下進(jìn)行接觸，以及確定是否發(fā)生抗體-抗原反應(yīng)。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中給出，它們?cè)诿枋鲋泻苊黠@或者可以通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而領(lǐng)悟。
具體實(shí)施例方式
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“胞內(nèi)勞森氏菌”指由C.Gebhart et al.，Int’l.J.of SystemicBacteriology，Vol.43，No.3，533-38(1993)和S.McOrist et al.，Int’l J.of SystemicBateriology，Vol.45，No.4，820-25(1995)(這兩篇文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容在此引用作為參考)詳細(xì)描述的細(xì)胞內(nèi)的、彎曲的、革蘭氏陰性細(xì)菌，它包括但并不限于在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)保藏的ATCC55672細(xì)菌；在國(guó)立典型培養(yǎng)物保藏中心(NCTC，Colindale，London)保藏的NCTC12656和12657細(xì)菌；依據(jù)本領(lǐng)域的知識(shí)和此處的講授內(nèi)容，可以從世界范圍內(nèi)被PPE感染的豬或其他動(dòng)物中獲得的致病細(xì)菌；以及任一上述細(xì)菌的自發(fā)的或人工誘變的突變體或變異體。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“減毒菌株”指任何這樣的胞內(nèi)勞森氏菌菌株，它通過(guò)此處所講授的培養(yǎng)和傳代技術(shù)而制備從而使其達(dá)到無(wú)毒力，同時(shí)當(dāng)其施用給宿主動(dòng)物時(shí)又維持其免疫原性特征。如下所述，根據(jù)本發(fā)明，各種不同的胞內(nèi)勞森氏菌菌株被培養(yǎng)和減毒，從而獲得了減毒免疫原性菌株。這些減毒菌株可有效地作為豬或其他易患胞內(nèi)勞森氏菌感染的動(dòng)物的疫苗。
本發(fā)明的減毒菌株預(yù)期可作為動(dòng)物的抗微生物疫苗中的免疫原，這些動(dòng)物包括鳥(niǎo)、魚(yú)、牛、豬、馬、哺乳動(dòng)物和普通的靈長(zhǎng)動(dòng)物以及人。在獲得此處講授的內(nèi)容后，這些疫苗可用本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行制備。這種疫苗可含有免疫有效量的減毒菌株和藥學(xué)上可接受的載體。疫苗可以單劑量或多劑量地進(jìn)行施用。在此處講授內(nèi)容的基礎(chǔ)上，免疫有效量可用本領(lǐng)域已知的方法加以確定而不必進(jìn)行過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。無(wú)毒力的細(xì)菌的數(shù)量應(yīng)足以在易患病的動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答同時(shí)仍然是無(wú)毒力的。這取決于特定的動(dòng)物、細(xì)菌和所涉及的疾病。施用于易感動(dòng)物的建議劑量?jī)?yōu)選為約103-109細(xì)菌/千克體重，最佳為約105-107細(xì)菌/千克體重。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且包括穩(wěn)定劑和稀釋劑。這種疫苗還可以含有適當(dāng)?shù)淖魟?。本發(fā)明的疫苗可與其他疫苗例如另一種凍干疫苗的稀釋液組合使用，或者在凍干之前與其他疫苗組合。疫苗制劑還可進(jìn)行干燥，例如凍干，以便于儲(chǔ)藏或?yàn)榱艘院笈渲瞥梢簯B(tài)疫苗。
因此，本發(fā)明還包括一種在動(dòng)物宿主中誘導(dǎo)針對(duì)毒性的、野生型胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌的免疫應(yīng)答從而保護(hù)該宿主免受該細(xì)菌侵害的方法。這種方法包括向宿主施用免疫有效量的本發(fā)明的減毒細(xì)菌或殺死的細(xì)菌，較佳地是向宿主施用本發(fā)明的疫苗。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“大規(guī)模培養(yǎng)”指胞內(nèi)勞森氏菌的培養(yǎng)水平大于約2.0-3.0升而且包括產(chǎn)量規(guī)模大于100升或更大。如本文所用，“培養(yǎng)”指促進(jìn)胞內(nèi)勞森氏菌的生長(zhǎng)、再生和/或增殖的過(guò)程。
在實(shí)施本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)細(xì)胞首先用含胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌的接種物進(jìn)行接種以使細(xì)菌感染細(xì)胞。多種細(xì)胞系可用于實(shí)施本發(fā)明，其中包括但并不限于IEC-18(ATCC1589)-鼠腸上皮細(xì)胞、HEp-2(ATCC23)-人表皮樣瘤細(xì)胞、McCoys(ATCC1696)-鼠(非特異的)細(xì)胞、MDCK(ATCC34)-Madin-Darby狗腎細(xì)胞、BGMK(Biowhittaker#71-176)-布法羅綠猴腎細(xì)胞和豬腸上皮細(xì)胞。優(yōu)選的培養(yǎng)細(xì)胞是HEp-2、McCoys或IEC-18細(xì)胞。或者，細(xì)菌可以在無(wú)細(xì)胞的系統(tǒng)中培養(yǎng)，只要細(xì)菌被維持在此處所教授的合適的溶解氧濃度下。
如果使用培養(yǎng)細(xì)胞，那么在接種之前細(xì)胞最好(但不一定)處于單層形式。為了形成單層，可將細(xì)胞接種于常規(guī)的瓶中。每個(gè)瓶一般的接種量為約1×105-10×105細(xì)胞/25平方厘米瓶，并與生長(zhǎng)培養(yǎng)基混合。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是任何用于細(xì)胞培養(yǎng)的介質(zhì)，它含有氮源、選定的培養(yǎng)細(xì)胞所需的生長(zhǎng)因子和碳源如葡萄糖或乳糖。優(yōu)選的培養(yǎng)基是添加2-5％胎牛血清的DMEM，盡管也可使用各種其他市售的培養(yǎng)基并獲得良好的結(jié)果。
我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將培養(yǎng)細(xì)胞維持在穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)下，可以更好地成功培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌。因此，在接種時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞單層應(yīng)約有20-50％匯合度。更佳地，在接種時(shí)細(xì)胞匯合度應(yīng)為約30-40％，最佳匯合度為約30％。
接種物可以是純胞內(nèi)勞森氏菌培養(yǎng)物，例如從ATCC保藏號(hào)55672、NCTC保藏號(hào)12656或12657、或從感染的豬或其他動(dòng)物身上用此處所述的分離和純化技術(shù)而獲得的純培養(yǎng)物。
根據(jù)一個(gè)例子，用于實(shí)施本發(fā)明的接種物是通過(guò)刮下感染PPE的豬或其他動(dòng)物的回腸粘膜而制備的腸道組織勻漿。制備腸道組織勻漿時(shí)，選擇用于培養(yǎng)的回腸部分應(yīng)顯示出嚴(yán)重的損傷并帶有明顯的增厚。由于細(xì)菌天性脆弱，所以在尸體解剖后最好應(yīng)盡快將樣品保藏在-70℃下。最好在接種物中加入胞內(nèi)勞森氏菌已產(chǎn)生抗性的抗生素以抑制污染細(xì)菌同時(shí)又可允許胞內(nèi)勞森氏菌的生長(zhǎng)，為了例舉，此類(lèi)抗生素有萬(wàn)古霉素、兩性霉素B或氨基糖苷類(lèi)抗生素成員如慶大霉素和新霉素。無(wú)論接種物是純培養(yǎng)物還是腸道組織勻漿，給出此處的講授內(nèi)容后，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞接種可用本領(lǐng)域中的各種技術(shù)進(jìn)行。
然后，細(xì)菌和/或接種的培養(yǎng)細(xì)胞在減少溶解氧濃度條件下進(jìn)行孵育。當(dāng)溶解氧濃度大于18％時(shí)，胞內(nèi)勞森氏菌生長(zhǎng)比最佳情況低并且在氧濃度超出該范圍下最終停止生長(zhǎng)。較佳地，接種的培養(yǎng)細(xì)胞在溶解氧濃度為約0-10％下進(jìn)行孵育。更佳地，細(xì)胞在在溶解氧濃度為約0-8％下孵育，最佳地，氧濃度為約0-3.0％。
二氧化碳的適當(dāng)濃度對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的合適生長(zhǎng)也是至關(guān)重要的。當(dāng)二氧化碳的濃度大于10％或小于4％時(shí)，發(fā)生的是非最佳生長(zhǎng)并且在二氧化碳超出該范圍情況下最終生長(zhǎng)停止。較佳地，二氧化碳的濃度為約6-9％，最佳地，二氧化碳的濃度為約8.8％。
此外，細(xì)胞優(yōu)選在氫氣濃度為約73-94％下孵育。可使用氮?dú)庖蕴鎿Q部分或全部氫氣。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的例子，細(xì)胞在約0-8.0％氧氣、約8.8％二氧化碳和約83.2％氫氣下孵育。
接種細(xì)胞可在雙氣體孵育器(incubator)或其他含有適當(dāng)濃度氧氣和二氧化碳并允許細(xì)胞在孵育過(guò)程中懸浮的氣體腔中進(jìn)行孵育。該腔應(yīng)含有將接種細(xì)胞維持在懸浮狀態(tài)的裝置、氣體監(jiān)視器以及提供并維持適當(dāng)氣體濃度的供應(yīng)源。孵育溫度應(yīng)為30-45℃，較佳為36-38℃。最佳地，溫度為約37℃。在給出此處的講授內(nèi)容后，本發(fā)明的培養(yǎng)和減毒方法所需的設(shè)備對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員而言是可輕易獲得的。適于實(shí)施本發(fā)明的設(shè)備的一個(gè)例子是雙氣體孵育器，例如可從Lab-Line，MelrosePark，Illinois獲得的480型，并與旋轉(zhuǎn)瓶結(jié)合以維持細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)。目前優(yōu)選的設(shè)備包括發(fā)酵器、生物反應(yīng)器或旋轉(zhuǎn)搖床，它們含有至少約2升培養(yǎng)基并且能通過(guò)噴入適當(dāng)濃度的氣體或通過(guò)其它機(jī)械攪拌手段將培養(yǎng)細(xì)胞維持于懸浮狀態(tài)，并且能夠連續(xù)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中溶解氧的水平。New Brunswick，Braun和其他公司制造用于該目的的合適發(fā)酵器和生物反應(yīng)器。
通過(guò)在孵育過(guò)程中將接種細(xì)胞維持于懸浮狀態(tài)，就可以通過(guò)增加每個(gè)細(xì)胞暴露于生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及氧氣和二氧化碳混合物的程度，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)勞森氏菌的最大生長(zhǎng)?？梢杂帽绢I(lǐng)域中的各種方法攪拌培養(yǎng)細(xì)胞并維持于懸浮狀態(tài)，其中包括例如，培養(yǎng)瓶、滾動(dòng)瓶(roller bottle)、膜培養(yǎng)器或旋轉(zhuǎn)瓶。通過(guò)在雙氣體孵育器或類(lèi)似設(shè)備內(nèi)旋轉(zhuǎn)瓶中孵育細(xì)胞，可以使細(xì)胞在孵育過(guò)程中保持懸浮狀態(tài)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“旋轉(zhuǎn)瓶”指這樣的瓶子或其他容器，它們采用槳、螺旋槳或其他裝置來(lái)攪拌培養(yǎng)物并將所含的細(xì)胞維持于懸浮狀態(tài)。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的例子中，孵育接種細(xì)胞直至細(xì)胞達(dá)到匯合，然后將細(xì)胞置于含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)瓶中并在雙氣體孵育器中孵育同時(shí)使旋轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)。較佳地，將接種細(xì)胞刮入旋轉(zhuǎn)瓶中。這可以用本領(lǐng)域中已知的各種方法實(shí)現(xiàn)，例如使用細(xì)胞刮削器來(lái)解離細(xì)胞。一旦細(xì)胞被引入旋轉(zhuǎn)瓶，旋轉(zhuǎn)瓶的槳典型地以約30-60rpm的速度機(jī)械旋轉(zhuǎn)，將感染細(xì)胞維持于懸浮狀態(tài)。
一部分培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌接著被傳代至新鮮的培養(yǎng)細(xì)胞，以增加胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌的產(chǎn)量。術(shù)語(yǔ)“傳代”或類(lèi)似詞語(yǔ)指將一部分培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)細(xì)胞以便用該細(xì)菌感染新鮮細(xì)胞的過(guò)程。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“新鮮”指沒(méi)有被胞內(nèi)勞森氏菌感染的細(xì)胞。較佳地，這種細(xì)胞是平均不超過(guò)約1天的細(xì)胞。
在懸浮培養(yǎng)物中胞內(nèi)勞森氏菌的傳代，可以通過(guò)取出一部分原始培養(yǎng)物并將其加入至含新鮮培養(yǎng)細(xì)胞的新瓶中而實(shí)現(xiàn)。如果原始培養(yǎng)物的細(xì)菌數(shù)目/毫升值較高，例如大于約104細(xì)菌/毫升，則優(yōu)選將被感染的瓶子中約1-10％(體積比)的培養(yǎng)物加入新的含新鮮細(xì)胞的瓶子中。最好在50-100％細(xì)胞被感染時(shí)進(jìn)行該操作。如果被感染的細(xì)胞低于50％，則最好通過(guò)將培養(yǎng)物一分為二加入新瓶，然后添加新培養(yǎng)基至所需體積刻度而實(shí)現(xiàn)傳代。在任何情況下，都不需要細(xì)胞裂解和其他步驟，這與已有技術(shù)中單細(xì)胞層培養(yǎng)物的傳代正好相反。
在培養(yǎng)細(xì)胞充分生長(zhǎng)和隨后用胞內(nèi)勞森氏菌以大于約70％細(xì)胞感染率感染(用IFA、TCID50或其他類(lèi)似方法測(cè)定)之后，收獲至少一部分培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌。在給出此處的講授內(nèi)容后，可以用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的各種技術(shù)，通過(guò)從懸浮液中分離細(xì)菌而進(jìn)行收獲步驟。較佳地，胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌的收獲是通過(guò)離心全部或部分懸浮液所含物質(zhì)，使培養(yǎng)細(xì)胞沉淀，然后再懸浮形成的細(xì)胞沉淀，再裂解感染細(xì)胞。典型地，將至少一部分內(nèi)含物在約3000×g下離心約20分鐘，使細(xì)胞和細(xì)菌形成沉淀。沉淀再懸浮于例如蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通過(guò)25規(guī)格(gauge)的針頭約4次以使細(xì)胞裂解。如果還需要進(jìn)一步純化，樣品可在約145×g下離心約5分鐘，以除去細(xì)胞核和碎片。上清液在約3000×g下離心約20分鐘，形成的沉淀物再懸浮于合適的稀釋劑中，如含胎牛血清的SPG(以制備適于冷藏或用作接種劑的收獲細(xì)菌)或生長(zhǎng)培養(yǎng)基(以制備更適合傳代至新鮮細(xì)胞的收獲細(xì)菌)。
如上所述，用于大規(guī)模生產(chǎn)的胞內(nèi)勞森氏菌的有效生長(zhǎng)可以通過(guò)使組織細(xì)胞活躍地生長(zhǎng)而提高。對(duì)于單層，當(dāng)培養(yǎng)物匯合時(shí)，細(xì)胞分裂的速度顯著下降。使胞內(nèi)勞森氏菌在單層組織培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的嘗試只能獲得有限的成功，而且不可能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。然而，用懸浮培養(yǎng)可大大便于使細(xì)胞活躍地生長(zhǎng)，并允許連續(xù)的培養(yǎng)物的增加和規(guī)模擴(kuò)大。用發(fā)酵器和上述的約0-3％溶解氧，我們已經(jīng)可以使其生長(zhǎng)至108細(xì)菌/毫升。我們還已經(jīng)使培養(yǎng)的細(xì)菌活躍地生長(zhǎng)許多月并且預(yù)期可以無(wú)限制地繼續(xù)下去。
在本發(fā)明之前，普遍認(rèn)為細(xì)胞必須附著于表面才能被胞內(nèi)勞森氏菌感染。本發(fā)明的細(xì)胞懸浮液是獨(dú)特的，并與該理論相反。在使用McCoys或IEC-18細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選與生長(zhǎng)培養(yǎng)基一起添加明膠、瓊脂糖、膠原蛋白、丙烯酰胺或二氧化硅珠例如HyCloneLaboratories(Logan，UT)制造的Cultisphere-G(培養(yǎng)球-G)多孔微載體(microcarries)。然而，根據(jù)本發(fā)明方法，HEp-2細(xì)胞和其他細(xì)胞不需要微載體。這對(duì)于大規(guī)模培養(yǎng)提供了特別有利和經(jīng)濟(jì)的途徑。
對(duì)于HEp-2培養(yǎng)，為了維持培養(yǎng)的目的，最好每周取出25-50％培養(yǎng)物并以新鮮培養(yǎng)基替換。對(duì)于帶微載體或珠的細(xì)胞培養(yǎng)，優(yōu)選每周1-2次取出25-50％培養(yǎng)物并以新鮮微載體或珠和新鮮培養(yǎng)基替換。為了擴(kuò)大規(guī)模，可向培養(yǎng)物中再加入25-50％培養(yǎng)基或帶微載體的培養(yǎng)基。
依據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞被感染的速度，通常每隔約2-5周進(jìn)行一次向新鮮細(xì)胞的傳代。假設(shè)在2-3周內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞中至少70％被感染，那么優(yōu)選在約3-4周進(jìn)行傳代。
本發(fā)明還提供了抗胞內(nèi)勞森氏菌的疫苗和生產(chǎn)該疫苗的方法。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的例子，在長(zhǎng)時(shí)間(例如6-8個(gè)月)維持感染細(xì)胞于懸浮狀態(tài)后，至少一部分培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌被收獲并監(jiān)測(cè)潛在的減毒效果。這種監(jiān)測(cè)優(yōu)選通過(guò)宿主動(dòng)物或動(dòng)物模型的免疫激發(fā)而完成，以選擇減毒菌株。這種減毒菌株可用于此處所述方法中的疫苗。本發(fā)明的減毒的胞內(nèi)勞森氏菌疫苗已經(jīng)顯示出可在各種動(dòng)物中有效地抗胞內(nèi)勞森氏菌感染，并且預(yù)期在人中也是有效的。
本發(fā)明允許快速地培養(yǎng)擴(kuò)增，如產(chǎn)量增加100-1000倍，并且降低了成本。結(jié)果，用本發(fā)明培養(yǎng)方法產(chǎn)生的充足的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌原料可輕易地被減毒以用于疫苗生產(chǎn)。在單層培養(yǎng)物中進(jìn)行減毒是困難的，因?yàn)橛脗鹘y(tǒng)的單層生長(zhǎng)技術(shù)產(chǎn)生的細(xì)菌產(chǎn)量低。相反，本發(fā)明的胞內(nèi)勞森氏菌生長(zhǎng)方法提高了簡(jiǎn)易度、速度和用于減毒的細(xì)菌數(shù)目。細(xì)胞及細(xì)胞分裂得越多，發(fā)生的突變水平越高，這對(duì)疫苗開(kāi)發(fā)是有利的。在本發(fā)明的懸浮液中進(jìn)行生長(zhǎng)增加了受環(huán)境調(diào)控的基因控制的重要免疫原的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物。
得到的減毒菌株可在如下面實(shí)施例1中所述的組織培養(yǎng)單層中培養(yǎng)，但是優(yōu)選在本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)物中進(jìn)行培養(yǎng)。其他的減毒方法包括化學(xué)減毒例如通過(guò)使用N-甲基亞硝基胍以及其他本領(lǐng)域中已知的減毒物質(zhì)進(jìn)行減毒。無(wú)論是通過(guò)多次傳代或用化學(xué)方法，都可產(chǎn)生減毒胞內(nèi)勞森氏菌并加以選擇以制備疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)疫苗例子，通過(guò)上述的離心或微過(guò)濾收獲抗原。然后根據(jù)最佳宿主動(dòng)物免疫應(yīng)答，通過(guò)在宿主動(dòng)物物種中的劑量效價(jià)而確定一水平，并在該限定的水平上對(duì)抗原進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。細(xì)菌可以通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間例如一周暴露于環(huán)境氧氣濃度，或者通過(guò)用0.3％福爾馬林或其他失活劑而使其失活以制備殺死的疫苗。然后，將抗原摻入合適的佐劑例如氫氧化鋁或礦物油中以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。接著，通過(guò)肌內(nèi)或皮下注射，將抗原用于免疫宿主，對(duì)于約3-4周的小豬，如果需要可用加強(qiáng)劑量。
或者，根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的、使用上述培養(yǎng)方法的疫苗例子，細(xì)菌被連續(xù)地傳代以誘導(dǎo)和選擇減毒的、無(wú)毒力的活培養(yǎng)物。在宿主動(dòng)物中測(cè)試該培養(yǎng)物(最好在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)至少6-8月之后)的減毒情況。如前所述收集培養(yǎng)物并稀釋。例如，豬可用口服1×105-1×106細(xì)菌而進(jìn)行免疫。在免疫28天后，豬再用1×107個(gè)傳代次數(shù)較少(約30至40天)、有毒力的胞內(nèi)勞森氏菌培養(yǎng)物口服接種。感染動(dòng)物在免疫激發(fā)后21天進(jìn)行尸體解剖，在小腸觀察到大的損傷和微小的損傷。還應(yīng)進(jìn)行PCR和熒光抗體(FA)分析。約80％對(duì)照動(dòng)物有大或微小的損傷，并且用PCR或FA測(cè)試方法顯示，在腸的粘膜細(xì)胞中胞內(nèi)勞森氏菌的存在呈陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果。免疫的動(dòng)物通過(guò)組織學(xué)觀察確定具有正常的粘膜表面，而且在PCR測(cè)試中呈陰性。
一般，減毒的免疫原性胞內(nèi)勞森氏菌菌株是通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)至少約150-250天且其間培養(yǎng)物傳代至少約7-12次而產(chǎn)生的。也可改變這些參數(shù)而產(chǎn)生其他的減毒培養(yǎng)物，只要采用此處所述的監(jiān)測(cè)和選擇方法。
然后制備疫苗，它含有免疫有效量的減毒胞內(nèi)勞森氏菌和藥學(xué)上可接受的載體。合并后的免疫原和載體可以是水溶液、乳化劑和懸浮液。在給出此處的講授內(nèi)容后，免疫有效量可以用本領(lǐng)域的已知方法確定而不需要過(guò)多的試驗(yàn)。一般，免疫原的數(shù)量為50-500微克，而且當(dāng)使用純化細(xì)菌時(shí)為107-109TCID50。
本發(fā)明的疫苗一般單劑量或多劑量地施用給易患動(dòng)物(較佳為豬)。按2周間隔，可施用活的或滅活的疫苗1或2次。對(duì)于減毒的活疫苗，優(yōu)選單劑量?；畹臏p毒菌株的優(yōu)選給藥途徑是口服或鼻內(nèi)給藥，但也可以通過(guò)肌內(nèi)或皮下注射。對(duì)于滅活疫苗，肌內(nèi)和皮下注射途徑是最佳的。
PPE的有效診斷也被培養(yǎng)致病細(xì)菌所需的時(shí)間所阻礙。作為本發(fā)明的結(jié)果，現(xiàn)在可以開(kāi)發(fā)出快速和準(zhǔn)確地分析來(lái)自豬或其他可能患PPE的動(dòng)物的生物樣品中是否存在胞內(nèi)勞森氏菌的診斷工具。
根據(jù)本發(fā)明方法生長(zhǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌或來(lái)自該細(xì)菌的組份，可在ELISA或其他免疫分析如免疫熒光抗體試驗(yàn)(immunofluorescent antibody，IFA)中用作抗原，以檢測(cè)在可能被該細(xì)菌感染的動(dòng)物的血清或其他體液中的抗胞內(nèi)勞森氏菌的抗體。目前優(yōu)選的免疫分析是在下面實(shí)施例中描述的IFA?；蛘撸帽景l(fā)明方法生長(zhǎng)的細(xì)菌被用于Western Blot分析。
根據(jù)本發(fā)明例子的優(yōu)選的ELISA方案如下1.加入0.1毫升/孔稀釋于包被緩沖液中的抗原。在4℃孵育18小時(shí)。
2.用PBS洗滌3次。
3.向板上每孔加入0.25毫升封閉(blocking)緩沖液。在37℃孵育1-2小時(shí)。
4.用洗滌緩沖液洗滌3次。
5.在封閉緩沖液中稀釋血清，并向板的第一排孔中加入0.1毫升。在板上進(jìn)行一系列1∶2的稀釋。在37℃孵育1小時(shí)。
6.用洗滌緩沖液洗滌3-5次。
7.在封閉緩沖液中稀釋共軛物，向板的各孔中加入0.1毫升。在37℃孵育1小時(shí)。
8.用洗滌緩沖液洗滌3-5次。
9.加入底物。
12.用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度。
13.沒(méi)有加入抗原的孔用作空白對(duì)照。
14.在每次試驗(yàn)中都應(yīng)使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
優(yōu)選的Western印跡方案如下1.在12％SDS-PAGE對(duì)抗原進(jìn)行電泳，然后將其轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。
2.將膜置于封閉緩沖液中2小時(shí)。
3.去除封閉劑并用PBS漂洗1分鐘。
4.在封閉緩沖液中稀釋血清，并加入膜。在室溫下孵育2小時(shí)。
5.用洗滌緩沖液洗滌3次(每次5分鐘)。
6.在封閉緩沖液中稀釋共軛物，并加至膜上。在室溫下孵育1小時(shí)。
7.用洗滌緩沖液洗滌3次。
8.加入底物10分鐘直至發(fā)生強(qiáng)結(jié)合。
9.用PBS漂洗。
10.空氣中干燥并儲(chǔ)藏在黑暗中。
本發(fā)明還結(jié)合下列實(shí)施例進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例的提供只用于闡述目的，不能理解為起限制作用。
實(shí)施例1從患豬增殖性腸病的美國(guó)豬的腸道中分離胞內(nèi)勞森氏菌材料和方法接種樣品的選擇在衣阿華州的一個(gè)農(nóng)場(chǎng)的獸群中獲得樣品N24912，在300只5個(gè)月育肥豬(finisher pig)中觀察到有15只一直有血便，盡管用青霉素進(jìn)行了治療。對(duì)豬進(jìn)行尸體解剖后，發(fā)現(xiàn)腸(回腸)有厚粘膜。用銀染進(jìn)行組織病理學(xué)檢查顯示，存在彎曲的、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和隱窩(crypt)腸上皮細(xì)胞增生，從而證實(shí)PPE的診斷。樣品N72994是從明尼蘇達(dá)州的一個(gè)農(nóng)場(chǎng)上的1.5歲的二胎SPF母豬中獲得的。獸群大小為70-80只母豬，而所用的抗生素治療未知。尸體解剖發(fā)現(xiàn)，回腸粘膜增厚并有些出血。對(duì)粘膜進(jìn)行Giminez染色顯示，存在許多彎曲細(xì)菌。樣品N1014 94是從印第安那州一個(gè)農(nóng)場(chǎng)(具600犁農(nóng)地飼養(yǎng)母豬)的年齡為12周的豬中獲得。該豬在發(fā)生血痢疾后用Tylan注射物進(jìn)行治療，但是在治療后不久該動(dòng)物就死亡。
制備來(lái)自豬的接種物腸樣品在-70℃保藏。剖開(kāi)腸，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。將1克粘膜刮入谷氨酸鈉鉀(sodium potassium glutamate，SPG)中，然后用4.0毫升0.1％Trypsin(JRHBioscience s，Lenexa，KS)在SPG中均化30秒。懸浮液在37℃孵育35分鐘。加入10毫升SPG/10％胎牛血清(FCS)(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，然后在組織研磨器上研磨1分鐘。加入10毫升SPG/10％FCS，然后用過(guò)濾紙(Whatman 113V；WhatmanLabsales，Hillsboro，OR)過(guò)濾一次，隨后在5.0、1.0和0.65微米過(guò)濾膜上過(guò)濾。將濾液分成數(shù)份，按1.0毫升一份儲(chǔ)藏于-70℃。將粘膜涂于載玻片上以便Giminez染色。濾液的各涂片通過(guò)IFA法，用抗胞內(nèi)勞森氏菌的特異性單克隆抗體(S.McOristet al.，Vet.Rec.121421-422，該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容在此引用作為參考)進(jìn)行染色。
細(xì)胞培養(yǎng)在含L-谷氨酰胺和10％FCS的DMEM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)中使IEC-18(鼠腸上皮細(xì)胞，ATCC CRL 1589)生長(zhǎng)，并每周用胰蛋白酶進(jìn)行常規(guī)傳代。細(xì)胞單層在37℃于含5％二氧化碳的空氣中生長(zhǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)物的感染IEC-18細(xì)胞以1.25×105細(xì)胞接種于25cm2的瓶中，并以可比和比率接種于腔玻片(chamberslide)(Nunc，Inc.，Naperville，Il)，孵育24小時(shí)，然后移去培養(yǎng)基?？焖偃诨鶅龅膩?lái)自豬的細(xì)菌分離物，并在含萬(wàn)古霉素(100μg/ml)和兩性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/7％FCS中稀釋?zhuān)♂尡壤秊?.0毫升組織勻漿對(duì)15毫升培養(yǎng)基，然后加至單層。單層和細(xì)菌懸浮液在2000g離心30分鐘，轉(zhuǎn)移至厭氧罐中。排空罐，空氣被氫氣和二氧化碳替換從而得到8.0％氧氣、10％二氧化碳和82％氫氣構(gòu)成的混合物。培養(yǎng)物在37℃孵育3小時(shí)，然后再供給含L-谷氨酰胺、萬(wàn)古霉素(100μg/ml)、新霉素(50μg/L)和兩性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/7％FCS。培養(yǎng)物再放回厭氧罐中，孵育6天，每2天換一次培養(yǎng)基。
胞內(nèi)勞森氏菌的傳代按以前G.Lawson et al.在J.Clin.Microbiol.，311136-1142(1993)(該文獻(xiàn)全部?jī)?nèi)容引用作為參考)中所述的方法，用氯化鉀裂解細(xì)胞而使胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌傳代，然后將其加至新鮮的IEC-18單層。將培養(yǎng)基從單層上傾倒掉，加入0.1％氯化鉀，然后細(xì)胞在37℃孵育10分鐘。移去氯化鉀，加入SPG/10％，然后用細(xì)胞刮削器將單層解離下來(lái)。通過(guò)帶21規(guī)格(gauge)針頭的注射器3次使細(xì)胞裂解。在100×g離心5分鐘而除去細(xì)胞核，將上清液中的細(xì)菌懸浮液加至新鮮的1天IEC-18細(xì)胞單層。
監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物的感染用冷丙酮/甲醇將細(xì)胞固定于腔玻片上5分鐘，監(jiān)測(cè)感染。用免疫熒光和免疫過(guò)氧化物酶方法進(jìn)行染色。兩種方法都采用鼠單克隆抗體(如S.McOrist et al.在Vet.Rec.121421422(1987)中所述)作為第一抗體，以及抗-鼠免疫球蛋白G-熒光團(tuán)共軛物(異硫氰酸氟化熒光素；Organon Teknika Corporation，Durham，NC)或過(guò)氧化物共軛物(羊抗-鼠免疫球蛋白G；Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)。通過(guò)對(duì)每個(gè)玻片上細(xì)胞中被特異性染色的細(xì)菌數(shù)目的計(jì)數(shù)，完成對(duì)細(xì)菌的定量分析。
聚合酶鏈反應(yīng)將樣品接種物和傳代細(xì)菌合并作為模板DNA，用于使用PCR，其中所用的樣品制備方法、引物和循環(huán)參數(shù)如Jones et al.在J.Clin.Microbiol.，312611-2615(1993)和McOrist etal.在Vet.Microbiol.1-8(1994)中所述(這兩篇文獻(xiàn)內(nèi)容全部引用作為參考)。循環(huán)參數(shù)中第一個(gè)循環(huán)為93℃，5分鐘；55℃，45秒；和72℃45秒。33個(gè)循環(huán)是在上述各溫度下各進(jìn)行45秒，以及一個(gè)如下循環(huán)93℃，45秒；55℃，45秒；和72℃2分鐘。陽(yáng)性接種物僅用于接種IEC-18細(xì)胞。也進(jìn)行PCR監(jiān)測(cè)傳代物質(zhì)以證實(shí)感染。用PCR產(chǎn)生的DNA被送至Iowa S tate University Nucleic AcidFacility進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與Gary F.Jones得到的、在其博士論文(Universityof Minnesota，Minneapolis，MN(1993年6月))中報(bào)道的序列進(jìn)行比較。
結(jié)果選擇接種物樣品豬編號(hào)N24912和N72994患嚴(yán)重的PPE，并有帶血的腸內(nèi)含物和增厚的粘膜。N101494患嚴(yán)重的PPE和嚴(yán)重的腹瀉，導(dǎo)致在腸內(nèi)腔中形成大血塊。對(duì)粘膜涂片的Giminez的染色顯示有大量的彎曲或S形的細(xì)菌。IFA染色揭示，在來(lái)自豬的接種物中存在大量發(fā)出強(qiáng)熒光的細(xì)菌。
監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物的感染在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)光學(xué)顯微鏡監(jiān)測(cè)被接種的單層，并觀察到細(xì)胞形態(tài)的稍許變化。在較低氧濃度(8％O2)下生長(zhǎng)的未感染單層具有類(lèi)似的形態(tài)。
被免疫熒光和免疫過(guò)氧化物酶染色的感染培養(yǎng)物顯示，在細(xì)胞中明顯有大量彎曲或S形的細(xì)菌。單層沒(méi)有匯合感染。感染細(xì)胞常常緊密相連，中心為1-10個(gè)細(xì)胞。還看到，重感染的細(xì)胞(即帶30個(gè)或更多的細(xì)菌)也與帶菌數(shù)小于30的細(xì)胞相連。細(xì)菌數(shù)目在6天左右達(dá)到峰值。感染取決于特定的生長(zhǎng)條件。細(xì)菌通過(guò)此處所述的裂解程序成功地進(jìn)行傳代。對(duì)新接種細(xì)胞進(jìn)行離心并不需要，但是這樣做可增加感染細(xì)胞的數(shù)目。離心還可減少污染的可能性，即將暴露于在無(wú)抗生素培養(yǎng)基中進(jìn)行感染的細(xì)胞再放入含抗生素的培養(yǎng)基中3小時(shí)。為了降低IEC-18細(xì)胞的生長(zhǎng)速度從而使細(xì)菌在單層匯合之前能繁殖到更高數(shù)目，將培養(yǎng)基中的FCS濃度從10％降至7％是必要的。
聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)染色體DNA進(jìn)行PCR，對(duì)所有分離物都產(chǎn)生一個(gè)319bp的片段(包括引物)。將大小合適的片段通過(guò)肉眼與已知的McOrist等人(1994)用PCR產(chǎn)生的陽(yáng)性樣品進(jìn)行比較。對(duì)N24912、N72994和N101494的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，證實(shí)與Jones(1993)測(cè)得的p78序列有密切的同源性(97-99％)。
實(shí)施例2胞內(nèi)勞森氏菌在HEp-2細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)制備用于接種的腸組織勻漿通過(guò)從實(shí)施例1的腸樣品中的6.0-8.0厘米的回腸上刮下粘膜而制備腸組織勻漿。向刮下的粘膜加入胰蛋白酶(1％)，樣品簡(jiǎn)短地進(jìn)行均化，然后在37℃孵育35分鐘。再加入10毫升SPG/10％FBS，樣品在組織研磨器中研磨。再加入10毫升SPG/10％FBS。勻漿用Whatman113V過(guò)濾紙過(guò)濾，隨后在5.0、1.0和0.65微米過(guò)濾膜上過(guò)濾。將濾液分成每份1.0毫升，儲(chǔ)藏于-70℃。
細(xì)胞培養(yǎng)物的感染方法A組織細(xì)胞以1×107細(xì)胞接種于含50毫升DMEM/10％FBS的100毫升旋轉(zhuǎn)瓶中。培養(yǎng)物孵育24小時(shí)，然后加入萬(wàn)古霉素和兩性霉素B。將一瓶冷凍的腸勻漿快速融化，在3.0毫升DMEM/5％FBS(含萬(wàn)古霉素(100μg/ml)和兩性霉素B(2.0μg/ml))中稀釋。樣品通過(guò)0.65μm過(guò)濾器，然后加入瓶中。將培養(yǎng)物置于空氣罐中，排空，再充入氫氣和二氧化碳得到由8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氫氣構(gòu)成的混合物。培養(yǎng)物在37℃孵育3小時(shí)，然后再加入新霉素和慶大霉素。接著再在24小時(shí)內(nèi)供給培養(yǎng)物含L-谷氨酰胺、萬(wàn)古霉素(100μg/ml)、新霉素(50μg/L)、慶大霉素(50μg/L)和兩性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS。
方法B將HEp-2細(xì)胞以1.25×105細(xì)胞接種于含DMEM/10％FBS的25cm2常規(guī)瓶中，孵育18-24小時(shí)。接種時(shí)細(xì)胞匯合度為30％。接種物在DMEM/5％FBS中稀釋。當(dāng)接種物來(lái)自腸勻漿時(shí)，培養(yǎng)基也含有萬(wàn)古霉素(100μg/ml)和兩性霉素B(2.0μg/ml)。將培養(yǎng)物置于空氣罐中，排空，再充入氫氣和二氧化碳得到由8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氫氣構(gòu)成的混合物。培養(yǎng)物在37℃孵育3小時(shí)，然后再加入新霉素和慶大霉素。接著再在24小時(shí)內(nèi)供給培養(yǎng)物含L-谷氨酰胺、萬(wàn)古霉素(100μg/ml)、新霉素(50μg/L)、慶大霉素(50μg/L)和兩性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS。當(dāng)接種物是純培養(yǎng)物時(shí)不需要抗生素。培養(yǎng)物孵育6天或直至匯合。從瓶上刮下細(xì)胞并加至含50毫升DMEM/10％FBS的100毫升旋轉(zhuǎn)瓶中。
培養(yǎng)物每周按1∶2比例進(jìn)行稀釋?zhuān)@可通過(guò)收集一半培養(yǎng)物并加入新鮮培養(yǎng)基，或者通過(guò)將培養(yǎng)物移至更大的旋轉(zhuǎn)瓶然后加入更多培養(yǎng)基。
培養(yǎng)物的傳代將新鮮HEp-2細(xì)胞按1×107細(xì)胞接種于DMEM/5％FBS，從而將培養(yǎng)物傳代至新鮮HEp-2細(xì)胞。新培養(yǎng)物在8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氫氣中孵育過(guò)夜。新培養(yǎng)物然后用感染培養(yǎng)物接種并在上述的較低氧濃度下孵育。接種物的數(shù)量取決于原始培養(yǎng)物的感染程度。
培養(yǎng)物的收獲和儲(chǔ)藏收集所需數(shù)量的培養(yǎng)物，在3000×g上離心20分鐘，從而收獲培養(yǎng)物。將沉淀再懸浮于蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通過(guò)25規(guī)格(gauge)的針頭4次。將培養(yǎng)物分成若干份，在-70℃冷凍。對(duì)于進(jìn)一步純化，樣品可在145×g下離心約5分鐘以除去細(xì)胞核和碎片。上清液在3000×g下離心20分鐘，沉淀物再懸浮于稀釋劑中。
對(duì)組織培養(yǎng)中活胞內(nèi)勞森氏菌的估計(jì)對(duì)活胞內(nèi)勞森氏菌的定量是通過(guò)確定組織培養(yǎng)感染劑量(50％)(TissueCultureInfectious Dose 50 percent，TCID50)而完成的。做法是取出2.0毫升待測(cè)試的培養(yǎng)物，通過(guò)25規(guī)格(gauge)的針頭4次使細(xì)胞裂解。樣品在含萬(wàn)古霉素(100μg/ml)和兩性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS中進(jìn)行一系列1∶10的稀釋。將稀釋液按每孔0.1毫升加至96孔微量滴定板。用HEp-2細(xì)胞按1250細(xì)胞/孔接種于微量滴定板，并且在感染前生長(zhǎng)18-24小時(shí)。每個(gè)稀釋濃度使用3-6孔。板在8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氫氣中孵育6天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定細(xì)胞2分鐘。向各孔中加入0.03毫升/孔抗-IS intrace llularis單克隆抗體(McOrist，1994)，該抗體已按1∶2000稀釋于PBS中。板在37℃孵育30分鐘，然后用PBS洗滌3次。按0.03毫升/孔加入已1∶30稀釋的抗-鼠FITC，在37℃孵育30分鐘。板用雙蒸水洗滌3次，讓其干燥。用熒光顯微鏡觀察樣品，確定TCID50/ml。
結(jié)果TCID50結(jié)果顯示，培養(yǎng)物可含有高達(dá)1×106細(xì)菌/毫升。這是在45天內(nèi)實(shí)現(xiàn)的。在同樣時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)體積被擴(kuò)大至3.0升。
實(shí)施例3胞內(nèi)勞森氏菌在McCoys細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)制備用于接種的腸組織勻漿按實(shí)施例2所述方法，制備腸組織勻漿。用下面實(shí)施例方法培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌樣品按照布達(dá)佩斯條約，于1995年5月19日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland U.S.A 20852)，保藏號(hào)為55672。
細(xì)胞培養(yǎng)物的感染將McCoys細(xì)胞以1.25×105細(xì)胞接種于兩個(gè)含DMEM/10％FBS的25cm2常規(guī)瓶中，孵育18-24小時(shí)。細(xì)胞在接種時(shí)達(dá)到30％匯合度。接種物在DMEM/5％FBS中稀釋。當(dāng)接種物來(lái)自腸勻漿時(shí)，培養(yǎng)基也含有萬(wàn)古霉素(100μg/ml)和兩性霉素B(2.0μg/ml)。將培養(yǎng)物置于空氣罐中，排空，再充入氫氣和二氧化碳得到由8.0％氧氣、10％二氧化碳和82％氫氣構(gòu)成的混合物。培養(yǎng)物在37℃孵育3小時(shí)，然后再加入新霉素和慶大霉素。接著再在24小時(shí)內(nèi)將含L-谷氨酰胺、萬(wàn)古霉素(100μg/ml)、新霉素(50μg/L)、慶大霉素(50μg/L)和兩性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS供給培養(yǎng)物。當(dāng)接種物是純培養(yǎng)物時(shí)不需要抗生素。培養(yǎng)物孵育6天直至匯合。從瓶上刮下細(xì)胞并加至含50毫升DMEM/2％FBS和0.05克Cultisphere-G微載體的100毫升旋轉(zhuǎn)瓶中。按40-50rpm攪拌瓶。
培養(yǎng)物每隔2-3天按1∶2比例進(jìn)行稀釋?zhuān)@可通過(guò)收集一半培養(yǎng)物并加入新鮮培養(yǎng)基和Cultisphere-G珠，或者通過(guò)將培養(yǎng)物移至更大的旋轉(zhuǎn)瓶然后加入更多培養(yǎng)基和Cultisphere-G珠。培養(yǎng)物中珠的最終濃度約0.001克珠/毫升。
培養(yǎng)物的傳代將新鮮McCoys細(xì)胞按1×107細(xì)胞接種于DMEM/5％FBS和0.05克Cultisphere-G珠中，從而將培養(yǎng)物傳代至新鮮McCoys細(xì)胞。新培養(yǎng)物在8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氫氣中孵育過(guò)夜。新培養(yǎng)物然后用25毫升感染培養(yǎng)物接種，并在上述的較低氧濃度下孵育。
培養(yǎng)物的收獲和儲(chǔ)藏收集所需數(shù)量的培養(yǎng)物，在3000×g上離心20分鐘，從而收獲培養(yǎng)物。將沉淀再懸浮于SPG中，然后通過(guò)22規(guī)格的針頭4次。將培養(yǎng)物分成若干份，在-70℃冷凍。對(duì)于進(jìn)一步純化，樣品可在145×g下離心約5分鐘以除去珠、細(xì)胞核和碎片。上清液在3000×g下離心20分鐘，沉淀物再懸浮于稀釋劑中。
對(duì)組織培養(yǎng)中活胞內(nèi)勞森氏菌的估計(jì)對(duì)活胞內(nèi)勞森氏菌的定量按實(shí)施例2所述方法進(jìn)行，不同點(diǎn)在于用22規(guī)格的針頭使細(xì)胞裂解，以及用McCoys細(xì)胞按1250細(xì)胞/孔接種于微量滴定板。
結(jié)果TCID50結(jié)果顯示，培養(yǎng)物含有高達(dá)1×106細(xì)菌/毫升。這是少于1個(gè)月的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)的。在同樣時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)體積被擴(kuò)大至3.0升。
實(shí)施例4確定胞內(nèi)勞森氏菌純培養(yǎng)物在宿主動(dòng)物中的感染劑量概要通過(guò)用來(lái)自樣品N72994的胞內(nèi)勞森氏菌純培養(yǎng)物感染6周大小的普通豬，完成了對(duì)31頭豬的研究。這些豬被隨機(jī)地分成4組，各組被單獨(dú)地圍起來(lái)。第1組含有7頭豬，并作為陰性對(duì)照組(用未感染的組織培養(yǎng)物感染或不感染)。第2組含有8頭豬，感染劑量為107細(xì)菌/豬。第3組含有8頭豬，感染劑量為106細(xì)菌/豬。第4組含有8頭豬，感染劑量為105細(xì)菌/豬。
在第0、7、14、21和24天收集糞便樣品用于PCR試驗(yàn)。在第24天，對(duì)豬進(jìn)行解剖，收集回腸、空腸和結(jié)腸用于PCR試驗(yàn)、組織病理學(xué)分析和FA染色，方法如上所述。
對(duì)回腸粘膜的PCR試驗(yàn)揭示，在高劑量組中100％、中劑量組中75％以及低劑量組中50％存在胞內(nèi)勞森氏菌。組織病理學(xué)分析數(shù)據(jù)顯示，在高劑量組中88％、中劑量組中75％以及低劑量組中88％發(fā)生粘膜固有層和粘膜下層中單核細(xì)胞數(shù)目增加。在高劑量組中50％、中劑量組中63％以及低劑量組中50％觀察到隱窩增生。FA染色揭示，在高劑量組中88％、中劑量組中63％以及低劑量組中63％的回腸、空腸和結(jié)腸組織切片存在胞內(nèi)勞森氏菌。對(duì)照動(dòng)物對(duì)PCR、FA和銀染分析都呈現(xiàn)胞內(nèi)勞森氏菌存在的陰性結(jié)果。
總而言之，純培養(yǎng)物可成功地用于感染并導(dǎo)致PPE損傷。Koch的假設(shè)通過(guò)從感染動(dòng)物中分離胞內(nèi)勞森氏菌并加以鑒定而證實(shí)。
在免疫激發(fā)的動(dòng)物中，高劑量組中100％的動(dòng)物通過(guò)銀染法、FA和PCR而證實(shí)痊愈和種類(lèi)。
材料和方法接種物的生長(zhǎng)將3.75×105HEp-2細(xì)胞接種于一個(gè)含DMEM/10％FBS的75cm2常規(guī)瓶中，在5％二氧化碳和37℃下孵育18-24小時(shí)。(細(xì)胞在接種時(shí)匯合度為30％)。將一瓶N72994在15毫升DMEM/5％FBS中稀釋。將培養(yǎng)物置于空氣罐中，排空，再充入氫氣和二氧化碳得到由8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氫氣構(gòu)成的混合物。再在24小時(shí)內(nèi)將DMEM/5％FBS供給培養(yǎng)物。
培養(yǎng)物孵育6天，然后從瓶上刮下細(xì)胞并加至含50毫升DMEM/5％FBS的100毫升旋轉(zhuǎn)瓶中。每周通過(guò)使培養(yǎng)基體積加倍而擴(kuò)大瓶中培養(yǎng)物的規(guī)模。培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)瓶中生長(zhǎng)3周。
培養(yǎng)物的收獲通過(guò)在3000×g離心20分鐘而收獲培養(yǎng)物。將沉淀再懸浮于含10％FBS蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通過(guò)25規(guī)格(gauge)的針頭4次。接種物在SPG/10％FBS中稀釋成終體積，并作1∶10稀釋。
用于對(duì)照的接種物，由活細(xì)胞濃度被稀釋成與感染培養(yǎng)物相同濃度的未感染HEp-2細(xì)胞構(gòu)成。按與感染細(xì)胞相同方法收獲細(xì)胞。對(duì)照組的豬接受于高劑量組相當(dāng)?shù)膭┝俊?br> 胞內(nèi)勞森氏菌的定量對(duì)活胞內(nèi)勞森氏菌的定量是通過(guò)確定50％組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)而完成的。做法是取出2毫升待測(cè)試的培養(yǎng)物，通過(guò)22規(guī)格(gauge)的針頭4次使細(xì)胞裂解。樣品在含萬(wàn)古霉素(100μg/ml)和兩性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS中進(jìn)行一系列1∶10的稀釋。將稀釋液按每孔0.1毫升加至96孔微量滴定板。用HEp-2細(xì)胞按2500細(xì)胞/孔接種于微量滴定板，并且在感染前生長(zhǎng)18-24小時(shí)。每個(gè)稀釋濃度使用12孔。板在在8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氫氣的氣體濃度下孵育6天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定細(xì)胞2分鐘。向各孔中加入0.03毫升/孔抗-胞內(nèi)勞森氏菌單克隆抗體(McOrist，1987)，該抗體已按1∶2000稀釋于PBS中。板在37℃孵育30分鐘，然后用PBS洗滌3次。按0.03毫升/孔加入已按1∶30稀釋的抗-鼠FITC，在37℃孵育30分鐘。板用雙蒸水洗滌3次，讓其干燥。用熒光顯微鏡觀察樣品，確定TCID50/ml。
動(dòng)物31頭6周大小、各種性別的PIC x Lieske母豬和大白公豬有Kent Schwartz博士提供。在第0天，豬按重量被隨機(jī)地分配入4個(gè)豬欄中。
設(shè)備使用一個(gè)小看護(hù)所的4個(gè)豬欄來(lái)安置豬，各豬欄至少隔開(kāi)3英尺。豬欄有金屬絲制地板和固體隔離物。用爐子供熱并且局部用放熱燈泡補(bǔ)充供熱。在研究過(guò)程中，溫度維持在78-85之間。
飼料和水將不含抗生素、蛋白質(zhì)含量為19％的磨細(xì)的玉米-大豆飼料，通過(guò)不銹鋼供料器隨意地供應(yīng)。水通過(guò)供水噴嘴隨意地供給。
豬的感染在第0天，對(duì)豬稱(chēng)重，并通過(guò)毛細(xì)血管在眼眶后竇(retroorbital sinus)采集血樣。收集血清，儲(chǔ)藏于-20℃。還收集排泄物樣品用于PCR。用胃管，通過(guò)胃內(nèi)方式給豬服用10毫升接種物。

在第0、10、17和24天，對(duì)豬稱(chēng)重并采集血樣。
聚合酶鏈反應(yīng)用Jones(1993)所描述的循環(huán)參數(shù)和引物的PCR，監(jiān)測(cè)豬的感染。在第0、7、14、21和24天收集的排泄物樣品以及腸粘膜用PCR檢查。
組織病理學(xué)回腸、空腸和結(jié)腸的切片用福爾馬林固定，用常規(guī)方法加工，用蘇木精和曙紅染色以及銀浸漬，并且加以評(píng)估。切片還用對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌特異的單克隆抗體染色。
結(jié)果臨床癥狀在3天，在高劑量組觀察到包括稀大便等臨床癥狀。在14天時(shí)達(dá)到高峰，隨后有所減輕。
體重增長(zhǎng)情況計(jì)算每日的平均體重增長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，高劑量和中劑量組的體重增長(zhǎng)減少。在比較各組時(shí)，在體重增長(zhǎng)中有劑量效價(jià)效應(yīng)。
PCR直到14天才觀察到糞便的滴下。在21天，高劑量組的豬中37.5％的糞便呈PCR陽(yáng)性。解剖后，回腸粘膜用PCR檢查，陽(yáng)性率為高劑量組100％，中劑量組75％，低劑量組50％和對(duì)照組0％。
嚴(yán)重?fù)p傷在高劑量組中發(fā)現(xiàn)2頭豬有嚴(yán)重?fù)p傷(#50和#202)。這2頭豬在回腸中有約3英尺的增厚部分，而且在#202中出現(xiàn)壞死。
組織病理學(xué)FA回腸、空腸和結(jié)腸的切片的FA染色揭示在高劑量組87.5％，中劑量組和低劑量組62.5％，和對(duì)照組0％中存在胞內(nèi)勞森氏菌。
微損傷在高劑量組100％，中劑量組75％，低劑量組87.5％和對(duì)照組14％中觀察到損傷。這是通過(guò)觀察粘膜固有層和粘膜下層中單核細(xì)胞數(shù)目增加而確定的，這種情況常常與Peyer’s Patchers增生有關(guān)。還觀察到隱窩增生。
銀染還對(duì)切片進(jìn)行了銀染以檢查是否存在細(xì)胞內(nèi)的、彎曲的細(xì)菌。結(jié)果表明，在高劑量組87.5％，中劑量組62.5％，低劑量組87.5％和對(duì)照組0％中存在細(xì)菌。
討論用純胞內(nèi)勞森氏菌培養(yǎng)物可成功地感染豬。在107劑量的細(xì)菌下，用PCR和顯微鏡觀察損傷確定100％豬被感染。在組織切片中損傷的嚴(yán)重程度和細(xì)菌數(shù)量相當(dāng)較低。該研究是令人滿意的胞內(nèi)勞森氏菌免疫激發(fā)模型，因?yàn)樵谪i中存在胞內(nèi)勞森氏菌而且有微損傷。在第一次劑量后7天再給予第二劑量的話，可增加損傷。
實(shí)施例5倉(cāng)鼠疫苗有效性試驗(yàn)?zāi)康脑u(píng)估實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物模型，以確定無(wú)毒力的活胞內(nèi)勞森氏菌疫苗在倉(cāng)鼠中的安全性和有效性。
概要用高傳代次數(shù)的胞內(nèi)勞森氏菌菌株的純培養(yǎng)物接種3周大小的倉(cāng)鼠，然后在接種后22天用低傳代次數(shù)的有毒力的材料進(jìn)行免疫激發(fā)，從而完成對(duì)40只倉(cāng)鼠的研究。倉(cāng)鼠被分成3組。A組在第0天用1劑量胞內(nèi)勞森氏菌菌株N72994接種。B組作為對(duì)照組，不使用疫苗培養(yǎng)物。在接種后22和25天，用2劑量的胞內(nèi)勞森氏菌菌株N343純培養(yǎng)物激發(fā)該兩組。C組使用激發(fā)菌株N101494以便與菌株N343比較相對(duì)的毒力。A和B組各有15只倉(cāng)鼠，C組有10只倉(cāng)鼠。50％組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)數(shù)據(jù)揭示，用105TCID50/一劑接種倉(cāng)鼠。N343免疫激發(fā)含有105.5TCID50/一劑。C組的激發(fā)劑量為102.75 TCID50/一劑。在第0、7、14、21、29、36和43天收集排泄物樣品用于PCR試驗(yàn)。在第5天，對(duì)A組和B組解剖5頭動(dòng)物，用于PCR檢查粘膜并進(jìn)行腸切片的FA、蘇木精和曙紅染色、以及銀染，以確定在接種的倉(cāng)鼠中細(xì)菌移生的持續(xù)性。剩余動(dòng)物在激發(fā)后21天進(jìn)行解剖并進(jìn)行類(lèi)似試驗(yàn)。
PCR數(shù)據(jù)顯示，在接種后21天，A組倉(cāng)鼠100％的腸粘膜上存在胞內(nèi)勞森氏菌。B組在接種后21天都呈陰性。在激發(fā)后21天，在A組的倉(cāng)鼠中50％呈PCR陽(yáng)性，在B組的倉(cāng)鼠中100％呈陽(yáng)性。切片的組織病理學(xué)分析顯示，在激發(fā)后21天，A組的50％動(dòng)物中有輕度至嚴(yán)重的損傷，B組的50％動(dòng)物中有輕度損傷。沒(méi)有動(dòng)物在接種21天顯現(xiàn)出損傷。C組動(dòng)物在激發(fā)后21天沒(méi)有損傷。FA和銀染都不能顯示在切片中存在胞內(nèi)勞森氏菌。
總之，PCR顯示，用高傳代的胞內(nèi)勞森氏菌菌株接種倉(cāng)鼠時(shí)，可觀察到感染下降50％。腸被少量胞內(nèi)生物(指胞內(nèi)勞森氏菌)移生，因?yàn)樵贔A和銀染切片中觀察不到該生物體。C組倉(cāng)鼠在整個(gè)研究過(guò)程中不顯示感染，這很可能是由于細(xì)菌劑量低造成的。
材料和方法倉(cāng)鼠的情況使用來(lái)自Harlan Sprague Dawley的40只3周大小的雌性倉(cāng)鼠。
接種物的生長(zhǎng)疫苗培養(yǎng)物使用在HEp-2細(xì)胞中生長(zhǎng)29周的胞內(nèi)勞森氏菌連續(xù)培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物按在激發(fā)培養(yǎng)物章節(jié)中所述的類(lèi)似方式進(jìn)行生長(zhǎng)，不同點(diǎn)在于每2-3周將培養(yǎng)物傳代至新的HEp-2細(xì)胞。
激發(fā)培養(yǎng)物將3.75×105的McCoys細(xì)胞接種于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基)的75cm2常規(guī)組織培養(yǎng)瓶中，在37℃和5％二氧化碳下孵育18-24小時(shí)。將培養(yǎng)基與細(xì)胞分開(kāi)，再將一瓶稀釋于14毫升DMEM/2％FBS中的N343 MSC X加入瓶中。將培養(yǎng)物置于空氣罐中，排空，再充入氫氣和二氧化碳得到由8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氫氣構(gòu)成的混合物。培養(yǎng)物生長(zhǎng)6天，從瓶上刮下細(xì)胞加至含90毫升DMEM/2％FBS和0.01克Cultispere-G珠的100毫升旋轉(zhuǎn)瓶中。培養(yǎng)物在上述的氣體濃度下生長(zhǎng)。每周通過(guò)使培養(yǎng)基體積加倍而擴(kuò)大瓶培養(yǎng)體積。培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)瓶中生長(zhǎng)25天直至終體積為250毫升。
菌株N10494按與菌株N343相同方式進(jìn)行生長(zhǎng)。
收獲培養(yǎng)物疫苗培養(yǎng)物通過(guò)在3000×g離心20分鐘而收獲培養(yǎng)物。將沉淀再懸浮于含10％FBS的蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通過(guò)25規(guī)格(gauge)的針頭4次。接種物在SPG/10％FBS中稀釋到終體積(15毫升)。
激發(fā)培養(yǎng)物通過(guò)在3000×g離心20分鐘而收獲培養(yǎng)物。將沉淀再懸浮于含10％FBS的蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通過(guò)25規(guī)格(gauge)的針頭4次。接種物在SPG/10％FBS中稀釋到終體積(N343菌株為20毫升，N101494菌株為10毫升)。
倉(cāng)鼠的劑量疫苗在第0天，A組的所有倉(cāng)鼠都口服接種1毫升制備的疫苗。
激發(fā)在接種后21天，A組的10只倉(cāng)鼠和B組的10只倉(cāng)鼠口服0.5毫升激發(fā)培養(yǎng)物菌株N343。C組用0.5毫升激發(fā)培養(yǎng)物菌株N101494進(jìn)行免疫激發(fā)。
ISi的定量對(duì)活I(lǐng)Si的定量是通過(guò)確定50％組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture InfectiousDose 50 percent，TCID50)而完成的。做法是取出2毫升待測(cè)試的培養(yǎng)物，通過(guò)22規(guī)格的針頭4次使細(xì)胞裂解。樣品在含萬(wàn)古霉素(100μg/ml)和兩性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS中進(jìn)行連續(xù)1∶10的稀釋。將稀釋液按每孔0.1毫升加至96孔微量滴定板。在感染前，該板已用McCoys細(xì)胞按1250細(xì)胞/孔接種，并且在37℃和5％二氧化碳下生長(zhǎng)18-24小時(shí)。每個(gè)稀釋濃度使用12孔。板在8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氮?dú)庵蟹跤?天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定細(xì)胞2分鐘。向各孔中加入0.03毫升/孔抗-ISi單克隆抗體，該抗體已按1∶2000稀釋于PBS中。板在37℃孵育30分鐘，然后用PBS洗滌3次。按0.03毫升/孔加入已1∶30稀釋的抗-鼠FITC，在37℃孵育30分鐘。板用雙蒸水洗滌3次，讓其干燥。用熒光顯微鏡觀察樣品，確定TCID50/ml。
倉(cāng)鼠感染的監(jiān)測(cè)用Gary Jones所描述的循環(huán)參數(shù)和引物的PCR，監(jiān)測(cè)倉(cāng)鼠的感染。在接種后第0、7、14、21、29、36和43天收集排泄物樣品。在殺死倉(cāng)鼠后，其腸粘膜也用PCR檢查。
組織病理學(xué)回腸和結(jié)腸的切片用福爾馬林固定，用常規(guī)方法加工，用蘇木精和曙紅染色以及銀浸漬，并且加以評(píng)估。切片還用對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌特異的單克隆抗體染色。
平均每日體重增加情況在接種后21、28、35和42天對(duì)倉(cāng)鼠進(jìn)行稱(chēng)重，以確定平均每日體重增加情況。結(jié)果參見(jiàn)下表。
TCID50TCID50數(shù)據(jù)顯示，疫苗組(A組)接受104.86 TCID50/倉(cāng)鼠。A組和B組的倉(cāng)鼠用菌株N343進(jìn)行激發(fā)，接受量為105.5 TCID50/倉(cāng)鼠。用菌株N101494激發(fā)的C組倉(cāng)鼠的接受量為102.75 TCID50/倉(cāng)鼠。
PCRPCR測(cè)試顯示，在接種后21天解剖的接種過(guò)的倉(cāng)鼠中100％存在胞內(nèi)勞森氏菌。在接種43天后的試驗(yàn)顯示，對(duì)照倉(cāng)鼠100％和接種過(guò)的倉(cāng)鼠50％被胞內(nèi)勞森氏菌感染。用N101494激發(fā)的倉(cāng)鼠中沒(méi)有一只呈PCR陽(yáng)性。在該項(xiàng)對(duì)倉(cāng)鼠的研究中沒(méi)有觀察排泄物滴落的情況。
組織病理學(xué)蘇木精和曙紅染色(H&E染色)揭示，在接種后21天被解剖的倉(cāng)鼠的所有切片中沒(méi)有組織損傷。在接種后43天后收集的切片中，疫苗組的50％有輕度至嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞腸炎，對(duì)照組50％有輕度淋巴細(xì)胞腸炎。在N101494激發(fā)組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)損傷。
FA染色不能顯示在接種后43天的倉(cāng)鼠中存在胞內(nèi)勞森氏菌。
討論P(yáng)CR顯示，在用高傳代的胞內(nèi)勞森氏菌菌株接種的倉(cāng)鼠中，觀察到感染率下降50％。
排泄物 排泄物 排泄物 排泄物 排泄物 排泄物 排泄物 粘膜微損傷粘膜PCR H&E染色 FAPcRPCRPCRPCRPCRPcRPCRPCR 銀染ID0天7天14天 21天 29天 36天 43天 21天 43天A-1 - - - - - - - NA + 輕度腸炎 - -A-2 - - - - - - - NA - -- -A-3 - - - - - - - NA + 輕度腸炎 - -A-4 - - - - - - - NA - -- -A-5 - - - - - - - NA + -- -A-6 - - - - - - - NA - -- -A-7 - - - - - - - NA + 重度腸炎 - -A-8 - - - - - - - NA + 中度腸炎 - -A-9 - - - - - - - NA - -- -A-10 - - - - - - - NA - 輕度腸炎 - -A-11 - - - - NA NA NA +NA --A-12 - - - - NA NA NA +NA -- -A-13 - - - - NA NA NA +NA -- -A-14 - - - - NA NA NA +NA -- -A-15 - - - - NA NA NA +NA -- -B-1 - - - - - - - NA + 最低程度腸炎 - -B-2 - - - - - - - NA + 最低程度腸炎 - -B-3 - - - - - - - NA + -- -B-4 - - - - - - - NA + 最低程度腸炎 - -B-5 - - - - - - - NA + 最低程度腸炎 - -B-6 - - - - - - - NA + 最低程度腸炎 - -B-7 - - - - - - - NA + -- -B-8 - - - - - - - NA + -- -B-9 - - - - - - - NA + -- -B-10 - - - - - - - NA + -- -B-11 - - - - NA NA NA -NA -- -B-12 - - - - NA NA NA -NA -- -B-13 - - - - NA NA NA -NA -- -
B-14 ----NA NA NA - NA ---B-15 ----NA NA NA - NA ---C-1-------NA----C-2-------NA----C-3-------NA----C-4-------NA----C-5-------NA----C-6-------NA----C-7-------NA----C-8-------NA----C-9-------NA----C-10 -------NA----實(shí)施例6豬疫苗有效性試驗(yàn)?zāi)康脑撗芯康哪康氖窃u(píng)估胞內(nèi)勞森氏菌的無(wú)毒力的活分離物和殺滅的分離物在2-3周大小的豬中的安全性、移生持續(xù)性和有效性。進(jìn)行宿主動(dòng)物研究，在該研究中，接種3周齡的豬，然后將其用胞內(nèi)勞森氏菌菌株N343進(jìn)行有毒力的免疫激發(fā)，以比較疫苗間保護(hù)的差異。
方法在1995年12月11日，從H&K農(nóng)場(chǎng)購(gòu)得總計(jì)45頭3周齡的豬。它們被運(yùn)至Veterinary Resources，Inc.，這是一個(gè)位于Cambridge，Iowa的研究機(jī)構(gòu)，在這里豬被打上標(biāo)記以區(qū)分每頭豬。在進(jìn)行研究之前，豬在該機(jī)構(gòu)關(guān)2天以便適應(yīng)環(huán)境，在研究過(guò)程中給豬喂養(yǎng)的是無(wú)抗生素的飼料。
在12月13日，所有的豬都稱(chēng)重、抽血采集血清、臨床打分并收集直腸化驗(yàn)樣品。豬被隨機(jī)地分成5組，并置于盆中。20頭豬被置于一間單獨(dú)的房間，用作對(duì)照和嚴(yán)格對(duì)照組。15頭豬被置于第二間房間，進(jìn)行ISi-1疫苗試驗(yàn)。第三間房間有10頭豬，用于ISi-2疫苗試驗(yàn)。
活疫苗在NOBL Laboratories Research and Development機(jī)構(gòu)進(jìn)行制備，被稱(chēng)為試驗(yàn)系列ISi-1。ISi-1(菌株N343)是從豬中分離出并在純培養(yǎng)物中連續(xù)生長(zhǎng)29周。疫苗在旋轉(zhuǎn)瓶中的McCoys細(xì)胞上，于低氧濃度下生長(zhǎng)直至觀察到約100％感染。用于ISi-1的高傳代N343菌株旋轉(zhuǎn)瓶再傳代11周(“N343NP40wk”)，按照布達(dá)佩斯條約，于1996年5月22日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland U.S.A 20 852)，保藏號(hào)為55783。通過(guò)在3000×g上離心20分鐘而收獲培養(yǎng)物。將沉淀再懸浮于蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通過(guò)25規(guī)格的針頭4次。裂解液在500×g下離心約5分鐘形成沉淀以除去碎片和微載體珠。收集上清液，儲(chǔ)藏于-70℃，直到接種前1小時(shí)才取出，置于冰上以供施用。
滅活的疫苗(ISi-2)按上述類(lèi)似方式生長(zhǎng)、傳代12.5周并收獲，然后用percol梯度進(jìn)行純化。純化的細(xì)菌接著儲(chǔ)藏于-70℃，直到接種前1小時(shí)才取出，將其儲(chǔ)藏在4℃和一般的大氣氧濃度下，這種氧濃度對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌是有毒性的。將氫氧化鋁加入細(xì)菌至最終混合物含有10％氫氧化鋁。用Biurett法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
活I(lǐng)Si的定量對(duì)活胞內(nèi)勞森氏菌的定量是通過(guò)確定50％組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)而完成的。做法是在感染前，96孔微量滴定板用McCoys細(xì)胞按1250細(xì)胞/孔接種，然后生長(zhǎng)18-24小時(shí)。樣品在含萬(wàn)古霉素(100μg/ml)和兩性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS中進(jìn)行連續(xù)1∶10的稀釋。將稀釋液按每孔0.1毫升加至96孔微量滴定板。每個(gè)稀釋濃度使用12孔。板于37℃，在8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氮?dú)庵蟹跤?天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定細(xì)胞2分鐘。向各孔中加入0.03毫升/孔抗-胞內(nèi)勞森氏菌單克隆抗體(由Dr.Steven McOrist開(kāi)發(fā))，該抗體已按1∶2000稀釋于PBS中。板在37℃孵育30分鐘，然后用PBS洗滌3次。按0.03毫升/孔加入已1∶30稀釋的抗-鼠免疫球蛋白G-熒光團(tuán)共軛物(FITC)，在37℃孵育30分鐘。板用雙蒸水洗滌3次，讓其干燥。用熒光顯微鏡觀察樣品，用Reed-Meunsch計(jì)算法確定TCID50/ml。
TCID50數(shù)據(jù)顯示，ISi-1有1.8×105細(xì)菌/毫升。第四種接種物是安慰劑，它來(lái)自用與疫苗相同方式加工的組織培養(yǎng)細(xì)胞。
用Biurret法測(cè)定滅活的疫苗的總蛋白質(zhì)含量，為0.311毫克/毫升。
在1995年12月13日給豬接種?；钜呙绲膭┝繛?毫升IN，每個(gè)鼻孔1毫升。ISi-2(滅活的)疫苗以肌肉注射方式施用，為1.5毫升/每頭豬，并在14天后再進(jìn)行一次。所有的對(duì)照動(dòng)物都按與活疫苗相同方式使用未感染的細(xì)胞。
觀察和樣品在研究過(guò)程中，每隔7天收集排泄物樣品和血清。對(duì)排泄物樣品進(jìn)行PCR試驗(yàn)以擴(kuò)增DNA，所用引物對(duì)為5’-TATGG CTGTC AAACA CTCCG-3’和為5’-TGAAG GTATT GGTATTCTCC-3’。循環(huán)的第一個(gè)循環(huán)為93℃，5分鐘；55℃，45秒；和72℃45秒。33個(gè)循環(huán)是在上述各溫度下各進(jìn)行45秒。最后一個(gè)循環(huán)為93℃，45秒；55℃，45秒；和72℃2分鐘。引物由Jones等人確定。
免疫激發(fā)所有的動(dòng)物，除了嚴(yán)格對(duì)照之外，都在接種后26和27天給予激發(fā)培養(yǎng)物，該激發(fā)培養(yǎng)物由胞內(nèi)勞森氏菌菌株N343和N72994的低傳代培養(yǎng)物(連續(xù)生長(zhǎng)8-12周)構(gòu)成。通過(guò)在3000×g上離心20分鐘而收獲培養(yǎng)物。將沉淀再懸浮于含10％胎牛血清的蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通過(guò)25規(guī)格的針頭4次。部分收獲的培養(yǎng)物儲(chǔ)藏于-70℃直到用于激發(fā)，而其他繼續(xù)生長(zhǎng)直到免疫激發(fā)當(dāng)天，然后收獲?；旌霞ぐl(fā)接種物，測(cè)定培養(yǎng)物的TCID50。樣品儲(chǔ)藏于冰上以供施用。
96年1月8日的激發(fā)培養(yǎng)物含有4×104細(xì)菌/毫升，而96年1月9日的激發(fā)培養(yǎng)物含有3×104細(xì)菌/毫升。這兩天都通過(guò)洗胃給豬施用15毫升激發(fā)疫苗。因此，動(dòng)物在96年1月8日和96年1月9日分別接受6×105細(xì)菌/豬和4.7×105細(xì)菌/豬。
結(jié)果安全性排泄物PCR結(jié)果用PCR檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌顯示，沒(méi)有豬在研究開(kāi)始時(shí)排泄細(xì)菌。在接種后7天，所有的豬呈陰性。在接種后14天，在ISi-1組中3頭豬呈陽(yáng)性。在接種后21天，在ISi-1組中2頭豬呈陽(yáng)性，其他所有的豬呈陰性。用PCR檢測(cè)顯示，沒(méi)有動(dòng)物在接種后26天排泄細(xì)菌。在接種后26天，解剖ISi-1組中的5頭豬和ISi-2組中的4頭豬。收集的樣品是回腸、結(jié)腸、腸系淋巴結(jié)和扁桃體以及肺樣品(來(lái)自可能有肺炎損傷的豬)。
對(duì)各回腸和肺樣品進(jìn)行PCR試驗(yàn)。按各處理組混合扁桃體、結(jié)腸和淋巴結(jié)，并進(jìn)行PCR。PCR結(jié)果如下。

對(duì)回腸組織切片進(jìn)行染色，其中使用對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌特異的單克隆抗體作為第一抗體，使用抗-鼠免疫球蛋白G-熒光團(tuán)共軛物作為第二抗體。在5頭來(lái)自ISi-1的豬中有3頭觀察到胞內(nèi)勞森氏菌。用熒光抗體染色檢測(cè)，其他所有的豬都呈陰性。
剩余的豬在激發(fā)后21天解剖，收集相同的樣品用于評(píng)估。PCR結(jié)果如下。

如上對(duì)回腸進(jìn)行FA染色，在對(duì)照組的10只動(dòng)物中有7只為陽(yáng)性。對(duì)于是否存在胞內(nèi)勞森氏菌，其他所有動(dòng)物都呈陰性。
還測(cè)試了血清，以確定豬暴露于胞內(nèi)勞森氏菌后產(chǎn)生的IgG抗體產(chǎn)量。該試驗(yàn)是這樣進(jìn)行的在感染前，將McCoys細(xì)胞按1250細(xì)胞/孔接種于已用組織培養(yǎng)物處理過(guò)的Terasak i板，然后生長(zhǎng)18-24小時(shí)。將胞內(nèi)勞森氏菌純培養(yǎng)物在含5％胎牛血清的DMEM中稀釋至1000-3000細(xì)菌/毫升，按每孔0.1毫升加至各孔中。板在8.0％氧氣、8.8％二氧化碳和83.2％氮?dú)庵蟹跤?天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定細(xì)胞2分鐘。豬血清按1∶75稀釋于無(wú)菌PBS。將稀釋的血清按每孔0.01毫升加至各孔中。板在37℃孵育30-60分鐘，然后用無(wú)菌PBS洗滌5次。按0.01毫升/孔向各孔加入抗-豬免疫球蛋白G-熒光團(tuán)共軛物，板在37℃孵育30分鐘。板用雙蒸水洗滌5次，讓其干燥。樣品用雙蒸水洗滌5次，讓其干燥。用熒光顯微鏡觀察樣品，觀察到細(xì)菌的孔被記為陽(yáng)性，沒(méi)有觀察到細(xì)菌的孔被記為陰性。
結(jié)果

在第0天呈陽(yáng)性的動(dòng)物每周再次測(cè)試。結(jié)果顯示，在接種后14天血清都呈陰性。這是預(yù)料之中的，因?yàn)樵诘?天時(shí)豬僅3周大小，在這種年齡下的陽(yáng)性可能是由母體的抗體造成的。
測(cè)試血清時(shí)所用的陽(yáng)性對(duì)照血清是通過(guò)用在純培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的胞內(nèi)勞森氏菌高劑量地免疫豬而獲得的。使用的陰性對(duì)照血清是從South Dakota State University的無(wú)菌豬上采集的。
上述描述和實(shí)施例僅用于闡述可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的、特征和優(yōu)勢(shì)的優(yōu)選例子，不可理解為本發(fā)明局限于此。在所附權(quán)利要求書(shū)主旨和范圍之內(nèi)的本發(fā)明的任何變動(dòng)形式都被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生減毒胞內(nèi)勞森氏菌菌株的方法，其特征在于，包括獲得用胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌感染的培養(yǎng)細(xì)胞，在氧濃度為0-18％下孵育該感染細(xì)胞，攪拌該感染細(xì)胞，從而培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌，同時(shí)維持該細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，使至少一部分該培養(yǎng)細(xì)菌傳代，收獲至少一部分該培養(yǎng)的細(xì)菌，選擇減菌株以提供減毒的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌。
2.采用權(quán)利要求1所述的方法制得的減毒菌株，其特征在于，所述菌株在連續(xù)培養(yǎng)至少150-250天后獲得，在此期間，培養(yǎng)物至少傳代7-12次。
3.一種用于在動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌的免疫應(yīng)答的疫苗，其特征在于，含有減毒的胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)菌和藥學(xué)上可接受的載體，其中該減毒菌株的數(shù)量能有效地產(chǎn)生免疫應(yīng)答，所述疫苗含有50-500微克的免疫原，且使用純化的細(xì)菌。
4.如權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有107-109TCID50的免疫原。
5.如權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述載體選自水性溶液、乳液或懸浮液。
6.如權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有權(quán)利要求2所述的減毒菌株。
7.如權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，該減毒菌株是用權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的。
8.如權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，該被胞內(nèi)勞森氏菌感染的培養(yǎng)細(xì)胞是通過(guò)用胞內(nèi)勞森氏菌感染動(dòng)物的腸組織勻漿而制備的。
9.如權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，該減毒菌株是菌株ATCC 55783。
10.權(quán)利要求3所述的的疫苗的用途，其特征在于，用于制備治療勞森氏菌感染用的藥劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大規(guī)模培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌下部并使其減毒的方法，它包括用胞內(nèi)勞森使菌細(xì)菌接種細(xì)胞以感染細(xì)胞，將感染細(xì)胞在較低氧濃度下培養(yǎng)并維持感染細(xì)菌處于懸浮狀態(tài)。用懸浮液中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物制備抗胞內(nèi)勞森氏菌疫苗。還公開(kāi)了診斷試劑。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1519311SQ200310116358
公開(kāi)日2004年8月11日 申請(qǐng)日期1996年11月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月4日
發(fā)明者J·P·克尼特爾, J P 克尼特爾, M·B·魯夫, 魯夫 申請(qǐng)人:諾博實(shí)驗(yàn)室股份有限公司