專利名稱：固氮斯氏假單胞菌A1501 rpoN基因的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固氮斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501的rpoN基因的表達(dá)方法，尤其涉及利用衣藻葉綠體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)斯氏假單胞菌I^seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因的方法，屬于固氮斯氏假單胞菌A1501 rpoN基因的表達(dá)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸的主要物質(zhì)，是自然界中動(dòng)物、植物、微生物不可缺少的生命元素。氮素在自然界有多種存在形式，數(shù)量最大的是大氣中的氮?dú)庹即髿怏w積的79%，總量約3. 9X107億噸，但是不能為大多數(shù)生物(包括所有植物和動(dòng)物)直接利用，因此氨態(tài)氮的供應(yīng)成為生物界繁榮發(fā)展的主要決定因素。目前，固氮主要有以下兩種方式，即工業(yè)固氮和生物固氮。工業(yè)固氮指用高溫、高壓、化學(xué)催化的方法；生物固氮是指某些種類的原核生物利用體內(nèi)的固氮酶將空氣中的氮?dú)膺€原為氨，為植物生長(zhǎng)提供氮素。人類對(duì)于生物固氮的認(rèn)識(shí)要追溯到十九世紀(jì)，距今已有100多年的歷史。最早在1830年，Boussingault報(bào)道豆科植物可以固氮。Hellriegel & Wilfarth于1886年報(bào)道并于1888年發(fā)表關(guān)于豆科植物能夠固氮的可靠依據(jù)，并且確定了豆科植物的根瘤是固氮的主要場(chǎng)所。隨后不久，厭氧的Clostridium pasteurianum，好養(yǎng)的Azotobacter chroococcum, 以及 cyanobacteria, photosynthetic bacteria, Klebsiella spp., Archaebacteria,Desulfovibrio sp.，等都加入到固氮的行列。到目前為止，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)自然界中可進(jìn)行生物固氮的微生物種屬范圍分布比較廣，可以分成自生固氮、 共生固氮和聯(lián)合共生固氮3種。生物固氮主要依靠多數(shù)原核生物，這些原核生物之所以能夠固氮，是因?yàn)楣痰傅木壒省９痰甘且环N復(fù)雜的金屬酶，由鉬鐵蛋白和鐵蛋白組成(或稱為組分I和組分II， 也有稱之為Dinitrogenase禾口 Dinitrogenase reductant)。固氮作用是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程, 其調(diào)節(jié)是在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)的，主要是根據(jù)環(huán)境中氧氣的含量和銨的水平進(jìn)行調(diào)控的。固氮斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) A1501的rpoN基因在斯氏假單胞菌 A1501的固氮調(diào)節(jié)作用中起著非常重要的作用。RNA聚合酶需要依靠o54(rpoN基因的產(chǎn)物)才能啟動(dòng)主要nif基因簇的轉(zhuǎn)錄，因此才能保證某些原核生物的固氮作用。為了深入的研究固氮斯氏假單胞菌的固氮作用機(jī)理以及rpoN蛋白的功能、特性及純化方式等，需要有大量的rpoN蛋白作為物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，提供一種穩(wěn)定、高效的表達(dá) rpoN基因的方法能夠?yàn)楣痰故霞賳伟墓痰{(diào)節(jié)作用機(jī)制以及rpoN蛋白的功能、特性及純化方式等研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種固氮斯氏假單胞菌 A1501的rpoN基因的表達(dá)方法，該方法以衣藻葉綠體為表達(dá)系統(tǒng)，能夠穩(wěn)定、高效的在衣藻葉綠體中表達(dá)rpoN基因。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的固氮斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) A1501的rpoN基因的表達(dá)方法，包括構(gòu)建rpoN基因的表達(dá)盒；將所構(gòu)建的rpoN基因的表達(dá)盒插入到衣藻葉綠體表達(dá)載體上的衣藻葉綠體基因組的同源片段之間，構(gòu)建得到重組衣藻葉綠體表達(dá)載體；將重組衣藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻；篩選轉(zhuǎn)基因衣藻，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因衣藻中的rpoN基因表達(dá)，收獲并純化所表達(dá)的蛋白。其中，所述的斯氏假單胞菌I3SeudomonaS stutzeri A1501的rpoN基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示；所述的rpoN基因的表達(dá)盒由衣藻葉綠體特異啟動(dòng)子、rpoN基因和衣藻葉綠體特異終止子所組成，其中，rpoN基因置于衣藻葉綠體基因特異啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控之下； 所述的衣藻葉綠體特異啟動(dòng)子包括但不限于atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL，優(yōu)選為atpA 啟動(dòng)子；所述的衣藻葉綠體特異終止子優(yōu)選為rbcL終止子。所述的衣藻葉綠體基因組的同源片段為trnE2-pSbH基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO 2所示；本發(fā)明中所用到的衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)可以為任何一種野生型萊茵衣藻，均能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果；為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，本發(fā)明所述的衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)更優(yōu)選為品系 cwl5;其中，所述的重組衣藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻的方式優(yōu)選采用包裹有重組衣藻葉綠體表達(dá)載體的基因槍轟擊處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期的衣藻并通過(guò)無(wú)醋酸鹽的培養(yǎng)基篩選得到轉(zhuǎn)基因衣藻(衣藻轉(zhuǎn)化子)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所篩選得到的轉(zhuǎn)基因衣藻aadA的抗性消失。本發(fā)明采用基因同源重組技術(shù)，將來(lái)源于斯氏假單胞菌I^seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因構(gòu)建到由衣藻葉綠體特異啟動(dòng)子atpA和終止子rbcL組合所驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒，利用衣藻葉綠體基因組中的trnE2-pSbH作為同源片段，發(fā)生同源重組，通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入衣藻葉綠體中，通過(guò)PCRJestern blot等分子生物學(xué)手段檢測(cè)最終獲得轉(zhuǎn)基因衣藻，證明斯氏假單胞菌I3Seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因在衣藻葉綠體中能夠穩(wěn)定、高效的表達(dá)。衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)作為較簡(jiǎn)單的單細(xì)胞真核生物，日益吸引了細(xì)胞和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域的注意力。衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是單細(xì)胞綠藻，呈橢圓形，細(xì)胞大小大約長(zhǎng)10 μ m，寬3 μ m，具有單個(gè)杯狀葉綠體，約占細(xì)胞總體積的 40%-60%。本發(fā)明采用衣藻葉綠體作為rpoN基因的表達(dá)系統(tǒng)，不僅彌補(bǔ)了核轉(zhuǎn)化的不足， 而且還具有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)第一，本發(fā)明通過(guò)在轉(zhuǎn)化載體上設(shè)計(jì)葉綠體基因組的同源片段，通過(guò)同源重組作用實(shí)現(xiàn)rpoN基因定點(diǎn)插入，避免位置效應(yīng)和基因沉默的產(chǎn)生，保證了 rpoN基因的穩(wěn)定表達(dá)。第二，衣藻葉綠體基因組遺傳表達(dá)體系具有原核性。萊茵衣藻葉綠體基因組基因的排列方式、調(diào)控方式、GC堿基對(duì)含量及翻譯所偏愛的密碼子與原核生物相接近，這有利于直接表達(dá)rpoN基因。第三，rpoN基因在衣藻葉綠體中可穩(wěn)定、高效的進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明方法成功的將固氮斯氏假單胞菌I3SeudomonaS stutzeri A1501的rpoN基因在衣藻葉綠體中穩(wěn)定、高效的表達(dá)，采用本發(fā)明方法能夠通過(guò)衣藻葉綠體表達(dá)系統(tǒng)獲得大量的重組rpoN蛋白，為展開固氮斯氏假單胞菌的作用機(jī)制以及rpoN蛋白的純化、功能及特性等研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。


圖1轉(zhuǎn)目的基因rpoN的轉(zhuǎn)基因衣藻PCR檢測(cè)結(jié)果；1、野生型衣藻；2、轉(zhuǎn)化子樣品 1 ；3、轉(zhuǎn)化子樣品2。圖2載體p72B-LG的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。圖3質(zhì)粒paptY的酶切圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。應(yīng)了解本發(fā)明不限于本文中所述的特定方法、實(shí)驗(yàn)方案、細(xì)胞系、構(gòu)建體和試劑且因此可加以變化。也應(yīng)了解本文中所用的方法是僅用于描述特定實(shí)施例的目的，且并不意欲限制本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的范疇將僅由隨附權(quán)利要求書所限制。說(shuō)明在以下實(shí)施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊(cè)或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來(lái)進(jìn)行，包括Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3版.2001) ；Kriegler,Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual(1990)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人編，1994)。除非另外定義，否則本發(fā)明所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。實(shí)驗(yàn)材料I.E. coli T0P10 購(gòu)自 Promega 公司；固氮斯氏假單胞菌 Pseudomonas stutzeri A1501的rpoN基因由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所保存；野生型萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtti)CW-15(說(shuō)明本發(fā)明中所述的CW-15可以由任何一種野生型萊茵衣藻所代替，均能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存，具體培養(yǎng)方法和特性可以參考相關(guān)的文獻(xiàn)(Hyams，J. and D. R. Davies, The induction and characterisation of cell wall mutants of Chlamydomonas reinhardtii. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,1972. 14(4) p. 381-389) ；paptY、p72B-LG由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存；載體P72B-LG的插入核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖見圖1，其中，插入序列為2. 2kb, pUC9載體為2. 671Λ，載體p72B_LG的全序列為4. 871Λ。質(zhì)粒paptY (pBlutscript II-aptY)的載體圖譜見圖2，關(guān)于paptY的構(gòu)建可按照有關(guān)文獻(xiàn)構(gòu)建得至丨Ji亥質(zhì)粒 paptY (Expression of human soluble TRAIL in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast. Chinese Science Bulletin 2006 Vol. 51 No. 14 1703-1709)。酶與試劑各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Kl enow酶及其配套緩沖液購(gòu)自 Promega 公司；2.生化試劑IPTG、X-Gal為!Iomega公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Sun biotech公司產(chǎn)品；Tris、dNIPs購(gòu)自Sigma公司；蛋白胨、酵母抽提物、胰蛋白胨均購(gòu)自0X0ID公司；溴化乙錠(EB)購(gòu)自Fluka公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔rpoN抗體；TEMED (N, N，N，，N，-四甲基乙二胺)購(gòu)自瑞典LKB BROMMA公司；SDS為BDH公司產(chǎn)品；β -巰基乙醇，Tris購(gòu)自Sigma公司； 考馬斯亮蘭R-250、N, N'-甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自瑞士 Fluka Chemie AG公司；丙烯酰胺為 Aldrich化學(xué)有限公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜Hybond-N和尼龍膜Hybond-C均為Amersham產(chǎn)品；3.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、 NaCl, ρΗ7. 0)；衣藻培養(yǎng)基為TAP培養(yǎng)基；實(shí)施例固氮斯氏假單胞菌I^seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因的獲得、重組衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因衣藻的鑒定1.固氮斯氏假單胞菌I^seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1目的基因的獲得根據(jù)已知的固氮斯氏假單胞菌I3SeudomonaS stutzeri A1501的rpoN的序列，分別設(shè)計(jì)引物，并且分別引入)CbaI和HindIII位點(diǎn)，兩對(duì)引物如下F rpoN 5' -ATCTAGAATGAAGCAAGGTTTGCAATTAAG-3‘XbaI酶切位點(diǎn)R rpoN 5' -AAAGCTTTCAGACCAGTTGTTTACGCTG-3‘HindIII 酶切位點(diǎn)在 0. 5mL Eppendorf 管中力口入
權(quán)利要求
1.一種固氮斯氏假單胞菌G^ewi/offloaas stutzeri) A1501的rpoyV基因的表達(dá)方法， 其特征在于，包括構(gòu)建基因的表達(dá)盒；將所構(gòu)建的基因的表達(dá)盒插入到衣藻葉綠體表達(dá)載體上的衣藻葉綠體基因組的同源片段之間，構(gòu)建得到重組衣藻葉綠體表達(dá)載體；將重組衣藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻(fiWaffij^/oMwas reinhardtii)；篩選轉(zhuǎn)基因衣藻，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因衣藻中的基因表達(dá)，收獲并純化所表達(dá)的蛋白。
2.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于所述基因的表達(dá)盒由衣藻葉綠體特異啟動(dòng)子、基因和衣藻葉綠體特異終止子所組成。
3.按照權(quán)利要求2所述的表達(dá)方法，其特征在于所述基因置于衣藻葉綠體基因特異啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控之下。
4.按照權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)方法，其特征在于所述的衣藻葉綠體特異啟動(dòng)子包括atpA、atpB、psbA、psbD irbcL ；所述的衣藻葉綠體特異終止子為r力cZ終止子。
5.按照權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的表達(dá)方法，其特征在于所述rpoN基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1所示。
6.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于所述的衣藻葉綠體基因組的同源片段為ir/^J-zzsM基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示。
7.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于所述的衣iWhleimydomorms reinhardtii )的品系為 cwl5。
8.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于所述的重組衣藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻的方式為采用包裹有重組衣藻葉綠體表達(dá)載體的基因槍轟擊處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期的衣藻。
9.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于所述的篩選轉(zhuǎn)基因衣藻是通過(guò)無(wú)醋酸鹽的培養(yǎng)基篩選得到轉(zhuǎn)基因衣藻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固氮斯氏假單胞菌A1501 rpoN基因的表達(dá)方法，該表達(dá)方法包括構(gòu)建rpoN基因的表達(dá)盒；將所構(gòu)建的rpoN基因的表達(dá)盒插入到衣藻葉綠體表達(dá)載體上的衣藻葉綠體基因組的同源片段之間，構(gòu)建得到重組衣藻葉綠體表達(dá)載體；將重組衣藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻；篩選轉(zhuǎn)基因衣藻，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因衣藻中的rpoN基因表達(dá)，收獲并純化所表達(dá)的蛋白。本發(fā)明方法成功的將斯氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri A1501的rpoN基因在衣藻葉綠體中穩(wěn)定、高效的表達(dá)，為深入研究固氮斯氏假單胞菌的固氮作用機(jī)制以及rpoN蛋白的純化、功能及特性等奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/13GK102417882SQ20111032670
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者劉國(guó)憲, 張志芳, 李軼女, 沈桂芳, 程奇 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所