專利名稱：檢測(cè)載脂蛋白m的免疫比濁法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)載脂蛋白M(Apoliprotein M，簡(jiǎn)稱ApoM)的免疫比濁法，更具體講，涉及人血漿或血清中ApoM含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
脂蛋白是在血液和其它體液中轉(zhuǎn)運(yùn)各種脂質(zhì)的大分子復(fù)合體，參與體內(nèi)多種生理、病理過(guò)程，尤其與機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂以及心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著極其密切的聯(lián)系。脂蛋白有不同類型，目前主要根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)分類的，其中最主要的是根據(jù)超速離心時(shí)的密度分類。據(jù)此可分為乳糜微粒(CM，密度＜1.006)、極低密度脂蛋白(VLDL，密度＜1.006)、中間密度脂蛋白(IDL，1.006＜密度＜1.019)、低密度脂蛋白(LDL，1.019＜密度＜1.063)和高密度脂蛋白(HDL，1.063＜密度＜1.210)。因CM、VLDL、IDL富含甘油三酯，故統(tǒng)稱為富甘油三酯脂蛋白(TGRLP)。血漿脂蛋白由脂類與蛋白質(zhì)組分結(jié)合而成，其中的蛋白質(zhì)組分被稱為載脂蛋白(Apos)，有一些載脂蛋白的性質(zhì)已經(jīng)清楚，如ApoA-I、ApoA-II、ApoA-VI，ApoB，ApoCs和ApoE。載脂蛋白的功能有作為結(jié)合配基的受體、脂蛋白分解代謝的調(diào)節(jié)因子和/或調(diào)節(jié)脂類代謝酶的活性。某些載脂蛋白還與老年性癡呆以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
本項(xiàng)發(fā)明的發(fā)明人徐寧于1999年發(fā)現(xiàn)了一種新型人類載脂蛋白M(ApoM)，并先后克隆了小鼠、大鼠及人的ApoM cDNA，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ApoM基因存在于所有哺乳動(dòng)物中，并且有著極高的同源性。初步的研究資料已經(jīng)揭示ApoM可能與體內(nèi)脂肪和脂蛋白代謝有關(guān)，也可能與機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂以及機(jī)體防御反應(yīng)有一定聯(lián)系。最新的研究資料進(jìn)一步揭示冠心病患者血漿中ApoM的水平明顯高于健康志愿者。
有人研究表明青年人中成年發(fā)病型糖尿病(Maturity-onset diabetes of theyoung，MODY3)病人血清中ApoM含量明顯降低。
綜上所述，測(cè)定血漿或血清中ApoM的含量，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前途；同時(shí)由于ApoM是一種新近發(fā)現(xiàn)的蛋白，它的功能還有待進(jìn)一步深入研究，在研究中，特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)便易行的測(cè)定人血漿或血清中ApoM的方法是必不可少的工具，但迄今仍未有一種適用的測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種檢測(cè)載脂蛋白M的免疫比濁法，該方法操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、適應(yīng)性強(qiáng)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案一種檢測(cè)載脂蛋白M的免疫比濁法，用抗載脂蛋白M的多克隆抗體，與待檢標(biāo)本的載脂蛋白M反應(yīng)，所形成的復(fù)合物引起濁度變化；用光透射強(qiáng)度或光散射強(qiáng)度表征這種變化；從載脂蛋白M標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)光散射強(qiáng)度或光透射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待檢標(biāo)本的載脂蛋白M的含量；其中所用抗載脂蛋白M的多克隆抗體效價(jià)至少為1∶128，不含雜抗體，具有識(shí)別載脂蛋白M多種抗原決定簇；待檢標(biāo)本是人空腹血漿或血清并用稀釋劑作1∶200～300稀釋；抗載脂蛋白M的多克隆抗體與已稀釋的待檢標(biāo)本的混合比為1∶4體積比。
上述方法中，所述載脂蛋白M標(biāo)準(zhǔn)品是純載脂蛋白M，其濃度為2.6g/l，先用稀釋劑作1∶200稀釋，再作倍比稀釋，作成系列標(biāo)準(zhǔn)品，供作標(biāo)準(zhǔn)曲線用；或者是定值健康人混合血漿或血清，用酶聯(lián)免疫吸附法確定其載脂蛋白M濃度，根據(jù)所定濃度，再用稀釋劑調(diào)整其載脂蛋白M濃度至2.0g/l，1.5g/l及0.5g/l各一份，供作標(biāo)準(zhǔn)曲線用。
上述用酶聯(lián)免疫吸附法確定健康人混合血漿或血清的載脂蛋白M濃度的具體步驟是包被只抗載脂蛋白M的單克隆抗體；配制系列載脂蛋白M標(biāo)準(zhǔn)品；準(zhǔn)備待定值的健康人混合血漿或血清；使系列標(biāo)準(zhǔn)品和待定值的健康人混合血漿或血清，同時(shí)分別與已包被的抗體結(jié)合，再使已標(biāo)記的、結(jié)合位點(diǎn)不同于包被在96孔微孔板上的單克隆抗體同時(shí)分別與之結(jié)合，用基質(zhì)液顯色20～30分鐘后終止顯色，10分鐘后測(cè)定上述系列標(biāo)準(zhǔn)品和待定值的健康人混合血漿或血清反應(yīng)后的吸光度；建立系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線并從該曲線查出待定值的健康人混合血漿或血清的載脂蛋白M的濃度，得到定值的健康人混合血漿或血清。
上述方法中，所述稀釋劑是由0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、8gNaCl、0.5ml Tween20、40g聚乙二醇-6000，加去離子水至1000ml配制而成，用5G玻璃漏斗抽濾后備用。
本發(fā)明檢測(cè)方法的測(cè)定范圍是載脂蛋白M含量在0.4g/L～2.5g/l。
本發(fā)明的技術(shù)效果本發(fā)明技術(shù)方案所提供的檢測(cè)方法，確定了抗載脂蛋白M的多克隆抗體必須具有的特性，還確定了它與待檢標(biāo)本的混合比例。由于這種抗載脂蛋白M的多克隆抗體所具有的多種抗原決定簇，為待檢標(biāo)本中所含載脂蛋白M提供了多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，確保二者的反應(yīng)在多處發(fā)生，使反應(yīng)所形成的復(fù)合物更適合用光散射強(qiáng)度或光透射強(qiáng)度的大小來(lái)表示，而且所確定的混合比例，可以確保待檢標(biāo)本的載脂蛋白M能完全與抗載脂蛋白M的多克隆抗體結(jié)合，因此，為新發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白M建立了一種準(zhǔn)確可行的檢測(cè)方法，使載脂蛋白M對(duì)臨床的指導(dǎo)作用及進(jìn)一步研究載脂蛋白M的功能成為可能。本發(fā)明檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單；測(cè)定光透射強(qiáng)度或光散射強(qiáng)度，可采用自動(dòng)化儀器，也可用手工檢測(cè)儀器；作為載脂蛋白M標(biāo)準(zhǔn)品，可用純載脂蛋白M，也可用定值健康人混合血漿或血清，因此，適用性強(qiáng)，特別是采用定值健康人混合血漿或血清作載脂蛋白M標(biāo)準(zhǔn)品，定值后，在-20℃以下至少可穩(wěn)定半年，而且價(jià)格低于純載脂蛋白M，因此可以降低檢測(cè)費(fèi)用。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述，但不局限于此。
以下載脂蛋白M均簡(jiǎn)稱ApoM，所用試劑均為市場(chǎng)采購(gòu)的醫(yī)用試劑，純載脂蛋白M、抗載脂蛋白M的單克隆抗體和多克隆抗體、與抗載脂蛋白M單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)不同的抗載脂蛋白M的單克隆抗體均為發(fā)明人自制并可提供。
一、準(zhǔn)備ApoM標(biāo)準(zhǔn)品1、用純ApoM作標(biāo)準(zhǔn)品將純ApoM(2.6g/l)，先用稀釋劑作1∶200稀釋，再用稀釋劑進(jìn)一步作1∶1、1∶2、1∶4、1∶8倍比稀釋，獲得4種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)ApoM，供作標(biāo)準(zhǔn)曲線用；2、用定值健康人混合血漿作標(biāo)準(zhǔn)品采用酶聯(lián)免疫吸附法確定健康人混合血漿的ApoM含量，具體步驟如下A、準(zhǔn)備下述試劑和儀器①、包被液取1.56gNa2CO3、2.93gNaHCO3和0.20gNaN3用去離子水溶解并稀釋至1000ml，其pH為9.6；②、洗液取0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、8g NaCl、0.5mlTween20，加去離子水至1000ml，其pH為7.4；③、稀釋液含3％牛血清白蛋白的洗液；④、基質(zhì)液H2O2和四甲基聯(lián)苯胺的1∶1混合物，購(gòu)自R&D Systems，目錄號(hào)DY999；⑤、終止液1M H2SO4；⑥、封閉液由1％牛血清白蛋白、5％蔗糖和0.05％的磷酸鹽緩沖液混合而成；⑦、鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶，購(gòu)自R&D Systems，目錄號(hào)DY998；⑧、酶標(biāo)儀型號(hào)為Benchmark，BIO-RAD公司；⑨、96孔微孔板與蛋白質(zhì)有結(jié)合能力。
B、定值健康人混合血漿載脂蛋白M①、包被抗ApoM的單克隆抗體用包被液1∶1稀釋抗ApoM的單克隆抗體(濃度為6.6mg/ml)，在96孔微孔板的每個(gè)孔內(nèi)加100μl，每個(gè)孔內(nèi)約6.6μg，室溫孵育過(guò)夜，確保抗體與微孔板相互作用充分結(jié)合，隨后用洗液吸洗微孔板3次；在每孔再加300μl封閉液，封閉每孔內(nèi)剩余位點(diǎn)，室溫孵育1小時(shí)，確保完全封閉，再用洗液吸洗微孔板2次；將微孔板存放于4℃，備用，使用期6個(gè)月。
②、準(zhǔn)備系列ApoM標(biāo)準(zhǔn)品將起始濃度為2.60g/l標(biāo)準(zhǔn)品ApoM，用稀釋液作1∶1000稀釋，再進(jìn)一步作1∶1、1∶2、1∶4、1∶8倍比稀釋，獲得由4種不同濃度的ApoM標(biāo)準(zhǔn)品組成的系列ApoM標(biāo)準(zhǔn)品，備用；③、準(zhǔn)備待定值健康人混合血漿將待定值健康人混合血漿用50mM NaH2PO4緩沖液作1∶100稀釋，再用稀釋液作1∶10稀釋，備用；④、將上述系列ApoM標(biāo)準(zhǔn)品和待定值健康人混合血漿，分別在已包被的微孔板的每個(gè)孔內(nèi)，各加100μl，空白孔加稀釋液，室溫孵育2小時(shí)，使之與被包被的抗體充分結(jié)合，用洗液吸洗微孔板3次；⑤、先用EZ-Link NHS-PEO固相生物素標(biāo)記試劑盒作成生物素標(biāo)記的ApoM單克隆抗體(該試劑盒的目錄號(hào)21450)，從中取100μl分別加到微孔板各孔內(nèi)，室溫孵育1小時(shí)，再用洗液吸洗微孔板5次；每孔內(nèi)加100μl鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶，與生物素結(jié)合，使酶分別與待定值健康人混合血漿和ApoM標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合，用洗液吸洗微孔板5次；⑥、每孔內(nèi)加入100μl基質(zhì)液，在酶的催化下基質(zhì)液顯色，室溫孵育30分鐘，然后加50μl終止液，10分鐘后用光度計(jì)分別測(cè)定待定值健康人混合血漿和系列標(biāo)準(zhǔn)品在450nm處的吸光度；⑦、建立標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線并從該曲線查出待定值健康人混合血漿的ApoM含量。
測(cè)定范圍在0.25g/l～2.60g/l ApoM。
二、檢測(cè)人血漿中載脂蛋白M實(shí)施例1(以純ApoM作標(biāo)準(zhǔn)品)1、準(zhǔn)備下述試劑和儀器①、稀釋劑取0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、8g NaCl、0.5mlTween20、40g聚乙二醇-6000，加去離子水至1000ml，混合均勻用5G玻璃芯漏斗抽濾后備用，在2～6℃冰箱中可存放半年。本稀釋劑的吸光度A340＜0.05，半年后仍保持此值，可繼續(xù)使用，如＞0.05可再用5G玻璃芯漏斗抽濾后使用；②、精密光度計(jì)為紫外可見(jiàn)光分光度計(jì)751型或全自動(dòng)分析儀為OLYMPUS大型全自動(dòng)生化分析儀AU2700；比濁儀用Beckman比濁儀。
2、準(zhǔn)備抗ApoM多克隆抗體將抗ApoM多克隆抗體用稀釋劑作1∶200稀釋供檢測(cè)使用；3、準(zhǔn)備待檢標(biāo)本抽取人空腹血漿及時(shí)分離后，用稀釋劑作1∶200稀釋，即可進(jìn)行檢測(cè)，密封存放在2～6℃冰箱內(nèi)可在一周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)；-20℃存放半年仍可檢測(cè)；4、取上述準(zhǔn)備好的待檢標(biāo)本100μl和抗ApoM多克隆抗體400μl，在試管內(nèi)混勻后，在25～37℃放置30分鐘，使二者反應(yīng)，751型分光光度計(jì)在340nm處測(cè)定其光透射強(qiáng)度，同時(shí)檢測(cè)ApoM標(biāo)準(zhǔn)品的光透射強(qiáng)度；檢測(cè)時(shí)，取100μl待檢標(biāo)本和400μl稀釋劑在試管內(nèi)混勻作為空白樣；5、用上述測(cè)定數(shù)據(jù)作出ApoM濃度和光透射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線并從中查出待檢標(biāo)本的ApoM含量。
實(shí)施例2(以純ApoM作標(biāo)準(zhǔn)品)1、2、3項(xiàng)按實(shí)施例1操作，然后在AU2700型全自動(dòng)分析儀上，設(shè)定標(biāo)本量(即待檢標(biāo)本)為40μl，試劑量(即抗ApoM多克隆抗體)為160μl，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)為340nm，用已準(zhǔn)備好的ApoM標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)，用稀釋劑作空白，檢測(cè)待檢標(biāo)本ApoM含量，儀器自動(dòng)給出檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例3(以純ApoM作標(biāo)準(zhǔn)品)除用比濁儀(如Beckman比濁儀)代替AU2700型全自動(dòng)分析儀，并設(shè)定待檢標(biāo)本和抗ApoM多克隆抗體反應(yīng)后，立即進(jìn)行光散射強(qiáng)度速率法測(cè)定外，其余操作均同實(shí)施例2。
實(shí)施例4(以定值健康人混合血漿為ApoM標(biāo)準(zhǔn)品)1、準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品取已定值的健康人混合血漿，用稀釋劑調(diào)整其ApoM濃度為2.0g/l、1.5g/l及0.5g/l各一份，獲得3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)ApoM，供作標(biāo)準(zhǔn)曲線用。
除用上述標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線并從該曲線查出待檢標(biāo)本的ApoM濃度外；其余均按實(shí)施例1的操作步驟進(jìn)行。
實(shí)施例5(以定值健康人混合血漿為ApoM標(biāo)準(zhǔn)品)用實(shí)施例4的標(biāo)準(zhǔn)品，采用實(shí)施例3的比濁儀并設(shè)定待檢標(biāo)本和抗ApoM多克隆抗體反應(yīng)后立即進(jìn)行光散射強(qiáng)度速率法測(cè)定，其余操作均同實(shí)施例2。
用實(shí)施例1～5檢測(cè)的ApoM范圍均在0.4g/l～2.5g/l，變異系數(shù)的范圍為6.3％～10.5％。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)載脂蛋白M的免疫比濁法，其特征在于用抗載脂蛋白M的多克隆抗體，與待檢標(biāo)本的載脂蛋白M反應(yīng)，所形成的復(fù)合物引起濁度變化；用光透射強(qiáng)度或光散射強(qiáng)度表征這種變化；從載脂蛋白M標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)光散射強(qiáng)度或光透射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待檢標(biāo)本的載脂蛋白M的含量；其中所用抗載脂蛋白M的多克隆抗體效價(jià)至少為1∶128，不合雜抗體，具有識(shí)別載脂蛋白M多種抗原決定簇；待檢標(biāo)本是人空腹血漿或血清并用稀釋劑作1∶200～300稀釋；抗載脂蛋白M的多克隆抗體與已稀釋的待檢標(biāo)本的混合比為1∶4體積比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫比濁法，其特征在于所述載脂蛋白M標(biāo)準(zhǔn)品是純載脂蛋白M，其濃度為2.6g/l，先用稀釋劑作1∶200稀釋，再作倍比稀釋，作成系列標(biāo)準(zhǔn)品，供作標(biāo)準(zhǔn)曲線用；或者是定值健康人混合血漿或血清，用酶聯(lián)免疫吸附法確定其載脂蛋白M濃度，根據(jù)所定濃度，再用稀釋劑調(diào)整其載脂蛋白M濃度至2.0g/l，1.5g/l及0.5g/l各一份，供作標(biāo)準(zhǔn)曲線用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫比濁法，其特征在于用酶聯(lián)免疫吸附法確定健康人混合血漿或血清的載脂蛋白M濃度的具體步驟是包被只抗載脂蛋白M的單克隆抗體；配制系列載脂蛋白M標(biāo)準(zhǔn)品；準(zhǔn)備待定值的健康人混合血漿或血清；使系列標(biāo)準(zhǔn)品和待定值的健康人混合血漿或血清，同時(shí)分別與已包被的抗體結(jié)合，再使已標(biāo)記的、結(jié)合位點(diǎn)不同于包被在96孔微孔板上的單克隆抗體同時(shí)分別與之結(jié)合，用基質(zhì)液顯色20～30分鐘后終止顯色，10分鐘后測(cè)定上述系列標(biāo)準(zhǔn)品和待定值的健康人混合血漿或血清反應(yīng)后的吸光度；建立系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線并從該曲線查出待定值健康人混合血漿或血清的載脂蛋白M的濃度，得到定值的健康人混合血漿或血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫比濁法，其特征在于所述稀釋劑是由0.2gKH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、8g NaCl、0.5ml Tween20、40g聚乙二醇-6000，加去離子水至1000ml配制而成，用5G玻璃漏斗抽濾后備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)載脂蛋白M的免疫比濁法，該檢測(cè)方法用抗載脂蛋白M的多克隆抗體，與待檢標(biāo)本的載脂蛋白M反應(yīng)，所形成的復(fù)合物引起濁度變化；用光透射強(qiáng)度或光散射強(qiáng)度表征這種變化；從載脂蛋白M標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)光散射強(qiáng)度或光透射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待檢標(biāo)本的載脂蛋白M的含量；其中所用抗載脂蛋白M的多克隆抗體效價(jià)至少為1∶128，不含雜抗體，具有識(shí)別載脂蛋白M多種抗原決定簇；待檢標(biāo)本是人空腹血漿或血清并用稀釋劑作1∶200～300稀釋；抗載脂蛋白M的多克隆抗體與已稀釋的待檢標(biāo)本的混合比為1∶4體積比。為新發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白M確定了一個(gè)簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、適應(yīng)性強(qiáng)的檢測(cè)手段，并使載脂蛋白M對(duì)臨床的指導(dǎo)作用及進(jìn)一步研究其功能提供了可能。
文檔編號(hào)G01N33/536GK1556408SQ20041001386
公開(kāi)日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者徐寧, 徐 寧 申請(qǐng)人:張曉膺