專利名稱：個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
藥物療效和不良反應(yīng)的個(gè)體差異是目前藥物治療過程中的普遍現(xiàn)象。遺傳藥理學(xué)和藥物基因組學(xué)的研究進(jìn)展表明藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體(藥物作用靶點(diǎn))的遺傳變異是造成個(gè)體藥物反應(yīng)差異的主要原因。如細(xì)胞色素氧化酶CYP2D6發(fā)生基因突變，在相同劑量條件下，其所介導(dǎo)代謝的β受體阻滯劑在突變型純合子中的血藥濃度比野生型純合子高2-3倍，如不根據(jù)基因型調(diào)整劑量，突變型純合子患者可能發(fā)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng)；相反，如果β受體發(fā)生功能性突變，在突變型純合子個(gè)體中依然使用β受體阻滯藥，往往會(huì)導(dǎo)致治療失敗，這不僅延誤治療，而且導(dǎo)致了醫(yī)療資源的浪費(fèi)。因此，根據(jù)個(gè)體與藥物治療相關(guān)的代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體的遺傳變異制定不同的治療方案，實(shí)現(xiàn)藥物治療個(gè)體化不僅是當(dāng)今遺傳藥理學(xué)和臨床藥物治療學(xué)的發(fā)展方向，而且具有十分重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。
要實(shí)現(xiàn)根據(jù)病患者基因型來指導(dǎo)對(duì)個(gè)體化用藥，就必須首先測(cè)試病患者的基因變異情況。目前有多種方法可用于檢測(cè)基因型，如測(cè)序、基因芯片、熒光PCR等。這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。國內(nèi)外用于實(shí)驗(yàn)室的基因分型技術(shù)多為測(cè)序、熒光PCR、基因芯片等，這些檢測(cè)方法分別有價(jià)格昂貴、檢測(cè)速度慢、技術(shù)穩(wěn)定性和結(jié)果可靠性較差、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，不易推廣到臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)臨床上藥物治療的個(gè)體差異十分普遍，而個(gè)體化的藥物治療方案難以確定的狀況及現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種檢測(cè)個(gè)體藥物代謝與效應(yīng)相關(guān)基因的基因型的個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用方法。
解決本發(fā)明技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是該個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒含有1、DNA抽提試劑，推薦使用Takara公司的DNA抽提試劑盒，2、PCR試劑，其中包括的引物有正向引物和反向引物，PCR試劑中的正向引物和反向引物能使PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物含有藥物代謝及效應(yīng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的基因片斷，這些突變位點(diǎn)是在人群中的發(fā)生頻率較高，與臨床上針對(duì)某些疾病的藥物的個(gè)體差異關(guān)系密切，且對(duì)這些藥物的藥代動(dòng)力學(xué)或藥效有明顯影響、有應(yīng)用價(jià)值的突變位點(diǎn)(下向和反向引物擴(kuò)增含有藥物代謝及效應(yīng)相關(guān)的基因突變位點(diǎn)的DNA序列，根據(jù)藥物基因組學(xué)的研究結(jié)果，這些突變位點(diǎn)在人群中的發(fā)生率較高，且對(duì)某些疾病的臨床常用藥的藥代動(dòng)力學(xué)或藥效有明顯影響，基因突變位點(diǎn)的確定是根據(jù)臨床上對(duì)某些疾病的常用藥查找與其藥效的個(gè)體差異關(guān)系密切，發(fā)生頻率比較高、有應(yīng)用價(jià)值的突變位點(diǎn))，還包括雙蒸水(ddH2O)、Taq酶、Taq酶附帶的PCR緩沖液、dNTP、MgCl2溶液；3、酶切試劑，包括內(nèi)切酶、酶切緩沖液；4、電泳試劑，包括瓊脂糖、溴乙錠、加樣緩沖液5、標(biāo)準(zhǔn)品，包括野生型質(zhì)粒DNA、突變型質(zhì)粒DNA。
本試劑盒采用的是PCR-RFLP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性酶切片段長度多態(tài)性)方法。采用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)基因型具有穩(wěn)定、可靠、價(jià)格便宜、較快速的優(yōu)點(diǎn)。適于推廣到臨床使用。
應(yīng)用本發(fā)明個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者基因型的方法，其特征是取患者外周血1～2ml，使用試劑盒中的DNA抽提試劑提取DNA，用試劑盒中的PCR試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用試劑盒中的酶切試劑作限制性內(nèi)切酶消化，再用試劑盒中的電泳試劑進(jìn)行凝膠電泳分析，之后判讀基因型，提供個(gè)體化用藥指導(dǎo)意見。
利用本發(fā)明試劑盒和檢測(cè)患者基因型的方法能根據(jù)所檢測(cè)的各種疾病患者基因型指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥，降低藥物不良反應(yīng)發(fā)生率，減少患者調(diào)整用藥方案的次數(shù)，從而大大減輕患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。


圖1為使用本發(fā)明個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者基因型的方法流程圖具體實(shí)施方式
下面以潰瘍病個(gè)體化藥物治療基因型檢測(cè)試劑盒為實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
消化性潰瘍是一種常見病，多發(fā)生在胃或十二指腸球部，統(tǒng)稱為“潰瘍病”。潰瘍病多見于青壯年，或者生活節(jié)奏緊張，飲食不規(guī)律的人，約百分之八十的患者發(fā)病年齡在40歲以下，而這個(gè)年齡正處于精力充沛的階段，因此，潰瘍病的防治對(duì)于人們和社會(huì)都有重要的意義。根據(jù)大量統(tǒng)計(jì)數(shù)字，潰瘍病是引起上消化道出血最常見的疾病。中國人群中潰瘍病患病率為5～10％(男女患病率比例為3.6∶1)。潰瘍病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。保守估計(jì)，我國潰瘍病患者人數(shù)超過了6千萬。減少胃酸分泌和抗幽門螺旋桿菌感染是目前和今后相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)治療潰瘍病的主要途徑。拉唑類藥物具有強(qiáng)大的抑制胃酸分泌作用，在治療潰瘍病的藥物中占有重要的位置。據(jù)統(tǒng)計(jì)，奧美拉唑可使90％的難治性潰瘍(病程經(jīng)12周尚未治愈)愈合。然而，因代謝拉唑類藥物的CYP2C19酶存在基因變異，對(duì)于CYP2C19酶為弱代謝者的個(gè)體，在使用臨床常用劑量的條件下，其血藥濃度較高，治療效果明顯優(yōu)于強(qiáng)代謝者。但是，又不能因此提高臨床藥物使用劑量，否則，會(huì)導(dǎo)致部分弱代謝者體內(nèi)血藥濃度過高，發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，按照潰瘍病患者的基因型，給予合適的藥物劑量，是改善拉唑類藥物的療效，減少不良反應(yīng)的有效手段，并最終達(dá)到提高潰瘍病患者治愈率的目的。
根據(jù)臨床上對(duì)潰瘍病人的常用藥查找與其代謝及藥效的個(gè)體差異關(guān)系密切的基因突變位點(diǎn)，并選擇在中國人中發(fā)生頻率比較高、有應(yīng)用價(jià)值的2個(gè)基因突變位點(diǎn)CYP2C19*2和CYP2C19*3，制做檢測(cè)這2個(gè)突變位點(diǎn)的基因型檢測(cè)試劑盒。
潰瘍病個(gè)體化藥物治療基因型檢測(cè)試劑盒用途體外檢測(cè)個(gè)體細(xì)胞色素P450酶2C19的基因型。本試劑盒采用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增待測(cè)個(gè)體的DNA，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切片段長度多態(tài)性分析，從而得出待測(cè)個(gè)體CYP2C19的基因型。
檢測(cè)患者基因型測(cè)定原理PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是利用兩條與DNA鏈互補(bǔ)并位于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸引物，和DNA聚合酶經(jīng)酶促反應(yīng)體外擴(kuò)增特異性DNA片段的技術(shù)。它包括三個(gè)基本步驟(1)變性(Denature)目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈成單鏈DNA，以提供復(fù)制的模板；(2)退火(Anneal)加入的寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的靶序列通過氫鍵配對(duì)；(3)延伸(Extension)DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理進(jìn)行合成。由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)后靶DNA的拷貝數(shù)增加一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，通常經(jīng)30-35輪循環(huán)就可合成足夠量靶DNA。PCR產(chǎn)物可用于進(jìn)一步分析。
人類基因組中存在許多限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用某種限制性內(nèi)切酶對(duì)某一段基因消化時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大小不同的特定片段即限制性片段。核苷酸缺失，重排或置換可使DNA分子中原有的某種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致原有的酶切位點(diǎn)消失或形成新的內(nèi)切位點(diǎn)。因此用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶切后形成的DNA片段長度或數(shù)目多態(tài)性可以反映基因的變異情況。
本試劑盒通過對(duì)CYP2C19基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用特異性的內(nèi)切酶進(jìn)行消化，得到與基因型相對(duì)應(yīng)的不同長度DNA片段。再利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段長度多態(tài)性，從而得出個(gè)體的CYP2C19基因型。
潰瘍病個(gè)體化藥物治療基因型檢測(cè)試劑盒中試劑的組成和配制1.基因組DNA抽提試劑推薦采用寶生物的DNA提取試劑盒。
2.PCR反應(yīng)體系CYP2C19*2擴(kuò)增體系見表1PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5分鐘，然后按94℃變性20秒鐘、53℃退火20秒鐘、72℃延伸20秒鐘循環(huán)35輪，最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下延伸5分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。所用的引物序列見表3中的P1(正向引物)、P2(反向引物)；CYP2C19*3擴(kuò)增體系見表2PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5分鐘，然后按94℃變性20秒鐘、53℃退火20秒鐘、72℃延伸20秒鐘循環(huán)35輪，最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下延伸5分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
所用的引物序列見表3中的P3(正向引物)、P4(反向引物)；3.酶切體系2C19*2SmaI1μl，10×A Buffer2μl，0.1％BSA(小牛血清白蛋白)2μl，ddH2O5μl，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物10μl2C19*3BamHI1μl，10×B Buffer2μl，ddH2O7μl，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物10μl緩沖液(Buffer)成分見表4；4、電泳試劑(需自備試劑)3％瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液(0.5×TBE)，溴化乙錠(100ug/ml)5μl，加樣緩沖液50μl；
5、標(biāo)準(zhǔn)品CYP2C19*2野生型質(zhì)粒DNA 6μl(含有經(jīng)引物P1、P2擴(kuò)增的CYP2C19*2野生型PCR產(chǎn)物序列)CYP2C19*2突變型質(zhì)粒DNA 6μl(含有經(jīng)引物P1、P2擴(kuò)增的CYP2C19*2突變型PCR產(chǎn)物序列)CYP2C19*3野生型質(zhì)粒DNA 6μl(含有經(jīng)引物P3、P4擴(kuò)增的CYP2C19*3野生型PCR產(chǎn)物序列)CYP2C19*3突變型質(zhì)粒DNA 6μl(含有經(jīng)引物P3、P4擴(kuò)增的CYP2C19*3突變型PCR產(chǎn)物序列)使用儀器微量移液槍及tip頭(槍頭)，DNA擴(kuò)增儀(Thermo Hybaid)，電泳儀，電泳槽，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，恒溫水浴鍋。
標(biāo)本采集和處理a.靜脈血1ml；EDTA抗凝(7.2mg/5ml全血)，最好不用肝素抗凝；；b.如當(dāng)日不進(jìn)行DNA提取，保存于4℃條件下，有效期4天；保存于-80℃條件下，可保存兩個(gè)月。
使用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)潰瘍病個(gè)體化藥物治療基因型方法(檢測(cè)步驟)如下1.基因組DNA提取以采用寶生物公司DNA提取試劑盒處理100μl的EDTA抗凝全血為例，準(zhǔn)備1.5ml離心管，加入GenTLE Solution I 500μl；把混合均勻的100μl血液，加入到上述離心管中，立即振蕩幾秒鐘；室溫放置10分鐘以上，然后室溫(離心溫度低會(huì)對(duì)收量和純度有影響，請(qǐng)于20℃以上離心)條件下12,000rpm以上離心5分鐘，離心時(shí)，注意離心管在離心機(jī)里的擺放方向統(tǒng)一；用移液槍小心地除去混合物，注意槍頭不要碰到離心管外側(cè)的內(nèi)壁，插至離心管內(nèi)側(cè)的底部，將混合物吸取干凈；加入1ml的GenTLE Solution II，沿離心管內(nèi)側(cè)的內(nèi)壁加入；輕柔地上下顛倒離心管數(shù)次，室溫12,000rpm以上離心2分鐘，用移液槍小心地除去上清；向離心管中加入GenTLE SolutionIII 500μl，輕微振蕩10秒鐘充分混合；室溫12,000rpm離心5分鐘，把上清移入另一個(gè)新的離心管中；加入等體積(500μl)的異丙醇，上下輕柔顛倒數(shù)次，直至看見白色絲狀DNA；4℃，12,000rpm離心5分鐘，小心除去上清；加入1ml的70％乙醇清洗沉淀，4℃，12,000rpm離心5分鐘，小心除去上清；簡(jiǎn)單干燥沉淀；以10-50μl適當(dāng)?shù)木彌_液如TE緩沖液溶解沉淀。
2.PCR反應(yīng)PCR各組分濃度A管CYP2C19*2基因擴(kuò)增 B管CYP2C19*3基因擴(kuò)增ddH2O 13.8μlddH2O 13.8μl10×PCRBuffer2.5μl10×PCRBuffer2.5μldNTP2μl dNTP2μlP1 0.25μlP1 0.25μlP2 0.25μlP2 0.25μlTaq 0.2μl Taq 0.2μlMgCl25μl MgCl25μlgDNA1μl gDNA1μlC管空白對(duì)照 D管陰性對(duì)照ddH2O 14.8μlddH2O 13.8μl10×PCRBuffer 2.5μl 10×PCRBuffer 2.5μldNTP2μl dNTP 2μlP1 0.25μlP1 0.25μlP2 0.25μlP2 0.25μlTaq 0.2μl Taq 0.2μlMgCl25μl MgCl25μl陰性對(duì)照DNA 1μlE管陽性對(duì)照ddH2O 13.8μl10×PCRBuffer2.5μldNTP 2μlP1 0.25μlP2 0.25μlTaq0.2μlMgCl25μl陽性對(duì)照DNA 1μlPCR反應(yīng)體系為25μl，在0.2ml離心管中進(jìn)行，依次加入下列試劑ddH2O13.8μl，MgCl25μl，Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，P1 0.25μl，P2 0.25μl，Taq 0.2μl，gDNA 1μl，最后加酶和DNA；混勻后稍離心，按PCR反應(yīng)程序開始擴(kuò)增94℃預(yù)變性5分鐘，然后94℃變性20秒鐘，53℃退火20秒鐘，72℃延伸20秒鐘，循環(huán)35輪，最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下延伸5分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
3.酶切分析A管將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.2ml)編號(hào)，用微量移液槍分別加入DNA 10μl和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×A緩沖液2μl，0.1％BSA2μl，再加入ddH2O5μl使總體積為19μl，將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl SmaI酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低。
混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷?如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保溫4小時(shí)，使酶切反應(yīng)完全。
每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> B管將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.2ml)編號(hào)，用微量移液槍分別加入DNA 10μl和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×B緩沖液2μl，再加入ddH2O7μl使總體積為19μl，將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl BamHI酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低。
混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷?如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保溫4小時(shí)，使酶切反應(yīng)完全。
每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 4.瓊脂糖凝膠的制備及電泳a、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀釋緩沖液，待用。
b、膠液的制備稱取2.5g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入100ml0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為2.5％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)。
c、膠板的制備將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液5μl。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起，阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。
d、加樣取9μl酶解液與1μl 10×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
e、電泳加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?00V，時(shí)間30分鐘后停止電泳。
f、觀察和拍照在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6，曝光時(shí)間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。
5.根據(jù)基因型檢測(cè)結(jié)果，提出潰瘍病個(gè)體化用藥方案，見表8。
質(zhì)量控制設(shè)置陰陽性對(duì)照。正常操作條件下，陰性對(duì)照無電泳條帶，陽性對(duì)照則可顯示基因型特異的電泳條帶。
結(jié)果判斷方法用SmaI內(nèi)切酶消化后，電泳結(jié)果與基因型關(guān)系見表5；用BamHI內(nèi)切酶消化DNA后，電泳結(jié)果與基因型關(guān)系見表6試劑盒保存條件和效期保存條件如不打算立即試驗(yàn)，上述體系請(qǐng)保存于4℃冰箱中注意事項(xiàng)a.PCR操作各階段應(yīng)在不同的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，合理分隔實(shí)驗(yàn)室將樣品的處理，配制PCR反應(yīng)液，PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其他步驟嚴(yán)格分開，最好能劃分標(biāo)本處理區(qū)，PCR反應(yīng)液制備區(qū)，PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)，PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用。
b.PCR操作每個(gè)階段使用專用的儀器和設(shè)備；c.PCR實(shí)驗(yàn)中注意事項(xiàng)加樣時(shí)請(qǐng)注意先加容量最大的溶液，最后加酶及DNA；在加樣時(shí)，注意不要將tip頭過度的深入液面以下，以防tip頭帶出少量液體導(dǎo)致各種反應(yīng)體系不準(zhǔn)確。吸樣時(shí)則要慢，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染。
完成加樣后，請(qǐng)蓋緊eppendorf管蓋，以手指彈勻，在離心機(jī)上快速離心數(shù)秒，保證體系的穩(wěn)定。
所用的酶在常溫下具有活性，在進(jìn)行上述操作步驟時(shí)請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行。
所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，或預(yù)先配制好PCR反應(yīng)液，然后小量分裝。可以將多組體系相同的溶液加入一個(gè)管中，混勻后再分別加入到各自管中。如要做10管PCR，則可按表7配制反應(yīng)體系待混勻，分裝到10個(gè)管中(每管24μl)后，再分別加入gDNA 1μl。
d.使用自卸管(滴頭)移液器(加樣器)或填塞性滴管(滴頭)；e.在試劑和標(biāo)本準(zhǔn)備階段使用負(fù)壓超凈工作臺(tái)；f.穿工作服和一次性手套；g.在每批檢測(cè)中設(shè)置陰陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)；h.具有專門經(jīng)驗(yàn)和培訓(xùn)過的人員進(jìn)行操作；i.使用一次性用品，并用10％次氯酸或70％酒精或紫外線燈處理工作臺(tái)和加樣器；j.EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。
標(biāo)準(zhǔn)品使用說明標(biāo)準(zhǔn)品為經(jīng)過提純的質(zhì)粒DNA，濃度為0.02μg/μl?？砂凑丈鲜鯬CR、酶切、電泳條件分析。
實(shí)驗(yàn)室結(jié)果經(jīng)過小批量樣本的驗(yàn)證，PCR-RFLP檢測(cè)vs測(cè)序符合率為100％。見表9。
表1

表2

表3引物序列

4緩沖液成分

表5

表6

表7

表8

表9潰瘍病個(gè)體化藥物治療試劑盒驗(yàn)證結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有(1)、DNA抽提試劑，(2)、PCR試劑，其中包括正向引物、反向引物、Taq酶、Taq酶附帶的PCR緩沖液、dNTP、MgCl2溶液、雙蒸水(ddH2O)，(3)、酶切試劑，包括內(nèi)切酶、酶切緩沖液，(4)、電泳試劑，包括瓊脂糖、溴乙錠、加樣緩沖液，(5)、標(biāo)準(zhǔn)品，包括野生型質(zhì)粒DNA、突變型質(zhì)粒DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于PCR試劑中的正向引物和反向引物能使PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物含有藥物代謝及效應(yīng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的基因片斷，這些突變位點(diǎn)是在人群中的發(fā)生頻率較高，與臨床上針對(duì)某些疾病的藥物的個(gè)體差異關(guān)系密切，且對(duì)這些藥物的藥代動(dòng)力學(xué)或藥效有明顯影響、有應(yīng)用價(jià)值的突變位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于用于檢測(cè)潰瘍病個(gè)體基因中CYP2C19*2的PCR試劑中的正向引物(P1)為5’-CAGAGCTTGGCATATTGTATC-3’反向引物(P2)為5’-GTAAACACACAACTAGTCAAT-3’
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于用于檢測(cè)潰瘍病個(gè)體基因中CYP2C19*3的PCR試劑中的正向引物(P3)為5’-AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT-3’反向引物(P4)為5’-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于酶切試劑中的內(nèi)切酶為SmaI內(nèi)切酶、BamHI內(nèi)切酶；酶切緩沖液為
6.一種應(yīng)用個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者基因型的方法，其特征是取患者外周血1～2ml，使用試劑盒中的DNA抽提試劑提取DNA，用試劑盒中的PCR試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用試劑盒中的酶切試劑作限制性內(nèi)切酶消化，再用試劑盒中的電泳試劑，制備瓊脂糖凝膠，進(jìn)行凝膠電泳分析，之后判讀基因型，提供個(gè)體化用藥指導(dǎo)意見。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者基因型的方法，其特征是檢測(cè)潰瘍病個(gè)體化藥物治療基因型步驟中DNA提取采用寶生物公司DNA提取試劑盒處理100μl的EDTA抗凝全血準(zhǔn)備1.5ml離心管，加入GenTLE Solution I 500μl；把混合均勻的100μl血液，加入到上述離心管中，立即振蕩幾秒鐘；室溫放置10分鐘以上，然后室溫(離心溫度低會(huì)對(duì)收量和純度有影響，請(qǐng)于20℃以上離心)條件下12,000rpm以上離心5分鐘，離心時(shí)，注意離心管在離心機(jī)里的擺放方向統(tǒng)一；用移液槍小心地除去混合物，注意槍頭不要碰到離心管外側(cè)的內(nèi)壁，插至離心管內(nèi)側(cè)的底部，將混合物吸取干凈；加入1ml的GenTLE Solution II，沿離心管內(nèi)側(cè)的內(nèi)壁加入；輕柔地上下顛倒離心管數(shù)次，室溫12,000rpm以上離心2分鐘，用移液槍小心地除去上清；向離心管中加入GenTLE SolutionIII 500μl，輕微振蕩10秒鐘充分混合；室溫12,000rpm離心5分鐘，把上清移入另一個(gè)新的離心管中；加入等體積(500μl)的異丙醇，上下輕柔顛倒數(shù)次，直至看見白色絲狀DNA；4℃，12,000rpm離心5分鐘，小心除去上清；加入1ml的70％乙醇清洗沉淀，4℃，12,000rpm離心5分鐘，小心除去上清；簡(jiǎn)單干燥沉淀；以10-50μl適當(dāng)?shù)木彌_液如TE緩沖液溶解沉淀。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者基因型的方法，其特征是PCR反應(yīng)體系為25μl，在0.2ml離心管中進(jìn)行，依次加入下列試劑ddH2O 13.8μl，MgCl25μl，Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，P1 0.25μl，P20.25μl，Taq 0.2μl，gDNA 1μl，最后加酶和DNA；混勻后稍離心，按PCR反應(yīng)程序開始擴(kuò)增94℃預(yù)變性5分鐘，然后94℃變性20秒鐘，53℃退火20秒鐘，72℃延伸20秒鐘，循環(huán)35輪，最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下延伸5分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者基因型的方法，其特征是酶切分析A管將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.2ml)編號(hào)，用微量移液槍分別加入DNA 10μl和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×T緩沖液2μl，0.1％BSA2μl，再加入ddH2O 5μl使總體積為19μl，將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl SmaI酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，要防止錯(cuò)加，漏加，使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低，混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷?如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保溫4小時(shí)，使酶切反應(yīng)完全，每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆茫籅管將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.2ml)編號(hào)，用微量移液槍分別加入DNA 10μl和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×K緩沖液2μl，再加入ddH2O7μl使總體積為19μl，將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl BamHI酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低，混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷?如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保溫4小時(shí)，使酶切反應(yīng)完全，每管加入2μl0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者基因型的方法，其特征是瓊脂糖凝膠的制備及電泳為a、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀釋緩沖液，待用，b、膠液的制備稱取2.5g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入100ml0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里或電爐上加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為2.5％瓊脂糖凝膠液，加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液，加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)，c、膠板的制備將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏，寬約1cm，緊密封住，將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙，向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液5μl，用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡，待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面，因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起，阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液，d、加樣取9μl酶解液與1μl 10×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量，每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿，e、電泳加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?00V，時(shí)間30分鐘后停止電泳，f、觀察和拍照在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶，經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6，曝光時(shí)間10-120秒，根據(jù)熒光條帶的深淺選擇。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用方法。個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有(1)DNA抽提試劑，(2)PCR試劑，其中包括正向引物、反向引物，正向引物和反向引物能使PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為含有藥物代謝及效應(yīng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的基因片斷。(3)酶切試劑，包括內(nèi)切酶、酶切緩沖液，(4)電泳試劑，包括瓊脂糖、溴乙錠、加樣緩沖液，(5)標(biāo)準(zhǔn)品，包括野生型質(zhì)粒DNA、突變型質(zhì)粒DNA。應(yīng)用本發(fā)明個(gè)體化用藥基因型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者基因型的方法，其特征是取患者外周血1～2ml，使用試劑盒中的DNA抽提試劑提取DNA，用試劑盒中的PCR試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用試劑盒中的酶切試劑作限制性內(nèi)切酶消化，再用試劑盒中的電泳試劑，制備瓊脂糖凝膠，進(jìn)行凝膠電泳分析，之后判讀基因型，提供個(gè)體化用藥指導(dǎo)意見。
文檔編號(hào)G01N27/447GK1690702SQ200410023138
公開日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者周宏灝, 趙震宇 申請(qǐng)人:周宏灝, 趙震宇