專(zhuān)利名稱(chēng)：鼻咽組織特異性基因編碼蛋白的檢測(cè)試劑盒、制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物物質(zhì)的免疫學(xué)檢測(cè)，具體涉及一種分泌性蛋白的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(NPC)是我國(guó)南方常見(jiàn)的惡性腫瘤，廣東為高發(fā)區(qū)。鼻咽癌是指鼻咽粘膜上皮發(fā)生的癌腫，大多為低分化鱗癌，其惡性度高，發(fā)病部位隱蔽，特別是在咽隱窩和鼻咽頂部者，早期癥狀不明顯，因而難以早期發(fā)現(xiàn)，誤診誤治率較高，可達(dá)12.2％，因而在確診的鼻咽癌中，其5年生存率長(zhǎng)期徘徊在50％～60％左右。對(duì)鼻咽癌進(jìn)行早期診斷以便早期治療，提高患者的生存率一直是NPC臨床研究的重要課題之一。目前對(duì)鼻咽癌早期的檢測(cè)方法有多種，包括有EB病毒血清學(xué)標(biāo)記物如病毒殼抗原一免疫球蛋白A(EBVCA 2IgA)、EB病毒潛伏膜蛋白、EB病毒早期復(fù)合抗原(EBV 2-EA)IgG的抗體檢測(cè)，鼻咽癌相關(guān)腫瘤標(biāo)記物如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、細(xì)胞間黏附分子、CYFRA2121以及端粒酶等的檢測(cè)。雖然這些指標(biāo)的單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用為鼻咽癌的診斷提供了有用的信息，然而它們均缺乏足夠的靈敏度與特異性。我們知道，EB病毒不但與鼻咽癌的發(fā)生有關(guān)，而且與Burkitt淋巴瘤、上呼吸道的感染等密切相關(guān)，近來(lái)也有報(bào)道在各種T細(xì)胞淋巴瘤中檢測(cè)到EB病毒DNA，因而鼻咽癌患者EB病毒抗體與病理確診相比陽(yáng)性符合率僅為為72.6％～77.3％。而且并非所有鼻咽癌的發(fā)生均與EB病毒相關(guān)，90％以上人群在成年前都感染過(guò)EBV，在NPC患者血清中檢測(cè)到EBV也并不能證明EBV直接與NPC有關(guān)。因此，雖然EB病毒相關(guān)抗體滴度與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有很高的相關(guān)性，其檢測(cè)方法也有優(yōu)越性，但仍然只能作為一種相關(guān)指標(biāo)而起提示作用，不能用來(lái)作為鼻咽癌的確診指標(biāo)。如果缺少病理診斷，即使EB病毒相關(guān)抗體滴度再高，也難以作為實(shí)施放療和化療的依據(jù)。除了對(duì)晚期鼻咽癌的病理性診斷外，目前尚沒(méi)有其他的早期、無(wú)創(chuàng)性檢查方法；即使是病理性診斷，也難以一次性取到病變組織，無(wú)法避免對(duì)微小病灶的多次有創(chuàng)性取樣。鼻咽癌非典型病灶型或粘膜下型的病例雖經(jīng)多次活檢，常因無(wú)病理切片陽(yáng)性結(jié)果而延誤治療；對(duì)于放療后的病例，當(dāng)其鼻咽組織表現(xiàn)不典型時(shí)，在判斷其病變是復(fù)發(fā)還是放療反應(yīng)上，也左右為難，尤其是某些放療后出現(xiàn)顱腦癥狀的患者，各項(xiàng)檢查(包括病理檢查)都很難準(zhǔn)確判斷到底是放射性腦病還是癌灶向顱內(nèi)發(fā)展，極大地影響治療決策。綜上所述，建立一種能對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行篩查、診斷的無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)方法，對(duì)鼻咽癌的早期篩查、診斷、預(yù)防及治療等具有重要意義。
通過(guò)抑制性消減雜交聯(lián)合cDNA微陣列技術(shù)，我們克隆了上呼吸道特異性表達(dá)的鼻咽癌易感基因候選者——NASG，(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2139605.1，基因序列登錄號(hào)AF439448)。我們通過(guò)對(duì)新克隆的NASG基因(又稱(chēng)SPLUNC基因)的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NASG蛋白是一種分泌性蛋白，在正常人及鼻咽部慢性炎癥患者的鼻咽組織中表達(dá)豐富，而在鼻咽癌患者的鼻咽組織中表達(dá)顯著下調(diào)。因而如何通過(guò)檢測(cè)NASG蛋白的含量以及如何無(wú)創(chuàng)傷地獲取NASG蛋白則是建立早期、無(wú)創(chuàng)傷檢測(cè)需要解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在通過(guò)制備一種NASG蛋白檢測(cè)試劑盒，從鼻咽部取得分泌物檢測(cè)NASG蛋白的含量從而實(shí)現(xiàn)對(duì)早期鼻咽癌患者的無(wú)創(chuàng)傷快速診斷。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案為一種鼻咽組織特異性基因編碼蛋白NASG的檢測(cè)試劑盒，包括包被好的酶標(biāo)板、HRP標(biāo)記二抗，通用試劑Tween-20和顯色底物四甲基聯(lián)苯胺TMB，該試劑盒的酶標(biāo)板孔內(nèi)為經(jīng)包被液處理和阻滯液處理的NASG融合蛋白抗體，另配備有辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的兔抗NASG多肽抗體；試劑盒酶標(biāo)板孔內(nèi)的NASG融合蛋白抗體的濃度以1mg/ml為佳。鼻咽組織特異性基因編碼蛋白NASG的檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括兔抗人多肽抗體的制備，兔抗人NASG融合蛋白抗體的制備，(1)、制備兔抗人多肽抗體時(shí)，根據(jù)NASG的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并合成21個(gè)氨基酸的多肽序列為Cys，Lys，Val，The，Asp，Pro，Gln，Leu，Leu，Glu，Leu，Gly，Leu，Val，Gln，Ser，Pro，Asp，Gly，His，Arg；(2)、將兔抗人NASG融合蛋白抗體，用包被緩沖液稀釋至1ug/ml加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，4℃包被過(guò)夜；(3)、倒去未包被的液體，用含0.1％Tween-20磷酸鹽緩沖液PBST沖洗后加入含0.5％牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液PBST，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗脫，放4℃保存?zhèn)溆谩?br> 鼻咽組織特異性基因編碼蛋白測(cè)驗(yàn)試劑盒應(yīng)用于作為鼻咽癌早期診斷指標(biāo)的人體鼻咽分泌物中NASG蛋白含量的檢測(cè)方法為(1)、鼻咽分泌物的獲取生理鹽水沖洗鼻腔，用細(xì)棉簽在鼻視鏡下插到鼻咽部，放置5～8分鐘，取出棉簽，將棉球放入底部空心、外套有離心收集管的小離心管中，在4℃下7500xg離心獲取鼻咽分泌物；(2)、將獲取的抗原-鼻咽分泌物按1∶10用生理鹽水稀釋后，加入到若干個(gè)試劑盒的酶標(biāo)板孔中，同時(shí)在若干個(gè)未加待測(cè)抗原的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入純化的NASG基因重組蛋白做標(biāo)準(zhǔn)樣；37℃條件下，在100轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中孵育3小時(shí)，用PBST洗去未結(jié)合的鼻咽分泌物，吸干殘余液體；(3)將HRP標(biāo)記的兔抗人NASG多肽抗體加入到已加抗原的酶標(biāo)板中，孵育后洗去未結(jié)合抗體，加入顯色底物TMB，室溫放置20分鐘，加入到2M的硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀420nm的波長(zhǎng)讀數(shù)、計(jì)量；(4)將測(cè)得的濃度與正常人群鼻咽分泌物中NASG濃度對(duì)比，判斷患者鼻咽分泌物中蛋白含量的高低。


下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明圖1為從大腸桿菌中誘導(dǎo)的NASG-GST融合蛋白；圖2為抗體包被到酶標(biāo)板后制備的ELISA檢測(cè)試劑盒；圖3為Western blot檢測(cè)NASG在正常鼻咽分泌物和鼻咽癌分泌物中的表達(dá)；1，3，4鼻咽癌患者鼻咽分泌物；2，5-8；正常人及慢性炎癥病人鼻咽分泌物圖4為NASG在正常鼻咽組織和鼻咽癌活檢標(biāo)本中的表達(dá)ANorthern blot，I鼻咽癌組織，II正常組織，BRT-PCR；.1，2.正常成人鼻咽 3.人胚鼻咽4.HNE1 5～8.NPC活檢標(biāo)本一、NASG(SPLUNC)的ELISA試劑盒的制備1、NASG(SPLUNC)抗體的制備1)、制備兔抗人的多肽抗體①、根據(jù)NASG的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成21個(gè)氨基酸的NASG多肽，該多肽的序列為Cys，Lys，Val，The，Asp，Pro，Gln，Leu，Leu，Glu，Leu，Gly，Leu，Val，Gln，Ser，Pro，Asp，Gly，His，Arg，將多肽與鑰孔戚血藍(lán)素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)交聯(lián)以增加免疫原性。
②、將多肽溶于磷酸鹽(PBS)緩沖液，注射至新西蘭家兔，首次劑量為300μg/kg，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量的1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次，共免疫4次，獲得的抗血清用Pierce公司的親和層析純化試劑盒(具體步驟嚴(yán)格按Pierce公司的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)純化出抗NASG(PLUNC)的IgG(NASG抗體1)；2)、制備兔抗人的NASG融合蛋白抗體①、PCR擴(kuò)增NASG的全長(zhǎng)，將其克隆至帶GST靶標(biāo)志的原核表達(dá)載體PGEX，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，于30℃下用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)NASG蛋白的表達(dá)，用發(fā)瑪西亞公司的GST蛋白純化試劑盒純化出NASG-GST融合蛋白(圖1)(具體操作嚴(yán)格按公司的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。
②、用該融合蛋白免疫新西蘭白兔，制備兔抗人的抗體(NASG抗體2)并用親和層析純化(方法同前述多肽抗體)。
3)、多肽融合蛋白抗體的效價(jià)與特異性檢測(cè)①、將合成的多肽用包被緩沖液(稱(chēng)取8.4克碳酸氫鈉，3.56克碳酸鈉溶于1升去離子水中，調(diào)PH值至9.50)溶解為10ug/ml，按100ul/孔加到96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。
②、取出酶標(biāo)板，倒掉包被緩沖液，含0.1％Tween-20的PBS(PBST)沖洗3遍，加入200ul阻滯液(含1％牛血清白蛋白的PBST)阻止非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗脫2次。
③、按1∶500；1∶1000；1∶2000；1∶5000∶1∶10000；1∶100000；1∶1000000共7個(gè)稀釋度(稀釋液在一升去離子水中溶解80克氯化鈉，11.6克磷酸氫二鈉，2克磷酸二氫鉀，2克氯化鉀，調(diào)PH值至7.2)加入前面兩種NASG抗血清。37℃孵育1小時(shí)，PBST洗3次。
④、加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，37℃孵育45分鐘，PBST洗5次。
⑤、混合6ml四甲基聯(lián)苯胺(TMB)試劑A與6ml TMB試劑B，100ul/孔加入到96孔板，室溫孵育15分鐘，可見(jiàn)抗體檢測(cè)陽(yáng)性的孔呈藍(lán)色，我們制備抗體的效價(jià)可達(dá)到1∶1000000。
⑥、取鼻咽分泌物及鼻咽癌細(xì)胞株裂解液(50mM Tris，150mM NaCl，1mM 乙二胺四乙酸二鈉，1％Triton X-100，PH8.0)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，按常規(guī)程序進(jìn)行Western blot分析，ECL發(fā)光，放射自顯影，常規(guī)洗片?？梢?jiàn)鼻咽分泌物及鼻咽癌細(xì)胞株裂解液中僅有一條目的條帶，說(shuō)明我們所制作的抗體具有高度的特異性。
2、NASG的ELISA檢測(cè)試劑盒的制備1)、包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇按照Pierce公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定抗體及抗原的濃度。然后采用標(biāo)準(zhǔn)的棋盤(pán)測(cè)定方法，用包被緩沖液(配方同前)將NASG融合蛋白抗體(抗體2)稀釋至濃度為10、1、0.1ug/ml，分別在ELISA板上包被，每一濃度包括三個(gè)縱行，4℃過(guò)夜，PBST洗滌3次。在其中一個(gè)橫行的的各包被孔中加入強(qiáng)陽(yáng)性抗原液(10ug/ml的NASG-GST融合蛋白)，另一橫行中加入弱陽(yáng)性抗原液(0.001ug/ml的NASG-GST融合蛋白)，第三行加入陰性對(duì)照。37℃保溫2小時(shí)，PBST洗滌4次。加入HRP標(biāo)記的NASG多肽抗體(酶標(biāo)抗體1)，37℃保溫1小時(shí)，PBST洗滌3次。加入TMB底物，室溫放置15分鐘，加入終止液(2M H2SO4)，酶標(biāo)儀上讀數(shù)，從而選擇包被抗體的濃度為1ug/ml。
2)、試劑盒的批量制備①、將兔抗人的NASG融合蛋白抗體用包被緩沖液稀釋至1ug/ml，將其加入到96孔酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜。
②、倒去未包被的液體，含0.1％Tween-20的PBS(PBST)沖洗3遍，加入200ul阻滯液阻止非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗脫2次。放4℃批量保存?zhèn)溆?圖2)。
③、試劑盒的其它試劑如HRP標(biāo)記的兔抗NASG抗體按用量分裝，通用試劑如Tween-20，TMB從Pierce公司購(gòu)置并分裝。
3)、靈敏性、特異性、穩(wěn)定性的檢測(cè)①、將NASG蛋白用PBS稀釋成200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，10ug/ml，2ug/ml，0.5ug/ml，0.05ug/ml，0.01ug/ml，0ug/ml，每孔100ul加入到上述包被好的酶標(biāo)板中，37℃孵育2小時(shí)。含0.1％Tween-20的PBS(PBST)沖洗3遍。
②、按1∶1000將HRP-NASG抗體稀釋?zhuān)靠准尤?00ul，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗4遍。
③、加入100ul TMB底物室溫放置15分鐘，加入2M的硫酸，420nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀下讀數(shù)。
④、檢測(cè)最低的NASG抗原的量，我們的結(jié)果顯示，該試劑能檢測(cè)出0.01ug/ml NASG蛋白的濃度，說(shuō)明我們的試劑盒具有較高的靈敏度。
二、NASG(SPLUNC)的EL1SA試劑盒的檢測(cè)步驟1、鼻咽分泌物的取材方法用生理鹽水沖洗鼻腔后，將一根細(xì)棉簽在鼻視鏡下插到鼻咽部(腫瘤表面)，放置5-8分鐘后，快速取出棉簽，將棉球放入底部空心的小離心管，離心管外再套上離心收集管，在4℃下7500×g離心1分鐘，就可獲得鼻咽分泌物。該方法為無(wú)創(chuàng)性取材，能普遍被人接受。
2、純化的NASG基因重組蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，將抗原(鼻咽分泌物)按1∶10稀釋后，加入到前面已包被好的酶標(biāo)板中，37℃搖床以100轉(zhuǎn)/分鐘的速度孵育3小時(shí)，用洗板液洗去未結(jié)合的抗原。
3、PBST洗板3-4次，吸干殘余液體，加入HRP標(biāo)記的兔抗人的NASG多肽抗體孵育，洗去未結(jié)合的抗體，加入顯色底物TMB，室溫放置20分鐘，可見(jiàn)各孔顯示不同深度的藍(lán)色(附圖2)，加入2M的硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在420nm波長(zhǎng)讀數(shù)，計(jì)算樣本中NASG蛋白的含量。可得到在正常人群的鼻咽分泌物中NASG蛋白的濃度為30-80ug/ml，而鼻咽癌患者鼻咽分泌物中NASG蛋白的濃度為小于5ug/ml。
4、通過(guò)該方法我們檢測(cè)了80例鼻咽癌患者鼻咽分泌物中的NASG蛋白的含量，僅兩例放療后的鼻咽癌患者鼻咽分泌物中NASG蛋白含量大于5ug/ml，因而診斷鼻咽癌的準(zhǔn)確率達(dá)到90％以上，利用鼻咽分泌物中的NASG蛋白含量來(lái)對(duì)鼻咽癌作出早期、快速的無(wú)創(chuàng)性診斷，具有良好的特異性。
5、取同一正常人及鼻咽癌患者的鼻咽分泌物，利用本方法進(jìn)行ELISA測(cè)定，每天測(cè)定一次，共重復(fù)10次，按公式變異系數(shù)(CV)＝S/X×100％(S為標(biāo)準(zhǔn)差，X為平均值)計(jì)算批間及批內(nèi)變異系數(shù)，可得批內(nèi)與批間變異系數(shù)分別為4.63％和4.98％。說(shuō)明該檢測(cè)方法穩(wěn)定性好。
我們經(jīng)過(guò)多年的研究，不但克隆了鼻咽組織特異性表達(dá)的鼻咽癌抑瘤基因，而且證明了其為一種分泌性蛋白，能在鼻咽分泌物中檢測(cè)出。因此，我們制備了抗NASG(SPLUN1)的抗體，進(jìn)一步經(jīng)雙抗體夾心法制備N(xiāo)ASG蛋白的ELISA檢測(cè)試劑盒，從鼻咽部取分泌物進(jìn)行ELISA檢測(cè)，定量檢測(cè)各人群鼻咽分泌物中NASG蛋白表達(dá)量，從而預(yù)測(cè)鼻咽癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，篩查易感者，并對(duì)鼻咽癌患者做出早期、快速的無(wú)創(chuàng)性診斷。初步研究結(jié)果表明，該試劑盒對(duì)門(mén)診初診病人的診斷準(zhǔn)確率與病理結(jié)果一致(圖3)，該檢測(cè)快速、對(duì)患者不造損傷，病人及正常人均可接受；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者正常側(cè)鼻咽部分泌物中的NASG蛋白表達(dá)也發(fā)生下調(diào)，結(jié)合我們對(duì)NASG基因的生物信息學(xué)分析，說(shuō)明NASG表達(dá)下調(diào)為鼻咽癌發(fā)生的早期事件(圖4)，因而該項(xiàng)研究不但可用于鼻咽癌的早期診斷，而且適用于鼻咽癌的早期大規(guī)模人群篩查與患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，為鼻咽癌的早期診斷與防治提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。一方面，我們可以對(duì)鼻咽分泌物中NASG蛋白表達(dá)下調(diào)的人群進(jìn)行早期的預(yù)防，從而降低發(fā)病率；另一方面，由于鼻咽癌的死亡原因大部分因腫瘤的晚期轉(zhuǎn)移引起，利用該檢測(cè)方法，我們可以在早期診斷鼻咽癌，做到早期診斷、早期治療，從而降低病死率，提高患者的生活質(zhì)量。因而，本研究具有極大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)價(jià)值，值得廣泛的推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施方法1、某一患者鼻咽部用生理鹽水沖洗，按前述方法取患者右側(cè)鼻咽分泌物20ul，同時(shí)對(duì)患者行病理活檢。將取得的鼻咽分泌物用PBS稀釋成200ul，開(kāi)始利用本試劑盒對(duì)分泌物中的NASG蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)；2、冰箱取出已經(jīng)包被好的酶標(biāo)板，室溫下放置20分鐘，同時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)品按如下濃度稀釋25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.12ug/ml，1.56ug/ml，0.78ug/ml，0.39ug/ml，0ug/ml(空白對(duì)照)，將稀釋液各取100ul按下表中的順序(下表中的96格即為酶標(biāo)板中96孔)加入到酶標(biāo)板；3、取自正常人的鼻咽分泌物10倍稀釋液(已定量，含NASG蛋白6ug/ml)取100ul加入酶標(biāo)板(標(biāo)準(zhǔn)孔)，再加入病人的待測(cè)樣本，各種樣本均加雙孔4、37℃搖床以100轉(zhuǎn)/分鐘的速度孵育3小時(shí)后，用洗板液洗去未結(jié)合的抗原，吸干殘余液體；

5、1∶1000將HRP-NASG抗體稀釋?zhuān)靠准尤?00ul，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗4遍；6、加入100ul TMB底物室溫放置15分鐘，加入2M硫酸(終止液)，420nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀下讀數(shù)；7、根據(jù)測(cè)得的NASG蛋白濃度乘稀釋倍數(shù)，得出該病人鼻咽分泌物中的NASG蛋白含量為4.27ug/ml。表明該患者患有鼻咽癌，兩天后，病理結(jié)果顯示該患者為鼻咽低分化鱗癌。
<210>1<211>256<212>PRT<213>鼻咽組織特異性基因編碼蛋白NASG<220>
<400>1Met Phe Gln The Gly Gly Leu Ile Val Phe Tyr Gly Leu Leu Ala Gln1 5 10 15The Met Ala Gln Phe Gly Gly Leu Pro Val Pro Leu Asp Gln The Leu20 25 30Pro Leu Asn Val Asn Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro The Gly Leu Ala35 40 45Gly Ser Leu The Asn Ala Leu Ser Asn Gly Leu Leu Ser Gly Gly Leu50 55 60Leu Gly Ile Leu Glu Asn Leu Pro Leu Leu Asp Ile Leu Lys Pro Gly65 70 75 80Gly Gly The Ser Gly Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Gly Lys Val The85 90 95Ser Val Ile Pro Gly Leu Asn Asn Ile Ile Asp Ile Lys Val The Asn100 105 110Pro Gln Leu Leu Glu Leu Gly Leu Val Gln Ser Pro Asp Gly His Arg115 120 125Leu Tyr Val The Ile Pro Leu Gly Ile Lys Leu Gln Val Asn The Pro130 135 140Leu Val Gly Ala Ser Leu Leu Arg Leu Ala Val Lys Leu Asp Ile The145 150 155 160Ala Glu Ile Leu Ala Val Arg Asp Lys Gln Glu Arg Ile His Leu Val165 170 175Leu Gly Asp Cys The His Ser Pro Gly Ser Leu Gln Ile Ser Leu Leu180 185 190Asp Gly Leu Gly Pro Leu Pro Ile Gln Gly Leu Leu Asp Ser Leu The195 200 205Gly Ile Leu Asn Lys Val Leu Pro Val Leu Val Gln Gly Asn Val Cys210 215 220Pro Leu Val Asn Glu Val Leu Arg Gly Leu Asp Ile The Leu Val His225 230 235 240Asp Ile Val Asn Met Leu Ile His Gly Leu Gln Phe Val Ile Lys Val245 250 25權(quán)利要求
1.一種鼻咽組織特異性基因編碼蛋白NASG的檢測(cè)試劑盒，包括包被有抗體的酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、通用試劑Tween-20和顯色底物四甲基聯(lián)苯胺TMB，其特征在于該試劑盒的酶標(biāo)板孔內(nèi)為經(jīng)包被液處理和阻滯液處理的NASG融合蛋白抗體，另配備有辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的兔抗NASG多肽抗體。
2.按權(quán)利要求1所述的一種鼻咽組織特異性基因編碼蛋白NASG的檢測(cè)試劑盒，其特征在于試劑盒酶標(biāo)板孔內(nèi)的NASG融合蛋白抗體的濃度以1ug/ml為佳。
3.一種如權(quán)利要求1所述的鼻咽組織特異性基因編碼蛋白NASG的檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括兔抗人多肽抗體的制備，兔抗人NASG融合蛋白抗體的制備，其特征在于(1)、制備兔抗人多肽抗體時(shí)，根據(jù)NASG的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并合成的21個(gè)氨基酸多肽序列為Cys，Lys，Val，The，Asp，Pro，Gln，Leu，Leu，Glu，Leu，Gly，Leu，Val，Gln，Ser，Pro，Asp，Gly，His，Arg；(2)、將兔抗人NASG融合蛋白抗體，用包被緩沖液稀釋至1ug/ml加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，4℃包被過(guò)夜；(3)、倒去未包被的液體，用含0.1％Tween-20的磷酸鹽緩沖液-PBST沖洗后加入含0.5％牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗脫，放4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.一種如權(quán)利要求1所述的鼻咽組織特異性基因編碼蛋白檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，其特征在于該試劑盒用于作為鼻咽癌早期診斷指標(biāo)的人體鼻咽分泌物中NASG蛋白含量的檢測(cè)方法為(1)、鼻咽分泌物的獲取生理鹽水沖洗鼻腔，用細(xì)棉簽在鼻視鏡下插到鼻咽部，放置5～8分鐘，取出棉簽，將棉球放入底部空心、外套有離心收集管的小離心管中，在4℃下7500xg離心獲取鼻咽分泌物；(2)、將獲取的抗原-鼻咽分泌物按1∶10用生理鹽水稀釋后，加入到若干個(gè)試劑盒的酶標(biāo)板孔中，同時(shí)在若干個(gè)未加待測(cè)抗原的酶標(biāo)頂孔內(nèi)加入純化的NASG基因重組蛋白做標(biāo)準(zhǔn)樣；37℃條件下，在100轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中孵育3小時(shí)，用PBST洗去未結(jié)合的鼻咽分泌物，吸干殘余液體；(3)將HRP標(biāo)記的兔抗人NASG多肽抗體加入到已加抗原的酶標(biāo)板中，孵育后洗去未結(jié)合抗體，加入顯色底物TMB，室溫放置20分鐘，加入2M硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀420nm的波長(zhǎng)讀數(shù)、計(jì)量；(4)將測(cè)得的濃度與正常人群鼻咽分泌物中NASG濃度對(duì)比，判斷患者鼻咽分泌物中蛋白含量的高低。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分泌性蛋白的免疫檢測(cè)。首先根據(jù)鼻咽組織特異性基因NASG的氨基酸序列，設(shè)計(jì)一段多肽制備兔抗人多肽抗體，同時(shí)用NASG的融合蛋白制備兔抗人的融合蛋白抗體，以純化的NASG重組蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)雙抗體夾心法制備N(xiāo)ASG蛋白的ELISA檢測(cè)試劑盒，從鼻咽部取病人分泌物進(jìn)行ELISA檢測(cè)，定量檢測(cè)各人群鼻咽分泌物中NASG的蛋白表達(dá)量，對(duì)鼻咽癌患者做出早期、快速的無(wú)創(chuàng)性診斷。研究結(jié)果表明，該試劑盒對(duì)初診病人的診斷準(zhǔn)確率與病理結(jié)果一致，該檢測(cè)快速、無(wú)創(chuàng)，不僅可用于鼻咽癌的診斷，而且適用于鼻咽癌的早期大規(guī)模人群篩查與患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，為鼻咽癌的早期診斷與防治提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1624478SQ20041004703
公開(kāi)日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者李桂源, 周后德, 周鳴, 李小玲, 沈守榮, 趙謹(jǐn), 熊煒 申請(qǐng)人:中南大學(xué)腫瘤研究所