專利名稱：任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法及其所用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物物質(zhì)的測試和分析方法及所用物質(zhì)，尤其涉及生物物質(zhì)的免疫檢測方法及其所用試劑盒。
背景技術(shù)：
免疫標(biāo)記技術(shù)檢測方法是指用酶、化學(xué)(或生物)發(fā)光劑、熒光素、放射性核素、鐵蛋白及膠體金等作為示蹤物，對抗體或抗原標(biāo)記后進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，藉助于酶標(biāo)檢測儀、發(fā)光測定儀、熒光顯微鏡、射線測量儀等精密儀器，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察或進(jìn)行自動化測定，可用于測定蛋白質(zhì)、激素、抗生素、藥物、病原體等多種抗原和抗體。常用的固相免疫檢測方法有酶標(biāo)記免疫檢測方法、化學(xué)發(fā)光檢測方法和時間分辨熒光免疫分析法等。酶免疫檢測通常又稱為ELISA(Enzymelinked Immuosorbent Assay，酶聯(lián)免疫吸附測定)，其基礎(chǔ)是抗原/抗體固相化以及抗原/抗體的酶標(biāo)記，在測定過程中，待測標(biāo)本(需要測定其中的特定抗原/抗體)與固相載體表面的抗原/抗體起反應(yīng)，之后用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開，再加入酶標(biāo)記的抗原/抗體，通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上，最后保留固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量之間有一定的比例關(guān)系，加上酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，從而根據(jù)呈色情況可以實(shí)現(xiàn)對受檢物質(zhì)的定性或定量分析，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可以設(shè)計(jì)多種檢測方法，常用的有夾心法、間接法、競爭法、捕獲夾心法。
伴隨免疫檢測方法的廣泛應(yīng)用，對檢測過程的方便、快速、靈敏以及降低生產(chǎn)檢測成本的要求日益高漲，也有多種多樣的技術(shù)方案被提出來，如中國專利ZL00120798公開的一種高信息量免疫檢測方法及其專用檢測板，采用在一塊板上的不同微孔中分別包被上不同的抗原/抗體來實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)目的同時檢測，中國專利ZL99114528公開的一種酶免疫試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)一次同時檢出4中TORCH病原體的IgM，中國專利申請00123730公開的一種抗體酶免聯(lián)檢試劑盒，采用抗人IgM抗體包被板，TORCH多項(xiàng)組合抗原和多項(xiàng)組合酶標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)TORCH IgM抗體的聯(lián)合檢測，美國專利US2004171087公開的一種免疫試劑盒，可用來簡化整個檢測所采用的試劑種類以及所需的檢測步驟。這些現(xiàn)有技術(shù)，基本上都必須采用不同的抗體/抗原進(jìn)行包被，采用不同的抗體/抗原酶結(jié)合物，或增加了生產(chǎn)難度、生產(chǎn)成本，或使用時無法根據(jù)情況選擇檢測項(xiàng)目，失去了靈活性即在給定的試劑盒上用戶無法根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行檢測項(xiàng)目的選擇。
另一方面，在使待測生物物質(zhì)上帶上預(yù)先設(shè)計(jì)的一TAG(特定標(biāo)簽)，然后通過針對該TAG的特定檢測物質(zhì)，即從標(biāo)本中把特定的待測生物物質(zhì)給檢測出來，該項(xiàng)技術(shù)在一些具有商業(yè)價值的采用基因工程技術(shù)制備特殊蛋白/肽方面得到了廣泛應(yīng)用，如美國專利申請US20040180380中公開了TAG，以及它在蛋白修飾分析方面的使用方法。
但是，如何應(yīng)用基本試劑把免疫檢測方法與TAG技術(shù)結(jié)合起來，提高生物物質(zhì)的檢測效率、降低檢測成本，即從生產(chǎn)者的角度來講，可以更簡便地、更多種類地(不僅有檢測抗體類還有檢測抗原類)生產(chǎn)檢測用試劑盒，從使用者的角度來講，可以方便、靈活、多選擇地完成檢測任務(wù)，是本方法及試劑盒特別之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，在免疫檢測方法中運(yùn)用共用的基本試劑，降低生產(chǎn)難度及成本，提高使用的方便性、靈活性以及檢測效率，實(shí)現(xiàn)任意組合的多項(xiàng)目并行檢測。
本發(fā)明所述多項(xiàng)目并行檢測是指多個檢測項(xiàng)目通過一個檢測過程完成，所述任意組合式是指在限定的多個檢測項(xiàng)目上，可選擇一項(xiàng)或多項(xiàng)以及多項(xiàng)排列方式。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)以上目的所采用的具體技術(shù)方案包括，提出一種任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法，包括步驟a、用同一抗體固相化在微孔板/條的至少兩個微孔上；b、加入待檢測標(biāo)本，一個微孔對應(yīng)一個檢測項(xiàng)目，各微孔中加入的待檢測標(biāo)本可以不同，而各微孔的檢測項(xiàng)目也可以不同；c、加入檢測抗原，它是一種基因工程表達(dá)抗原/人工合成抗原，一個檢測項(xiàng)目對應(yīng)一種檢測抗原，但各種檢測抗原均帶有相同的特定標(biāo)記；d、加入抗體示蹤物結(jié)合物，該結(jié)合物具備與所述特定標(biāo)記結(jié)合的能力；e、依據(jù)所述檢測抗原、待檢測標(biāo)本以及抗體示蹤物結(jié)合物與預(yù)包被板/條的結(jié)合情況，進(jìn)行各個檢測項(xiàng)目的定量分析/定性判斷。
所述用于固相化的同一抗體指抗抗體。
所述特定標(biāo)記是指在基因工程表達(dá)抗原/人工合成抗原上存在的肽、多肽或蛋白。
所述特定標(biāo)記，是指His、SOD、GST或Pre-S1。
所述免疫檢測方法包括酶免疫檢測，時間分辨熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光檢測；并且針對酶免疫檢測方法，所述抗體示蹤物結(jié)合物是指用辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶標(biāo)記的抗體；針對時間分辨熒光免疫分析法，所述抗體示蹤物結(jié)合物是指用銪、釤鑭系元素標(biāo)記的抗體；
針對化學(xué)發(fā)光檢測方法，所述抗體示蹤物結(jié)合物是指用魯米諾及其衍生物或吖啶酯類發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的抗體。
特別地，所述待檢測標(biāo)本指人體血清/體液，而檢測項(xiàng)目包括對至少兩項(xiàng)不同抗體的檢測。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)以上目的所采用的具體技術(shù)方案還包括，生產(chǎn)制造一種用來幫助實(shí)現(xiàn)上述任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法的試劑盒，它包括其上至少兩個微孔固相化有同一抗體的預(yù)包被板/條；以及能夠與檢測過程所用各種檢測抗原所共有的特定標(biāo)記相結(jié)合的抗體示蹤物結(jié)合物。
還包括陰性質(zhì)控，它是指不含待測物的與標(biāo)本同質(zhì)的樣品；和/或陽性質(zhì)控，它是指至少含有一種與待測物相同/同類的、稀釋或未稀釋的樣品；和/或溶液A，用來配合所述抗體示蹤物結(jié)合物，給出特定項(xiàng)目的定量分析/定性判斷指示；和/或溶液B，用來分離未與微孔板/條結(jié)合者；和/或溶液C，用來把抗體示蹤物結(jié)合物配制成工作液。
特別地，所述待檢測標(biāo)本指人體血清/體液，而檢測項(xiàng)目包括對至少兩項(xiàng)不同抗體的檢測；所述特定標(biāo)記為His、GST、PreS1，所述抗體示蹤物結(jié)合物指用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶或葡萄糖氧化酶標(biāo)記過的His、GST、PreS1抗體。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明的任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法及其所用試劑盒，為降低生產(chǎn)難度及成本，提高使用的方便性、靈活性以及檢測效率提供了可能。
具體實(shí)施例方式
以下對本發(fā)明予以詳盡說明。
本發(fā)明的任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法，通過在微孔反應(yīng)板或條的全部/多個微孔固相化上相同的配體，該配體可與后續(xù)的抗原、抗體、受體等發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過配體之間反應(yīng)后，加入檢測抗原，該檢測抗原帶有一段肽或蛋白，用可與該肽或蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)標(biāo)記上可用于信號檢測的標(biāo)記物，該標(biāo)記物可直接或加入相應(yīng)的溶液后進(jìn)行信號檢測和收集。
本發(fā)明方法，可在相同的反應(yīng)板或條上加入不同的一種試劑如檢測不同的IgM抗體或加入二種不同的試劑如檢測不同的抗原，以降低制備試劑的難度及成本，增加檢測通量和用戶使用的靈活性和可選擇性。
實(shí)施例一以現(xiàn)有技術(shù)的捕獲法測定人血清TORCH(弓形蟲、風(fēng)疹病毒、單皰I型病毒、單皰II型病毒、巨細(xì)胞病毒)IgM抗體一、試劑盒的制備制備風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體試劑盒，包括1、預(yù)包被微孔板2、風(fēng)疹抗原工作液3、抗風(fēng)疹抗體-辣根酶標(biāo)記物工作液4、陰性對照5、陽性對照6、底物液A7、底物液B8、終止液9、洗滌液10、稀釋液，下面對上述各成分的制備予以分別說明1、預(yù)包被微孔板(抗u微孔板)包被用PH9.0-9.6的碳酸緩沖液稀釋抗u抗體，0.1-10ug/ml，100ul/孔，4℃16-24hr，甩去液體，拍干；封閉含1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，100ul/孔，4℃16-24hr，甩去液體，拍干；干燥37度4-24小時。
2、風(fēng)疹抗原工作液制備按棋盤滴定方法選擇最佳抗原濃度，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋，抗原可以是提取的，也可以是人工的。
3、抗風(fēng)疹抗體辣根酶標(biāo)記物工作液按棋盤滴定方法選擇最佳標(biāo)記物濃度，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋。
4、陽性對照風(fēng)疹病毒IgM抗體陽性血清用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白的稀釋液稀釋。
5、陰性對照HbsAg(-)，抗-HIV(-)，抗-HCV(-)的正常人血清，風(fēng)疹病毒IgM抗體陰性，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白的稀釋液稀釋。
6、底物液A0.05％H2O2的枸櫞酸緩沖液，PH4.5-5.5。
7、底物液B0.1-1ug/LTMB枸櫞酸-乙酸鈉緩沖液，PH3.0-4.0。
8、終止液2N H2SO4或Hcl或NaOH溶液。
9、洗滌液0.5％T-20的磷酸鹽緩沖液。
10、稀釋液1％-2％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
制備弓形蟲、單皰I型病毒、單皰II型病毒、巨細(xì)胞病毒IgM抗體試劑盒，只需將上述關(guān)于風(fēng)疹的描述改為弓形蟲、單皰I型病毒、單皰II型病毒、巨細(xì)胞病毒，其它同上，不再贅述。
二、使用試劑盒進(jìn)行檢測的過程風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體試劑盒使用方法1、加樣標(biāo)本用稀釋液1∶1000稀釋，100ul/孔，加陰陽性對照各2孔100ul/孔，37℃，1hr。
2、洗板加洗滌液，300ul/孔，靜止1分鐘，甩去。如此四遍。
3、加風(fēng)疹抗原工作液和抗風(fēng)疹抗體辣根酶標(biāo)記物工作液風(fēng)疹抗原工作液50ul/孔，抗風(fēng)疹抗體辣根酶標(biāo)記物50ul/孔，37℃，1hr4、洗板同2
5、顯色加底物液A50ul/孔，底物液B50ul/孔37℃，10分鐘6、加終止液50ul/孔7、酶標(biāo)儀判讀或肉眼觀察。
弓形蟲、單皰I型病毒、單皰II型病毒、巨細(xì)胞病毒IgM抗體試劑盒使用方法，只需將上述關(guān)于風(fēng)疹的描述改為弓形蟲、單皰I型病毒、單皰II型病毒、巨細(xì)胞病毒，其它同上，不再贅述。
由于不同IgM試劑盒不得交叉使用，TORCH五項(xiàng)需測定5次，使用5個不同的試劑盒。
實(shí)施例二以本發(fā)明方法測定人血清TORCH(弓形蟲、風(fēng)疹病毒、單皰I型病毒、單皰II型病毒、巨細(xì)胞病毒)IgM抗體一、試劑盒的制備制備TORCH IgM抗體試劑盒，包括1、預(yù)包被微孔板2、檢測抗原工作液a，風(fēng)疹抗原工作液b，弓形蟲抗原工作液c，單皰I型病毒抗原工作液d，單皰II型病毒抗原工作液e，巨細(xì)胞病毒抗原工作液3、抗His-辣根酶標(biāo)記物工作液4、陰性質(zhì)控5、陽性質(zhì)控6、底物液A7、底物液B8、終止液9、洗滌液10、稀釋液11、陽性對照。
1、預(yù)包被微孔板(抗u微孔板)與實(shí)施例一中所述相同。
2、檢測抗原工作液選擇最佳的TORCH五項(xiàng)中各抗原濃度，這些抗原每種都帶有6-His，并分別用含有小牛血清或牛血清白蛋白的稀釋液稀釋。
3、抗His-辣根酶標(biāo)記物工作液選擇最佳的抗-His-辣根過氧化酶濃度，并用含小牛血清或牛血清白蛋白的稀釋液稀釋。
4、陰性質(zhì)控HbsAg(-)，抗-HIV(-)，抗-HCV(-)的正常人血清，風(fēng)疹病毒IgM抗體、弓形蟲、單皰I型病毒、單皰II型病毒、巨細(xì)胞病毒IgM抗體陰性血清，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白的稀釋液稀釋，混合。
5、陽性質(zhì)控1抗-HBV-IgM(+)人血清，取一定的量加入HBV核心抗原(該抗原帶有HisTag)5-10倍摩爾濃度，4度結(jié)合16小時，滴定出合適濃度，用含有小牛血清或牛血清白蛋白稀釋液稀釋。
6、陽性質(zhì)控2風(fēng)疹病毒IgM抗體、弓形蟲、單皰I型病毒、單皰II型病毒、巨細(xì)胞病毒IgM抗體陽性血清，滴定出合適濃度，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白的稀釋液稀釋，混合。
7、底物液A與實(shí)施例一中所述相同。
8、底物液B與實(shí)施例一中所述相同。
9、終止液與實(shí)施例一中所述相同。
10、清洗液與實(shí)施例一中所述相同。
11、稀釋液與實(shí)施例一中所述相同。
二、使用試劑盒進(jìn)行檢測的過程測定一份標(biāo)本TORCH五項(xiàng)1、標(biāo)記取微孔板標(biāo)記，如第1孔巨細(xì)胞病毒、第2孔風(fēng)疹病毒、第3孔弓形蟲、第4孔單皰I、第5孔單皰II。
2、加樣標(biāo)本用稀釋液1∶1000稀釋，100ul/孔，加陰陽性質(zhì)控各2孔100ul/孔，37℃1hr。
3、洗板與實(shí)施例一中所述相同。
4、加檢測抗原工作液和抗His-辣根酶標(biāo)記物工作液第1孔、第2孔、第3孔、第4孔、第5孔分別加入巨細(xì)胞病毒檢測抗原、風(fēng)疹病毒檢測抗原、弓形蟲檢測抗原、單皰I型、單皰II型病毒檢測抗原，較純的抗原50ul/孔后加入抗-His的辣根酶標(biāo)記物37℃1hr，不太純的抗原可100ul/孔37℃1hr洗板同前，再加抗-His的辣根酶標(biāo)記物100ul/孔37℃1hr。
5、洗板與實(shí)施例一中所述相同。
6、加顯色液A、B與實(shí)施例一中所述相同。
7、加終止液見原方法8、酶標(biāo)儀判讀或肉眼觀察只要改變加入的帶His的檢測抗原，就可以檢測多種多樣的IgM抗體，并可同時檢測。
抗His抗體制備及過氧化物酶標(biāo)記屬于現(xiàn)有成熟之技術(shù)，具體可參見由湖北科學(xué)技術(shù)出版社出版的“現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)”其出版號為ISBN 7-5352-2093-2，不再贅述。
實(shí)施例三以現(xiàn)有技術(shù)測人分泌物肺炎衣原體、沙眼衣原體、肺炎支原體IgA抗體一、試劑盒的制備測人分泌物肺炎衣原體IgA抗體試劑盒包括1、預(yù)包被微孔板2、抗人IgA抗體辣根酶標(biāo)記物工作液4、陰性對照5、陽性對照6、底物液A7、底物液B8、終止液9、洗滌液10、稀釋液，下面對上述各成分的制備予以分別說明1、預(yù)包被微孔板肺炎衣原體抗原與實(shí)施例一中所述相同。
2、抗人IgA抗體辣根酶標(biāo)記物工作液按棋盤滴定方法選擇最佳標(biāo)記物濃度，并分別用含有小牛血清或牛血清白蛋白的稀釋液稀釋3、陽性對照肺炎衣原體IgA抗體陽性分泌物用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白的稀釋液稀釋。
4、陰性對照肺炎衣原體IgA抗體陰性分泌物，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白的稀釋液稀釋。
5、底物液A與實(shí)施例一中所述相同。
6、底物液B與實(shí)施例一中所述相同。
7、終止液與實(shí)施例一中所述相同。
8、清洗液與實(shí)施例一中所述相同。
9、稀釋液與實(shí)施例一中所述相同。
制備沙眼衣原體、肺炎支原體IgA抗體，只需將上述關(guān)于肺炎衣原體的描述改為沙眼衣原體、肺炎支原體，其它同上，不再贅述。
二、試劑盒的使用1、加樣標(biāo)本用稀釋液1∶10稀釋，100ul/孔，加陰陽性對照各2孔，100ul/孔，37℃，1hr。
2、洗板與實(shí)施例一中所述相同。
3、抗人IgA抗體辣根酶標(biāo)記物工作液100ul/孔，37℃，1hr4、洗板同25、顯色加底物液A50ul/孔，底物液B50ul/孔37℃，10分鐘6、加終止液50ul/孔7、酶標(biāo)儀判讀或肉眼觀察。
沙眼衣原體、肺炎支原體IgA抗體試劑盒使用方法，只需將上述關(guān)于肺炎衣原體的描述改為沙眼衣原體、肺炎支原體，其它同上，不再贅述。
實(shí)施例四采用本發(fā)明方法，運(yùn)用時間分辨熒光技術(shù)，測人分泌物肺炎衣原體、沙眼衣原體、肺炎支原體IgA抗體，一、試劑盒的制備1、預(yù)包被微孔板包被抗人IgA抗體，2、檢測抗原工作液選擇最佳的肺炎衣原體、沙眼衣原體、肺炎支原體各表達(dá)抗原濃度，這些抗原每種都帶有GST，并分別用含有小牛血清或牛血清白蛋白的稀釋液稀釋3、抗GST-Eu3+標(biāo)記物工作液選擇最佳的抗GST-Eu3+標(biāo)記物濃度，并用含0.2％BSA，0.9％Nacl的50mmol/L pH7.5 Tris-Hcl的稀釋液稀釋.
4、陰性質(zhì)控HbsAg(-)，抗-HIV(-)，抗-HCV(-)的正常人唾液，肺炎衣原體、沙眼衣原體、肺炎支原體IgA抗體陰性分泌物，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白的稀釋液稀釋，混合。
5、陽性質(zhì)控1抗沙眼衣原體IgA(+)樣品，取一定的量加入沙眼衣原體(該抗原帶有GST Tag)1-2倍摩爾濃度，4度結(jié)合16小時，滴定出合適濃度，用含有小牛血清或牛血清白蛋白稀釋液稀釋6、陽性質(zhì)控2肺炎衣原體、沙眼衣原體、肺炎支原體IgA抗體陽性分泌物分別用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白的稀釋液稀釋，混合。
7、洗滌液0.5％T-20的磷酸鹽緩沖液8、熒光增強(qiáng)液取磷酸二甲酸氫鉀1.3g，三辛基磷化氫的氧化物(TOPO)19.33mg，2-萘酰三氟丙酮(2-NTA)6mg，冰醋酸6ml，Triton X-100 1ml，加重蒸餾水800ml，微溫至溶后加重蒸餾水至1000ml，Ph2.8-3.5。
注3種帶有GST標(biāo)記的檢測抗原的制備擴(kuò)增3種抗原的基因片段，分別克隆入Amrad公司出品的pGEX中，分別表達(dá)帶有GST標(biāo)記的3種檢測抗原，GST蛋白的表達(dá)與純化具體可參見科學(xué)出版社出版的“精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南”ISBN 7-03-006408-9；抗GST抗體制備具體可參見湖北科學(xué)技術(shù)出版社出版的“現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)”PP23-38；而抗體-Eu3+標(biāo)記物制備具體可參見湖北科學(xué)技術(shù)出版社出版的“現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)”P133。
二、試劑盒的使用1、標(biāo)記取微孔板標(biāo)記，如第1孔肺炎衣原體、第2孔沙眼衣原體、第3孔肺炎支原體。
2、加樣標(biāo)本用稀釋液1∶10稀釋，100ul/孔，加陰陽性質(zhì)控各2孔100ul/孔，室溫2hr。
3、洗板與實(shí)施例一中所述相同。
4、加檢測抗原工作液和抗GST-Eu3+標(biāo)記物工作液第1孔、第2孔、第3孔分別加入肺炎衣原體、沙眼衣原體、肺炎支原體檢測抗原工作液，較純的抗原50ul/孔后加入抗GST-Eu3+標(biāo)記物，室溫2hr，不太純的抗原可100ul/孔室溫2hr洗板同前，再加抗GST-Eu3+標(biāo)記物工作液100ul/孔室溫2hr。
5、洗板與實(shí)施例一中所述相同。
6、每孔熒光增強(qiáng)液200ul，緩慢震蕩5min，用時間分辨熒光儀測量熒光強(qiáng)度，每孔測定1秒。
實(shí)施例五以現(xiàn)有技術(shù)化學(xué)發(fā)光法測定人血清Pre-s1抗原和Pre-s2抗原一、試劑盒的制備制備檢測Pre-s1試劑盒，包括1、預(yù)包被微孔板2、AMPPD標(biāo)記物3、陰性對照4、陽性對照5、底物液6、洗滌液。
1、Pre-s1預(yù)包被微孔板用抗Pre-s1代替抗u抗體，其余見模式1原方法中的預(yù)包被微孔板制備2、抗Pre-s1-AMPPD標(biāo)記物抗Pre-s1的AMPPD標(biāo)記物，按棋盤滴定方法選擇最佳標(biāo)記物濃度，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋3、陰性對照HbsAg(-)，抗-HIV(-)，抗-HCV(-)的正常人血清4、陽性對照陽性血清標(biāo)本用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋而成5、底物液含0.05％H2O2，pH10的0.2M NaOH溶液5、清洗液0.05M Tris-HCl，0.5％T-20制備檢測Pre-s2試劑盒，包括1、預(yù)包被微孔板2、抗Pre-s2-AMPPD標(biāo)記物3、陰性對照4、陽性對照5、底物液6、洗滌液。
1、Pre-s2預(yù)包被微孔板用抗Pre-s2代替抗u抗體，其余見模式1原方法中的預(yù)包被微孔板制備。
2、抗Pre-s2-AMPPD標(biāo)記物抗HBeAg的AMPPD標(biāo)記物，按棋盤滴定方法選擇最佳標(biāo)記物濃度，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋。
3、陰性對照HbsAg(-)，抗-HIV(-)，抗-HCV(-)的正常人血清。
4、陽性對照陽性血清標(biāo)本用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋而成。
6、底物液含0.05％H2O2，pH10的0.2M NaOH溶液。
7、清洗液0.05M Tris-HCl，0.5％T-20。
二、試劑盒的使用測定Pre-S11、加樣取Pre-s1預(yù)包被微孔板，加樣品50ul/孔，陰陽性對照各2孔50ul/孔，2、加抗Pre-s1 AMPPD標(biāo)記物50ul/孔，37℃1hr3、洗板與實(shí)施例一中所述相同。
4、底物液100ul，10min?；瘜W(xué)發(fā)光測定儀測定。
測定Pre-s2抗原1、加樣取Pre-s2預(yù)包被微孔板，加樣品50ul/孔，陰陽性對照各2孔50ul/孔，2、加抗Pre-s2酶標(biāo)記物50ul/孔，37℃1hr3、洗板與實(shí)施例一中所述相同。
4、底物液100ul，10min。化學(xué)發(fā)光測定儀測定。
實(shí)施例六以本發(fā)明方法，采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)，測定人血清Pre-s1抗原和Pre-s2抗原一、試劑盒的制備包括1、預(yù)包被微孔板2、鼠抗Pre-S1單克隆抗體工作液3、鼠抗Pre-s2單克隆抗體工作液4、Pre-S1-His+Pre-s2-His檢測抗原工作液5、抗His-AMPPD工作液6、陰性質(zhì)控7、陽性質(zhì)控8、底物液9、洗滌液。
1、預(yù)包被微孔板用羊抗鼠抗體代替抗u抗體，其余與實(shí)施例一中所述相同。
2、鼠抗Pre-S1單克隆抗體工作液選擇最佳濃度，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋。
3、鼠抗Pre-s2單克隆抗體工作液選擇最佳濃度，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋。
4、Pre-S1-His+Pre-s2-His檢測抗原工作液選擇最佳Pre-S1-His和Pre-s2-His濃度，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋，混合。
5、抗His-AMPPD工作液，抗體AMPPD標(biāo)記物制備采用N-羥基琥珀酰亞胺法進(jìn)行標(biāo)記。并按棋盤滴定方法選擇最佳濃度，用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋。
6、陰性質(zhì)控HbsAg(-)，抗-HIV(-)，抗-HCV(-)的正常人血清。
7、陽性質(zhì)控用Pre-S1和Pre-s2陽性血用含有25％小牛血清或2％牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液稀釋。
8、洗滌液0.05M Tris-HCl，0.5％T-20。
9、底物液含0.05％H2O2，pH10的0.2M NaOH溶液。
二、試劑盒的使用1.標(biāo)記取羊抗鼠抗體預(yù)包被微孔板，標(biāo)記測Pre-S1和測Pre-s2孔做上不同的記號2.加抗體測Pre-S1和測Pre-S2孔分別加入抗-Pre-S1和抗-Pre-S2鼠單克隆抗體，37℃1hr。
3、洗板與實(shí)施例一中所述相同。
4、加樣每孔加50ul標(biāo)本，加50ulPre-S1-His+Pre-s2-His檢測抗原工作液，37℃1hr。
3.洗板與實(shí)施例一中所述相同。
4.加抗His-AMPPD標(biāo)記物工作液每孔加100ul 37℃1hr5.洗板與實(shí)施例一中所述相同。
6、底物液100ul，10min?；瘜W(xué)發(fā)光法測定儀測定。
實(shí)施例七帶有his標(biāo)記的HPV6b L1檢測抗原的制備1、擴(kuò)增帶有EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的HPV6b L1基因片段50ul反應(yīng)體積，HPV6b模板1ng，P1、P2引物各0.5umol/L(R5’-CGG AAT TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG C-3’L5’-CGG GAT CCT GGC GGC CTA GCG ACA GCA C-3’)，Taq DNA聚合酶1U，10mmol/L dNTP貯備液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L)，PCR緩沖液(50mmol KCl、4mmol/LMgCl2、10mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，加入H2O至50ul反應(yīng)體積，加入50μl石蠟油，將反應(yīng)管置PCR擴(kuò)增儀上，95℃變性1min，循環(huán)參數(shù)為95℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s循環(huán)30次，最后72℃延伸2min。
2、酶切基因片段和酶切Prset(Prset是帶有His標(biāo)記的載體)A0.2ug純化的HPV6b L1基因片段，2u EcoR I和2u BamH I，1ul 10x緩沖液，10ul反應(yīng)體積，37℃10min。B0.5ug pRSET載體，2u EcoR I和2u BamH I，1ul 10x緩沖液，10ul反應(yīng)體積，37℃10min。
3、酶切基因片段與pRSET載體連接，1u T4DNA連接酶，1ul 10x連接緩沖液，0.1ug酶切基因片段+1/2摩爾的酶切pRSET載體，16℃12hr。
4、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，表達(dá)帶有his標(biāo)記的HPV6b L1蛋白及純化見Invitrogen Corporation的Xpress SystemProtein Expression pRSET和Protein Purification。
以上所述之最佳實(shí)施例意在具體說明本發(fā)明的思路用同一抗體進(jìn)行至少兩個微孔的預(yù)包被，用帶同一特定標(biāo)記的檢測抗原，用同一抗體示蹤物結(jié)合物來實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)目檢測的并行處理。本發(fā)明之實(shí)施，并不限于以上最佳實(shí)施例所公開的方式，凡基于本發(fā)明之設(shè)計(jì)思路，進(jìn)行簡單推演與替換，得到的具體的任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法及其所用試劑盒，都屬于本發(fā)明的實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法，其特征在于，包括步驟a、用同一抗體固相化在微孔板/條的至少兩個微孔上；b、加入待檢測標(biāo)本，一個微孔對應(yīng)一個檢測項(xiàng)目，各微孔中加入的待檢測標(biāo)本可不同，而各微孔的檢測項(xiàng)目也可不同；c、加入檢測抗原，它是一種基因工程表達(dá)抗原/人工合成抗原，一個檢測項(xiàng)目對應(yīng)一種檢測抗原，但各種檢測抗原均帶有相同的特定標(biāo)記；d、加入抗體示蹤物結(jié)合物，該結(jié)合物具備與所述特定標(biāo)記結(jié)合的能力；e、依據(jù)所述檢測抗原、待檢測標(biāo)本以及抗體示蹤物結(jié)合物與預(yù)包被板/條的結(jié)合情況，進(jìn)行各個檢測項(xiàng)目的定量分析/定性判斷。
2.如權(quán)利要求1所述的任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法，其特征在于所述用于固相化的同一抗體指抗抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法，其特征在于所述特定標(biāo)記是指在基因工程表達(dá)抗原/人工合成抗原上存在的肽、多肽或蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法，其特征在于所述特定標(biāo)記，是指His、SOD、GST或Pre-S1。
5.如權(quán)利要求3所述的任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法，其特征在于所述免疫檢測方法包括酶免疫檢測，時間分辨熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光檢測；并且針對酶免疫檢測方法，所述抗體示蹤物結(jié)合物是指用辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶標(biāo)記的抗體；針對時間分辨熒光免疫分析法，所述抗體示蹤物結(jié)合物是指用銪、釤鑭系元素標(biāo)記的抗體；針對化學(xué)發(fā)光檢測方法，所述抗體示蹤物結(jié)合物是指用魯米諾及其衍生物或吖啶酯類發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的抗體。
6.如權(quán)利要求1至5所述的任一任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法，其特征在于所述待檢測標(biāo)本指人體血清/體液，而檢測項(xiàng)目包括對至少兩項(xiàng)不同抗體的檢測。
7.一種用以實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述方法的試劑盒，其特征在于，包括其上至少兩個微孔固相化有同一抗體的預(yù)包被板/條；以及能夠與檢測過程所用各種檢測抗原所共有的特定標(biāo)記相結(jié)合的抗體示蹤物結(jié)合物。
8.如權(quán)利要求7所述方法的試劑盒，其特征在于，還包括陰性質(zhì)控，它是指不含待測物的與標(biāo)本同質(zhì)的樣品；和/或陽性質(zhì)控，它是指至少含有一種與待測物相同/同類的、稀釋或未稀釋的樣品。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括溶液A，用來配合所述抗體示蹤物結(jié)合物，給出特定項(xiàng)目的定量分析/定性判斷指示；和/或 溶液B，用來分離未與微孔板/條結(jié)合者；和/或 溶液C，用來把抗體示蹤物結(jié)合物和抗原、抗體配制成工作液；和/或 溶液D，用來稀釋標(biāo)本。
10.如權(quán)利要求7至9所述的任一試劑盒，其特征在于所述待檢測標(biāo)本指人體血清/體液，而檢測項(xiàng)目包括對至少兩項(xiàng)不同抗體的檢測；所述特定標(biāo)記為His、GST或PreS1，所述抗體示蹤物結(jié)合物指用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的His、GST或PreS1抗體。
全文摘要
一種任意組合式多項(xiàng)目并行免疫檢測方法，包括步驟用同一抗體固相化在微孔板/條的至少兩個微孔上；加入待檢測標(biāo)本，各微孔的待檢測標(biāo)本和/或檢測項(xiàng)目可不同；加入檢測抗原，各檢測抗原均帶有相同的特定標(biāo)記；加入抗體示蹤物結(jié)合物，該結(jié)合物能與所述特定標(biāo)記結(jié)合；依據(jù)所述檢測抗原、待檢測標(biāo)本以及抗體示蹤物結(jié)合物與預(yù)包被板/條的結(jié)合情況，進(jìn)行各個檢測項(xiàng)目的定量分析/定性判斷。一種試劑盒，包括其上至少兩個微孔固相化有同一抗體的預(yù)包被板/條，以及能夠與檢測過程所用各種檢測抗原所共有的特定標(biāo)記相結(jié)合的抗體示蹤物結(jié)合物。采用本檢測方法及試劑盒，降低了生產(chǎn)難度及成本，提高了使用的方便性、靈活性以及選擇性。
文檔編號G01N33/532GK1763532SQ20041005194
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者曹雯雯, 梁培華, 丁野青, 杜綱國, 魏球英 申請人:深圳依諾金生物科技有限公司