專利名稱：一種檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，特別是涉及一種檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。
背景技術(shù)：
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法是檢測(cè)小分子物質(zhì)常用的方法之一，其原理為將小分子物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品與載體蛋白的偶聯(lián)物作為包被抗原吸附于固相載體上，加入待測(cè)樣品和小分子物質(zhì)特異性抗體，待測(cè)樣品中的小分子物質(zhì)和固相載體上的小分子物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體，再加入酶標(biāo)二抗，顯色后終止，測(cè)定樣品吸光值，該值與樣品中小分子物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出待測(cè)樣品中小分子物質(zhì)的含量。檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接ELISA法一般由以下步驟組成1)包被；2)洗板；3)加標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測(cè)樣品、小分子物質(zhì)特異性抗體；4)洗板；5)加酶標(biāo)二抗；6)洗板；7)加底物顯色和終止反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)化的檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法由以下步驟組成1)包被；2)洗板；3)依次加入標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品，酶標(biāo)二抗和小分子物質(zhì)特異性抗體；4)洗板；5)加底物顯色和終止反應(yīng)。
本發(fā)明方法中所加入的酶標(biāo)二抗和小分子物質(zhì)特異性抗體的量與常規(guī)方法相比，酶標(biāo)二抗?jié)舛仍黾?到8倍左右，小分子抗體濃度增加1到2倍。
該方法中的包被、洗板、顯色和終止步驟、以及制備包被抗原、酶標(biāo)二抗等方法均可按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行。
所述包被步驟為將小分子物質(zhì)與載體蛋白的偶聯(lián)物固定于固相載體表面；所述載體蛋白為卵清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白或血蘭蛋白，優(yōu)選為卵清白蛋白(OVA)；所述小分子物質(zhì)與載體蛋白的偶聯(lián)物是小分子物質(zhì)和載體蛋白用過碘酸鈉法或其它方法進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述固定方法可采用物理吸附或共價(jià)交聯(lián)的方法；所述固相載體可為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等多種材料制成的微量反應(yīng)板，優(yōu)選為聚苯乙烯材料的微量反應(yīng)板。
所述用于標(biāo)記二抗的酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸鈉法交聯(lián)在二抗上；所述二抗可為抗鼠或抗兔抗抗體。
本發(fā)明的檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法中，采用了加入酶標(biāo)二抗之后立即加入小分子物質(zhì)特異性抗體的步驟，與現(xiàn)有的方法(加入小分子物質(zhì)特異性抗體，然后洗板，再加入酶標(biāo)二抗)相比，不但省去了一步洗板的步驟，而且節(jié)省了酶標(biāo)二抗與一抗溫育結(jié)合所需的半小時(shí)，使測(cè)定時(shí)間縮短半小時(shí)以上，且能提高靈敏度3-5倍。該法更為簡(jiǎn)便、快捷、靈敏，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1為常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)玉米素核苷(ZR)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為簡(jiǎn)化的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)玉米素核苷(ZR)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施方式
材料、試劑和儀器1、包被抗原所用的載體蛋白為卵清白蛋白，將玉米素核苷(ZR)和卵清白蛋白采用過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)，得到聯(lián)接物(ZR-OVA)，用蒸餾水稀釋成lmg/ml作為包被抗原。
2、抗體一抗用ZR-BSA(用過碘酸鈉法偶聯(lián))免疫新西蘭大耳白兔制備的抗玉米素核苷(ZR)的多克隆抗體。
酶標(biāo)抗體(二抗)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(辣根過氧化物酶用過碘酸鈉法與羊抗兔IgG交聯(lián))。
3、底物溶液A液過氧化脲1.0g，Na2HPO4·12H2O 35.8g，檸檬酸·H2O 10.3g，Tween-80 100μl，加1000ml蒸餾水，4℃保存?zhèn)溆谩?br> B液TMB 700mg，DMSO 40ml，充分溶解，然后加蒸餾水960ml，檸檬酸·H2O 10.3g，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4、底物緩沖液取B液，再和相同體積的A液混合得到底物緩沖液。
5、包被緩沖液稱取1.5g Na2CO3和2.93g NaHCO3，溶于1000ml蒸餾水，pH9.6。
6、磷酸鹽緩沖液(PBS)稱取8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，用蒸餾水定容至1000ml，pH7.5。
7、樣品稀釋液1000ml PBS中加入1ml Tween-20，1g明膠(稍加熱溶解)。
8、洗滌液1000ml PBS中加入1ml Tween-20。
9、終止液2mol/L的硫酸溶液。
10、酶標(biāo)板(Costar)11、酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)(MULTISKAN MK3，Thermo)12、待測(cè)樣品處理稱取1.0g新鮮棉花葉片，加2ml樣品提取液(80％甲醇內(nèi)含1mM的二叔丁基對(duì)甲酚)，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10ml試管，再用2ml樣品提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4℃冰箱中。4℃下提取4h，1000g離心15min，取上清液。沉淀中加1ml提取液，攪勻，置4℃下再提取1h，離心，合并上清液并記錄體積，殘?jiān)鼦壢?。上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是80％甲醇(1ml)平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用100％甲醇(5ml)洗柱→100％乙醚(5ml)洗柱→100％甲醇(5ml)洗柱→循環(huán)。將過柱后的樣品轉(zhuǎn)入5ml塑料離心管中，真空濃縮干燥或用氮?dú)獯蹈?，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容?.5ml，待測(cè)。
實(shí)施例1、用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)小分子物質(zhì)1、常規(guī)的間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)玉米素核苷(ZR)檢測(cè)過程包括以下步驟1)包被將包被抗原按1∶4000的比例用包被緩沖液稀釋、混勻后，在酶標(biāo)板的每孔中加入稀釋后的抗原200μl，然后將酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤，37℃溫育3hr。
2)洗板將包被好的酶標(biāo)板取出，放在室溫下平衡，甩掉包被液，用乳膠管將洗滌液均勻加入酶標(biāo)板使每孔充滿洗滌液，放置約0.5min，甩掉洗滌液，洗4次，最后將板內(nèi)殘留的洗滌液在吸水紙上甩干。
3)競(jìng)爭(zhēng)a)加標(biāo)準(zhǔn)ZR樣品和待測(cè)樣品先將ZR標(biāo)準(zhǔn)物用樣品稀釋液稀釋成2000ng/ml，再將其依次稀釋為500ng/ml，100ng/ml，20ng/ml，4ng/ml，2ng/ml，1ng/ml和0ng/ml，共8個(gè)濃度，再將上述不同濃度的溶液加入96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)濃度平行做6個(gè)孔，每孔20μl；在另外48孔中每孔加入20μl待測(cè)樣品；b)加抗體將ZR抗體(一抗)按1∶7200的比例用樣品稀釋液稀釋、混勻后，向每孔中各加180μl。然后將酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤，37℃溫育0.5hr。
4)洗板方法同步驟2)，洗4次。
5)加酶標(biāo)二抗將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG用樣品稀釋液按1∶3000的比例稀釋、混勻后，向酶標(biāo)板每孔中各加200μl，然后將其放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤，37℃溫浴0.5hr。
6)洗板方法同步驟2)，洗5次。
7)顯色將底物緩沖液加入到酶標(biāo)板中，每孔200μl，常溫下顯色15min，然后向每孔中加入100μl 2mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)。
8)結(jié)果測(cè)定用酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)依次測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)物的OD450值。并將測(cè)定結(jié)果繪制成曲線圖(圖1)，圖1中，縱坐標(biāo)表示ZR標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度(ng/ml)，橫坐標(biāo)表示B/B0(B0表示0ng/ml濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的顯色值，B表示其它各濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的顯色值)。根據(jù)圖1得到曲線方程y＝34823e-10.035x，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9808，由曲線得知I50為230.69ng/ml，I80為11.37ng/ml，檢測(cè)極限為11.37ng/ml。待測(cè)樣品的OD值為0.622，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)樣品中含有51.83ng/ml的ZR。
2、本發(fā)明的簡(jiǎn)化的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)玉米素核苷(ZR)檢測(cè)過程包括以下步驟1)包被將包被抗原按1∶4000的比例用包被緩沖液稀釋、混勻后，在酶標(biāo)板的每孔中加入稀釋后的抗原200μl，然后將酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤，37℃溫浴3hr。
2)洗板將包被好的酶標(biāo)板取出，放在室溫下平衡，甩掉包被液，用乳膠管將洗滌液均勻加入酶標(biāo)板使每孔充滿洗滌液，放置約0.5min，甩掉洗滌液，洗4次，最后將板內(nèi)殘留的洗滌液在吸水紙上甩干。
3)競(jìng)爭(zhēng)a)加標(biāo)準(zhǔn)ZR樣品和待測(cè)樣品先將ZR標(biāo)準(zhǔn)物用樣品稀釋液稀釋成2000ng/ml，再將其依次稀釋為500ng/ml，100ng/ml，20ng/ml，4ng/ml，2ng/ml，1ng/ml和0ng/ml，共8個(gè)濃度，再將上述不同濃度的溶液加入96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)濃度平行做6個(gè)孔，每孔20μl；在另外48孔中每孔加入20μl待測(cè)樣品；b)加酶標(biāo)二抗將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG用樣品稀釋液按1∶900的比例稀釋、混勻后，向酶標(biāo)板每孔中各加90μl；c)加抗體將ZR抗體(一抗)按1∶1800的比例用樣品稀釋液稀釋、混勻后，向每孔中各加90μl。然后將加入了標(biāo)準(zhǔn)樣品、酶標(biāo)二抗和抗體的酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤，37℃溫浴0.5hr。
4)洗板方法同步驟2)，洗5次。
5)顯色將底物緩沖液加入到酶標(biāo)板中，每孔200μl，常溫下顯色15分鐘，然后向每孔中加入100μl 2mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)。
6)結(jié)果測(cè)定用酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)依次測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)物的OD450值。并將測(cè)定結(jié)果繪制成曲線圖(圖2)，圖2中縱坐標(biāo)表示ZR標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度(ng/ml)，橫坐標(biāo)表示B/B0(B0表示0ng/ml濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的顯色值，B表示其它各濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的顯色值)。根據(jù)圖2得到曲線方程y＝7345.9e-10.014x，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.987，由曲線得知I50為49.17ng/ml，I80為2.44ng/ml，檢測(cè)極限為2.44ng/ml。待測(cè)樣品的OD值為0.742，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)樣品中含有51.59ng/ml的ZR，與常規(guī)方法的結(jié)果一致，說明本發(fā)明方法的準(zhǔn)確度可靠。
整個(gè)過程與步驟1的方法相比，節(jié)省了酶標(biāo)二抗與一抗結(jié)合所需的0.5小時(shí)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明常規(guī)的間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法與簡(jiǎn)化后的間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法的檢測(cè)極限提高3到5倍，證明簡(jiǎn)化后的間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法可更好的用于小分子物質(zhì)的免疫檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，由以下步驟組成1)包被；2)洗板；3)依次加入標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品，酶標(biāo)二抗和小分子物質(zhì)特異性抗體；4)洗板；5)加底物顯色和終止反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，其特征在于所述載體蛋白為卵清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或血蘭蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，其特征在于所述小分子物質(zhì)與載體蛋白的偶聯(lián)物是將小分子物質(zhì)和載體蛋白用過碘酸鈉法或戊二醛法偶聯(lián)得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，其特征在于所述用于標(biāo)記二抗的酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，其特征在于所述用于標(biāo)記二抗的酶為辣根過氧化物酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，其特征在于所述辣根過氧化物酶用戊二醛法或過碘酸鈉法交聯(lián)在二抗上；所述二抗為抗鼠或抗兔抗抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。其目的是提供一種簡(jiǎn)化的檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。該檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，由以下步驟組成1)包被；2)洗板；3)依次加入標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品，酶標(biāo)二抗和小分子物質(zhì)特異性抗體；4)洗板；5)加底物顯色和終止反應(yīng)。本發(fā)明的檢測(cè)小分子物質(zhì)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法中，采用了加入酶標(biāo)二抗之后立即加入小分子物質(zhì)特異性抗體的步驟，與現(xiàn)有的方法相比，不但省去了一步洗板的步驟，而且節(jié)省了酶標(biāo)二抗與抗體結(jié)合所需的半小時(shí)，使測(cè)定時(shí)間縮短半小時(shí)以上，而且提高了檢測(cè)靈敏度3－5倍。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1766622SQ20041008625
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月28日
發(fā)明者王保民, 趙靜, 俞彩霞, 何素平, 李召虎, 李剛, 何鐘佩 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)