專利名稱：掃描激光顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過同時(shí)激發(fā)樣本中包括的多種熒光物質(zhì)對樣本進(jìn)行分析的方法和熒光物質(zhì)分析器。本發(fā)明能夠?qū)铙w中包括的多種蛋白質(zhì)等的運(yùn)動(dòng)和/或活動(dòng)進(jìn)行同時(shí)和獨(dú)立的跟蹤，因?yàn)榛铙w中包括的許多蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)天然地具有熒光性，或者可以使用熒光探針使其發(fā)出熒光。
背景技術(shù)：
當(dāng)飛秒(10-15秒)級的超短光脈沖在空間中會聚并照射在物質(zhì)上時(shí)，照射點(diǎn)的能量密度變得非常高，從而導(dǎo)致光脈沖與物質(zhì)之間發(fā)生線性和非線性的相互作用。這種相互作用產(chǎn)生了許多現(xiàn)象，其中之一就是產(chǎn)生了具有連續(xù)光譜的白光脈沖(下面稱作“連續(xù)光譜白光脈沖”)。連續(xù)光譜白光脈沖具有連續(xù)光譜，同時(shí)是與原始脈沖相似的超短脈沖。由于具有這種特性，連續(xù)光譜白光脈沖具有很多用途。
數(shù)個(gè)可能用途中的一個(gè)實(shí)施例就是能夠產(chǎn)生調(diào)制脈沖用于信息傳輸(美國專利No.4,655,547，Jonathan P.Heritage和Andrew M.Weiner，“Shaping Optical Pulses by Amplitude and Phase Masking”；Andrew M.Weiner，“Research Project- Femtosecond Pulse Shaping and Processing”，http//purcell.ecn.purdue.edu/～fsoptics/PulseShaping.html)。如圖1所示，從超短光脈沖產(chǎn)生的連續(xù)光譜白光11由色散元件12進(jìn)行色散，并且色散光通過具有不同透射率的遮光件13或用于不同波長分量的移相器。隨后，透鏡和色散元件14將來自遮光件13的光混合為一個(gè)脈沖。因此，獲得了具有遮光件13的傅里葉變換圖形的脈沖15。
上述方法將由遮光件表示的空間信息轉(zhuǎn)換為由脈沖表示的時(shí)間信息，其又被用于信息傳輸?shù)募夹g(shù)。并且，如上所述，因?yàn)槠涫歉道锶~變換，輸入(空間信息)與輸出(時(shí)間信息)之間的關(guān)系非常復(fù)雜。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于分析熒光樣本(尤其是生物樣本)的方法和系統(tǒng)，其中以較簡單的方式使用從超短光脈沖產(chǎn)生的連續(xù)光譜白光。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于分析樣本的方法，該方法包括a)使用色散元件將從超短光脈沖產(chǎn)生的連續(xù)光譜白光脈沖色散為光譜的步驟；b)從色散光中只選擇出多個(gè)目標(biāo)波長分量的步驟；c)使用反向色散元件將所述多個(gè)目標(biāo)波長分量混合為包括目標(biāo)波長分量的復(fù)合光脈沖的步驟；和d)將復(fù)合光脈沖照射在樣本上以激發(fā)對應(yīng)于多個(gè)目標(biāo)波長分量的多種目標(biāo)熒光物質(zhì)的步驟。
在本發(fā)明的改進(jìn)方法中，所述選擇出的多個(gè)目標(biāo)波長分量具有不同光路長度，使復(fù)合光脈沖包括其對應(yīng)于具有時(shí)差的目標(biāo)波長分量的分量光脈沖。
并且，本發(fā)明提供了一種熒光物質(zhì)分析器，包括a)色散元件，該色散元件將從超短光脈沖產(chǎn)生的連續(xù)光譜白光脈沖色散為光譜；b)波長選擇裝置，其用于只選擇出色散光中包括的多個(gè)目標(biāo)波長分量；c)反向色散元件，該反向色散元件將所述選擇出的多個(gè)目標(biāo)波長分量混合為復(fù)合光脈沖；和d)照射光學(xué)系統(tǒng)，其將復(fù)合光脈沖照射在樣本上。
在根據(jù)本發(fā)明的分析中，使用者應(yīng)當(dāng)首先確定激發(fā)所研究的所述多種熒光物質(zhì)需要的頻率。根據(jù)本發(fā)明，由于激發(fā)光是從超短光脈沖產(chǎn)生，會發(fā)生多光子激發(fā)(例如兩光子或三光子激發(fā))。在選擇激發(fā)頻率時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到這個(gè)事實(shí)。
激發(fā)光或者連續(xù)光譜白光脈沖被色散為光譜，只從中選擇出所述多個(gè)激發(fā)波長分量(或目標(biāo)波長分量)。選擇目標(biāo)波長分量方法的實(shí)施例包括只在與目標(biāo)波長分量相對應(yīng)的位置上放置反射鏡；除了反射目標(biāo)波長分量的部分之外使用覆蓋有吸收涂層的反射鏡；使用遮光件只允許色散光在對應(yīng)于目標(biāo)波長分量的部分通過。
使用反向色散元件將選擇出的目標(biāo)波長分量混合以產(chǎn)生復(fù)合光脈沖。除了用于產(chǎn)生光譜的色散元件，還可以再設(shè)置反向色散元件，或者色散元件也可以被用作反向色散元件。
這樣產(chǎn)生的復(fù)合光脈沖只包括能夠激發(fā)目標(biāo)物質(zhì)的波長分量脈沖。因此，對于樣本中包括的各種物質(zhì)，只有期望的熒光物質(zhì)被復(fù)合光脈沖激發(fā)。并且，通過本發(fā)明，復(fù)合光脈沖以多光子激發(fā)模式(例如兩光子或三光子激發(fā))激發(fā)樣本中的熒光物質(zhì)，這是因?yàn)樗桥c原始光脈沖相似的超短光脈沖。在由光子的線性吸收產(chǎn)生的常態(tài)激發(fā)中，在光通過的所有部分都產(chǎn)生光吸收。在另一方面，在多光子激發(fā)中，吸收只在焦點(diǎn)周圍非線性地發(fā)生，因此能夠獲得焦點(diǎn)周圍有關(guān)樣本的信息。焦點(diǎn)的兩維或三維掃描將提供兩維或三維的分析圖象。另外，隨著時(shí)間對圖象進(jìn)行描繪將能夠觀察到目標(biāo)物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)等。
在上述方法中，由反向色散元件產(chǎn)生的復(fù)合光脈沖的分量有可能互相干擾，由于非線性效應(yīng)產(chǎn)生不同頻率的光分量。如此產(chǎn)生的這些不同頻率分量可能激發(fā)目標(biāo)熒光物質(zhì)之外的熒光物質(zhì)，這會在分析中產(chǎn)生噪聲。因此，在本發(fā)明的改進(jìn)方案中，在目標(biāo)波長分量被混合在一起之前，目標(biāo)波長分量的光路長度制作得彼此不同。使用這種方法，分量光脈沖被單獨(dú)地包含在復(fù)合光脈沖中，因此可以防止不同頻率的分量和上述噪聲。
使光路長度中產(chǎn)生差異的一個(gè)方法是沿光路在不同位置上在目標(biāo)波長分量的光路上放置小反射鏡。另一個(gè)方法是在目標(biāo)波長分量的光路上放置透明光學(xué)介質(zhì)，每種光學(xué)介質(zhì)都具有不同的厚度(即光路方向上的尺寸)。所述光學(xué)介質(zhì)優(yōu)選地由具有大折射率的材料制成。
色散光的分量可以是線性調(diào)頻的，因而復(fù)合光脈沖中包括的波長分量的峰值功率可以改變。這種方法能夠在目標(biāo)熒光物質(zhì)中在線性吸收與非線性(或多光子)吸收之間以任意級別控制光的吸收。
圖2顯示了用于使用根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行分析的熒光物質(zhì)分析器的實(shí)施例。在圖2中，光源21例如可以是鉺摻雜的纖維激光器、鎖模鈦:藍(lán)寶石激光器或鎖模鉻:鎂橄欖石激光器(參看美國專利No.6,154,310)，其能夠產(chǎn)生超短光脈沖。所述超短光脈沖被第一光學(xué)系統(tǒng)22會聚在透明物質(zhì)23(例如水或石英晶體)中的一個(gè)點(diǎn)上，透明物質(zhì)23例如可以形成光纖。在此會聚點(diǎn)，物質(zhì)23與超短光脈沖之間發(fā)生非線性相互作用，產(chǎn)生連續(xù)光譜白光脈沖。所述連續(xù)光譜白光脈沖進(jìn)入包括透鏡、反射鏡等的第二光學(xué)系統(tǒng)24。第二光學(xué)系統(tǒng)24將脈沖照射至色散元件25上，色散元件25又將脈沖色散為光譜。色散光進(jìn)入準(zhǔn)直儀26，準(zhǔn)直儀26將光送入波長選擇裝置27。圖2顯示了兩種類型的波長選擇裝置第一種類型27a包括放置在目標(biāo)波長分量的光路上的小反射鏡，第二種類型27b包括在與除了目標(biāo)波長之外的波長對應(yīng)的位置上設(shè)置有光吸收部分的反射鏡。
隨后，準(zhǔn)直儀26將選擇出的波長分量發(fā)送回色散元件25，色散元件25又將波長分量混合為超短光脈沖。超短光脈沖被照射在樣本28上，以激發(fā)所述多個(gè)目標(biāo)物質(zhì)。熒光由檢測器29檢測。
圖3和圖4顯示了用于為色散光分量提供不同光路長度的系統(tǒng)的實(shí)施例。圖3中的系統(tǒng)包括小反射鏡37，小反射鏡37沿光路的不同位置放置在目標(biāo)波長分量的光路上。圖4顯示了復(fù)合系統(tǒng)47，該系統(tǒng)包括屏蔽反射鏡，用于選擇目標(biāo)波長分量和透明光學(xué)介質(zhì)，每個(gè)都具有不同的厚度，設(shè)置在目標(biāo)波長分量的光路上。如圖1至圖4所示的這些光學(xué)系統(tǒng)還能用于掃描激光顯微鏡。
圖5顯示了圖3所示系統(tǒng)的改進(jìn)實(shí)施例，其中小反射鏡57的全部和部分一維地彎曲。小反射鏡57的曲度產(chǎn)生相應(yīng)脈沖分量的偏轉(zhuǎn)(或線性調(diào)頻脈沖)和其峰值的移位。該系統(tǒng)還可以包括用于對小反射鏡背面施加負(fù)壓和用于通過改變負(fù)壓控制曲度的機(jī)構(gòu)。
通過根據(jù)本發(fā)明的方法，可以從超短光脈沖產(chǎn)生連續(xù)光譜白光脈沖。這種方法提供了一種理想的點(diǎn)光源，可以設(shè)計(jì)出具有高分辨率的光學(xué)系統(tǒng)。并且，這種方法還提供了一種能夠以很小的噪聲進(jìn)行分析的非常亮的光源。
根據(jù)本發(fā)明的方法特別適用于對生物樣本的分析。即根據(jù)本發(fā)明的方法能夠?qū)Χ喾N生物物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))進(jìn)行幾乎是同時(shí)和實(shí)時(shí)的檢測，這是因?yàn)樵S多生物材料是熒光性的或者可以使用熒光探針進(jìn)行標(biāo)記。例如，這種方法與兩維或三維顯微鏡掃描系統(tǒng)的結(jié)合將產(chǎn)生兩維或三維解析圖象，并且隨著時(shí)間對圖象的描繪將能夠?qū)δ繕?biāo)物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)等進(jìn)行觀察。另外，通過用熒光物質(zhì)標(biāo)志材料中的蛋白質(zhì)等，使用根據(jù)本發(fā)明的方法或熒光物質(zhì)分析器也能檢測到不具有熒光性的目標(biāo)生物材料。
在根據(jù)本發(fā)明的熒光物質(zhì)分析器中，除了如上所述用于任意選擇目標(biāo)波長的機(jī)構(gòu)之外，還希望能設(shè)置用于容易地改變目標(biāo)波長的機(jī)構(gòu)。例如，在開發(fā)新熒光物質(zhì)中，可能需要找到熒光物質(zhì)的最佳激發(fā)波長。最佳激發(fā)波長可以通過接連地測試一些可能的激發(fā)頻率來尋找。但是，如果所述激發(fā)波長不容易改變，這個(gè)過程將占用很長的時(shí)間。當(dāng)用不同的熒光物質(zhì)標(biāo)志的物質(zhì)混合在樣本中時(shí)會產(chǎn)生另一個(gè)問題。在這種情況下，如果所有熒光物質(zhì)的激發(fā)波長同時(shí)照射在樣本上，將很難精確地定位每個(gè)目標(biāo)物質(zhì)。
考慮到上述問題，根據(jù)本發(fā)明第一模式的熒光物質(zhì)分析器還包括位于波長選擇裝置與反向色散元件之間的光閘，其用于使由波長選擇裝置選出的目標(biāo)波長分量通過或停止，并且反向色散元件通過將通過光閘的目標(biāo)波長分量混合產(chǎn)生復(fù)合光脈沖。
在根據(jù)本發(fā)明第二模式的熒光物質(zhì)分析器中，所述波長選擇裝置包括一個(gè)或多個(gè)波長選擇元件，它們用于只分別選擇出色散光的目標(biāo)波長分量，和開/關(guān)機(jī)構(gòu)，其用于啟動(dòng)或禁止每個(gè)波長選擇元件；并且反向色散元件通過將由啟動(dòng)的波長選擇元件選擇的目標(biāo)波長分量混合產(chǎn)生復(fù)合光脈沖。
在根據(jù)本發(fā)明第三模式的熒光物質(zhì)分析器中，所述波長選擇機(jī)構(gòu)包括多個(gè)波長選擇元件，它們用于只選擇出色散光的目標(biāo)波長分量，和轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，其用于選擇性地轉(zhuǎn)換所述多個(gè)波長選擇元件，并且反向色散元件通過將由轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)選擇的波長選擇元件選擇的目標(biāo)波長分量混合產(chǎn)生復(fù)合光脈沖。
采用熒光物質(zhì)分析器第一模式的分析如下進(jìn)行。在開始分析之前，使用者應(yīng)當(dāng)找出應(yīng)該選擇什么頻率來激發(fā)一個(gè)或多個(gè)所研究的熒光物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，由于激發(fā)光由超短光脈沖產(chǎn)生，因此會發(fā)生多光子激發(fā)，例如兩光子或三光子激發(fā)。在選擇激發(fā)頻率時(shí)應(yīng)考慮到這個(gè)事實(shí)。
激發(fā)光或連續(xù)光譜白光的脈沖被色散為光譜，波長選擇裝置從所述光譜中只選出一個(gè)或多個(gè)激發(fā)波長(目標(biāo)波長)的光。波長選擇裝置的實(shí)例包括反射鏡陣列，其包括多個(gè)放置在目標(biāo)波長光路上的反射鏡，和反射鏡，其在反射目標(biāo)波長分量的部分之外的部分覆蓋有吸收涂層。
對于所選擇的所有目標(biāo)波長分量，只有實(shí)際上會照射在樣本上的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)波長分量被允許通過光閘，而在那時(shí)不會照射到樣本上的其他目標(biāo)波長分量被光閘阻止。
光閘的一個(gè)實(shí)施例是機(jī)械光閘，例如具有槽口的轉(zhuǎn)盤光閘，或者照相機(jī)中使用的平面光閘。也可以使用液晶光閘。
被允許通過光閘的目標(biāo)波長分量被發(fā)送至反向色散元件，其從光中產(chǎn)生復(fù)合光脈沖。反向色散元件可以與用于產(chǎn)生光譜的色散元件分別設(shè)置，或者色散元件也可以用作反向色散元件。
如上所述產(chǎn)生的復(fù)合光脈沖只包括對應(yīng)于目標(biāo)熒光物質(zhì)的激發(fā)光脈沖。因此，對于樣本中全部熒光物質(zhì)，只有目標(biāo)熒光物質(zhì)被復(fù)合光脈沖所激發(fā)。另外，采用熒光物質(zhì)分析器的第一種模式，通過適當(dāng)改變每個(gè)光閘的通過/停止?fàn)顟B(tài)，只有在當(dāng)時(shí)必須的熒光物質(zhì)被激發(fā)。通過使用光閘，可以非常方便和迅速地轉(zhuǎn)換目標(biāo)波長。因此，很容易找到新熒光物質(zhì)的最佳激發(fā)波長，或者單獨(dú)檢測混合在樣本中的多種熒光物質(zhì)中的每一個(gè)，并研究每種熒光物質(zhì)的分布或特性。
在熒光物質(zhì)分析器的第二種模式中，波長選擇裝置包括一個(gè)或多個(gè)波長選擇元件(例如反射鏡)，其用于只分別選擇色散光的目標(biāo)波長分量，和開/關(guān)機(jī)構(gòu)，其用于啟動(dòng)或禁止每個(gè)波長選擇元件。當(dāng)波長選擇元件被啟動(dòng)時(shí)，與波長選擇元件相對應(yīng)的波長被發(fā)送至反向色散元件，其產(chǎn)生包含被選出的波長的復(fù)合光脈沖。在另一方面，當(dāng)波長選擇元件被禁止時(shí)，與波長選擇元件相對應(yīng)的波長不被發(fā)送至反向色散元件，因而復(fù)合光脈沖不包含所述波長。因此，使用所述開/關(guān)機(jī)構(gòu)，可以控制波長選擇裝置來任意改變復(fù)合光脈沖中包含的波長分量的組合。
在熒光物質(zhì)分析器的第三種模式中，波長選擇裝置包括多個(gè)波長選擇元件，它們用于只選擇色散光的目標(biāo)波長分量，和轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，其用于選擇性地轉(zhuǎn)換波長選擇元件。這種結(jié)構(gòu)可以任意地并方便地對復(fù)合光脈沖中包含的波長組合進(jìn)行改變。
根據(jù)本發(fā)明第一至第三模式熒光物質(zhì)分析器可以任意地并方便地對復(fù)合光脈沖中包含的波長組合進(jìn)行改變。這種特性提供了以下優(yōu)越的效果。
(1)在開發(fā)新熒光物質(zhì)中，通過連續(xù)測試可能的激發(fā)波長，可以在短時(shí)間內(nèi)找到最佳激發(fā)波長。
(2)即使當(dāng)用熒光物質(zhì)標(biāo)志的物質(zhì)混合在樣本中，通過連續(xù)選擇熒光物質(zhì)的激發(fā)波長就可以精確定位每個(gè)熒光物質(zhì)，從而每種熒光位置能夠單獨(dú)被激發(fā)。
(3)當(dāng)多個(gè)激發(fā)波長分量照射至樣本上時(shí)，不同的波長分量互相干擾，產(chǎn)生不同的頻率分量。該不同頻率分量可以激發(fā)除了目標(biāo)熒光物質(zhì)之外的熒光物質(zhì)，這導(dǎo)致在分析中產(chǎn)生噪聲。使用根據(jù)本發(fā)明第一至第三模式中的任何一個(gè)的熒光物質(zhì)分析器都能夠解決這個(gè)問題，方法如下選擇性地接連激發(fā)熒光物質(zhì)，針對每個(gè)激發(fā)觀察熒光性，并最終組合所有觀察結(jié)果。通過這種方法，由于干擾而產(chǎn)生的光的不同頻率分量得到消除，因此能夠以很小的噪聲只觀察到目標(biāo)熒光物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的方法和熒光物質(zhì)分析器必須進(jìn)一步解決下述問題。即，熒光物質(zhì)的激發(fā)波長不是單波長，其由某個(gè)小范圍的激發(fā)波長所激發(fā)。因此，與目標(biāo)波長不同的波長的光會導(dǎo)致激發(fā)。如上所述，當(dāng)多個(gè)波長分量照射至樣本上，選擇出的目標(biāo)波長分量不僅會導(dǎo)致目標(biāo)熒光物質(zhì)的兩光子或三光子激發(fā)，還會導(dǎo)致目標(biāo)熒光物質(zhì)之外的熒光物質(zhì)的線性激發(fā)。在這種情況下，當(dāng)使用檢測器檢測時(shí)，由選擇出的目標(biāo)波長分量之外的光造成的激發(fā)產(chǎn)生的熒光性將成為噪聲。
因此，需要改善根據(jù)本發(fā)明的方法或熒光物質(zhì)分析器，能夠以更高的精度和更小的噪聲進(jìn)行分析。
考慮到上述目標(biāo)，根據(jù)本發(fā)明第四模式的方法包括以下步驟對在步驟b)中選出的所述多個(gè)目標(biāo)波長分量的強(qiáng)度以不同的頻率進(jìn)行調(diào)制，并且經(jīng)過調(diào)制的所述多個(gè)目標(biāo)波長分量被發(fā)送至步驟c)；在步驟d)中通過目標(biāo)熒光物質(zhì)的激發(fā)由樣本發(fā)射的熒光光線對于每個(gè)目標(biāo)波長被色散并檢測；每個(gè)熒光光線的檢測信號在與熒光性相對應(yīng)的目標(biāo)波長分量的強(qiáng)度受到調(diào)制的頻率上被同步整流。
另外，根據(jù)本發(fā)明第五實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器還包括強(qiáng)度調(diào)制器，用于以不同的頻率對由波長選擇裝置選出的所述多個(gè)目標(biāo)波長分量的強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)制；熒光色散元件，用于使用照射光學(xué)系統(tǒng)通過復(fù)合光脈沖的照射對由樣本發(fā)射的熒光性色散光線進(jìn)行色散；檢測器，用于對于每個(gè)目標(biāo)波長分量探測由熒光色散元件色散的熒光光線；同步整流器，用于在與熒光性相對應(yīng)的目標(biāo)波長分量的強(qiáng)度調(diào)制中使用的頻率上對由檢測器檢測到的每個(gè)熒光光線的檢測信號進(jìn)行同步整流。
在使用根據(jù)本發(fā)明第四模式的方法或根據(jù)本發(fā)明第五模式的熒光物質(zhì)分析器的分析中，使用者應(yīng)當(dāng)首先找出選擇什么頻率來激發(fā)被研究的所述多種熒光物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，由于激發(fā)光從超短光脈沖產(chǎn)生，因此會發(fā)生多光子激發(fā)(例如兩光子或三光子激發(fā))。在選擇激發(fā)頻率時(shí)應(yīng)考慮到這個(gè)事實(shí)。
超短光脈沖反復(fù)地產(chǎn)生，由此產(chǎn)生一系列連續(xù)光譜白光脈沖。連續(xù)光譜白光脈沖被色散為光譜，由此只選擇出所述多個(gè)激發(fā)波長分量(或目標(biāo)波長分量)。選擇目標(biāo)波長分量的方法的實(shí)施例包括只在與目標(biāo)波長相對應(yīng)的位置上放置反射鏡；使用除了反射目標(biāo)波長分量的部分之外覆蓋有吸收涂層的反射鏡；使用遮光件只允許色散光在對應(yīng)于目標(biāo)波長分量的部分通過。
當(dāng)超短光脈沖(即連續(xù)光譜白光脈沖)反復(fù)產(chǎn)生時(shí)，在不同的頻率對按照上述方法選擇的目標(biāo)波長分量的強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)制。強(qiáng)度經(jīng)過調(diào)制的所述多個(gè)目標(biāo)波長分量通過反向色散元件混合為一系列復(fù)合光脈沖，其被照射在樣本上。
當(dāng)所述復(fù)合光脈沖照射至樣本上時(shí)，樣本中與目標(biāo)波長分量相對應(yīng)的熒光物質(zhì)被激發(fā)，并且每個(gè)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光光線。樣本同時(shí)發(fā)射出包含所述多個(gè)目標(biāo)波長的所有熒光光線。
如上所述，當(dāng)一系列復(fù)合光脈沖被照射在樣本上時(shí)，樣本相應(yīng)地發(fā)射出一系列熒光脈沖。所述熒光脈沖對于每個(gè)目標(biāo)波長受到色散，并且色散光的強(qiáng)度被檢測。熒光脈沖的檢測信號在對具有與熒光脈沖相對應(yīng)的波長的激發(fā)光的強(qiáng)度調(diào)制中使用的頻率下受到同步整流。熒光的每個(gè)波長分量的強(qiáng)度在與相應(yīng)于波長分量的激發(fā)光的強(qiáng)度調(diào)制中使用的頻率相同的頻率變化。因此，當(dāng)檢測信號在所述頻率被同步整流時(shí)，目標(biāo)信號被從檢測信號中提取出來，否則噪聲被提取出來。這樣就分別將信號分量和噪聲分量分別從檢測信號中提取出來。
因此，通過根據(jù)本發(fā)明第四模式的方法或根據(jù)本發(fā)明第五模式的熒光物質(zhì)分析器，目標(biāo)激發(fā)光受到調(diào)制，并且熒光在調(diào)制頻率被同步整流。通過這樣的過程，可以分別獲得由目標(biāo)激發(fā)光激發(fā)產(chǎn)生的目標(biāo)熒光(信號的目標(biāo)分量)和由其他激發(fā)光激發(fā)產(chǎn)生的其他熒光(信號的噪聲分量)。
根據(jù)本發(fā)明的方法和熒光物質(zhì)分析器尤其適用于生物樣本分析，特別是用于顯微鏡。即，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠?qū)Χ鄠€(gè)生物物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))進(jìn)行幾乎是同時(shí)和實(shí)時(shí)的檢測，因?yàn)樵S多生物物質(zhì)具有熒光性。尤其是當(dāng)用于顯微鏡中時(shí)，此方法與兩維或三維掃描系統(tǒng)的結(jié)合將產(chǎn)生樣本兩維或三維的分析圖像，并且隨著時(shí)間對圖像進(jìn)行描繪將能夠觀察到目標(biāo)物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)等。另外，通過用熒光物質(zhì)對材料的蛋白質(zhì)等進(jìn)行標(biāo)志，使用根據(jù)本發(fā)明的方法或熒光物質(zhì)分析器能夠檢測到不具有熒光性的目標(biāo)生物材料。
結(jié)果，不僅能夠精確地確定用熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)志的物質(zhì)的位置和分布，而且還能基于熒光強(qiáng)度以很高的精度對標(biāo)志的物質(zhì)進(jìn)行定量分析。將本方法或熒光物質(zhì)分析器與圖像分析技術(shù)結(jié)合使用將能夠精確地發(fā)現(xiàn)樣本中的標(biāo)志的物質(zhì)的反應(yīng)的數(shù)量和速度等。


圖1說明了根據(jù)Weiner的傅里葉變換系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)；圖2說明了根據(jù)本發(fā)明用于產(chǎn)生復(fù)合光脈沖并用來對多種熒光物質(zhì)進(jìn)行分析的光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)；
圖3說明了用于產(chǎn)生光分量分離的復(fù)合光脈沖的光脈沖產(chǎn)生系統(tǒng)的實(shí)施例的結(jié)構(gòu)；圖4說明了用于產(chǎn)生光分量分離的復(fù)合光脈沖的光脈沖產(chǎn)生系統(tǒng)的另一實(shí)施例的結(jié)構(gòu)；圖5說明了用于為分量光脈沖進(jìn)行線性調(diào)頻的光脈沖產(chǎn)生系統(tǒng)的主要部分的結(jié)構(gòu)；圖6說明了作為根據(jù)本發(fā)明第一模式的系統(tǒng)的實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器的一般結(jié)構(gòu)；圖7說明了圖6中的熒光物質(zhì)分析器在包括放置于其后的準(zhǔn)直儀和其他元件的部分的結(jié)構(gòu)；圖8說明了作為本發(fā)明第二模式的實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器在包括放置于其后的準(zhǔn)直儀和其他元件的部分的結(jié)構(gòu)；圖9說明了作為本發(fā)明第三模式的實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器在包括放置于其后的準(zhǔn)直儀和其他元件的部分的結(jié)構(gòu)；圖10說明了第一模式的實(shí)施方案的第一修改例；圖11說明了第一模式的實(shí)施方案的第二修改例；圖12說明了作為本發(fā)明第五模式的實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器的結(jié)構(gòu)；圖13說明了在圖12的熒光物質(zhì)分析器中使用的中性密度(ND)濾波器，并且圖表代表旋轉(zhuǎn)角與光學(xué)衰減系數(shù)之間的關(guān)系；圖14為說明了激發(fā)波長分量λ1、λ2和λ3的強(qiáng)度調(diào)制狀態(tài)的圖表；圖15說明了熒光檢測系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
圖6說明了作為本發(fā)明第一模式的實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器。在圖12中，光源111例如可以是鉺摻雜的纖維激光器、鎖模鈦:藍(lán)寶石激光器或鎖模鉻:鎂橄欖石激光器，其能夠產(chǎn)生超短光脈沖。所述超短光脈沖被第一光學(xué)系統(tǒng)112會聚在透明物質(zhì)113(例如水或石英晶體)中的一個(gè)點(diǎn)上。在此會聚點(diǎn)，在物質(zhì)113與超短光脈沖之間發(fā)生非線性相互作用，產(chǎn)生連續(xù)光譜白光脈沖。所述連續(xù)光譜白光脈沖進(jìn)入包括透鏡、反射鏡等的第二光學(xué)系統(tǒng)114。第二光學(xué)系統(tǒng)114將脈沖照射至色散元件115上，色散元件115又將脈沖色散為光譜。色散光進(jìn)入準(zhǔn)直儀116，準(zhǔn)直儀116將光送入波長選擇裝置117。
圖6顯示了兩種類型的波長選擇裝置第一種類型117a包括放置在目標(biāo)波長分量的光路上的小反射鏡，第二種類型117b包括在與除了目標(biāo)波長分量之外的波長分量對應(yīng)的位置上設(shè)置有光吸收部分的反射鏡。
光閘121設(shè)置在準(zhǔn)直儀116與波長選擇裝置117之間。如圖7所示，光閘121包括放置在波長選擇裝置117b的小反射鏡之前或波長選擇裝置117b的反射部分之前的旋轉(zhuǎn)光閘單元122。每個(gè)旋轉(zhuǎn)光閘單元都可以通過在操作單元123上的按鍵操作任意地旋轉(zhuǎn)，所述操作單元123設(shè)置在使用者容易接觸到的地方。旋轉(zhuǎn)光閘的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換沿與旋轉(zhuǎn)光閘相對應(yīng)的光路傳播的光的通過與停止。操作單元123可以用簡單轉(zhuǎn)換構(gòu)成。否則，用于控制熒光物質(zhì)分析器全面運(yùn)轉(zhuǎn)的控制器(通常為個(gè)人計(jì)算機(jī))可以用作操作單元123。
只有由波長選擇裝置117選擇并允許通過光閘121的波長分量通過準(zhǔn)直儀116返回至色散元件115，色散元件115將波長分量混合為超短光脈沖。該超短光脈沖照射在樣本118上，以激發(fā)多個(gè)目標(biāo)物質(zhì)。由激發(fā)產(chǎn)生的熒光由檢測器119檢測。
因而，使用本實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器，通過操作使用者能方便地接觸到的操作單元123，使用者能夠很簡單地改變照射在樣本118上的復(fù)合光脈沖中包含的波長分量。
當(dāng)多個(gè)波長分量被選擇通過光閘121時(shí)，照射至樣本上的復(fù)合光脈沖包含選出的多個(gè)波長分量。在這種情況下，復(fù)合光脈沖的分量有可能互相干擾，由于非線性效應(yīng)而產(chǎn)生不同的頻率分量。如此產(chǎn)生的不同頻率分量可能激發(fā)目標(biāo)熒光物質(zhì)之外的熒光物質(zhì)，其成為分析中的噪聲?？紤]到這一點(diǎn)，優(yōu)選地將目標(biāo)波長分量的光路長度制作得彼此不同。通過這種結(jié)構(gòu)，由光閘121選出的分量光脈沖包含在具有時(shí)差的復(fù)合光脈沖中，因此防止了不同的頻率分量和上述噪聲。
圖10和圖11說明了上述結(jié)構(gòu)的實(shí)施例。圖10中說明的實(shí)施例包括小反射鏡117，其沿光路放置在目標(biāo)波長分量光路的不同位置上，使光路長度不同。圖11中說明的實(shí)施例包括透明光介質(zhì)117d，其放置在目標(biāo)波長分量的光路上，所述目標(biāo)波長分量由波長選擇裝置117b的選擇性鏡子類型限定。所述光介質(zhì)具有不同厚度(即在光路方向上的尺寸)，以光學(xué)地改變光路長度。所述光介質(zhì)優(yōu)選地由具有大折射率的材料制成。在任一種情況下，旋轉(zhuǎn)光閘122放置在每個(gè)光路上以構(gòu)成光閘121。
下面將說明作為本發(fā)明第二模式的實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器。圖6說明了所述分析器的一般結(jié)構(gòu)，圖8說明了包括準(zhǔn)直儀116和放置在其后的其他元件的分析器的一部分。波長選擇裝置131包括許多小鏡子132，它們與色散光波長的光路相對應(yīng)放置。一旦從操作單元133接收到命令信號，波長選擇裝置131將小鏡子132伸入相應(yīng)的光路。在小鏡子132伸入的光路中，具有相應(yīng)波長的光被小鏡子132反射回準(zhǔn)直儀116，并且色散元件115將反射光混合為超短光脈沖。在其他光路中，光不被反射回色散元件115，因此復(fù)合光脈沖不包含與這些光路相對應(yīng)的波長分量。這樣，使用本實(shí)施方案的系統(tǒng)，通過操作單元133給出適當(dāng)?shù)闹噶?，能夠任意選擇照射至樣本118上的復(fù)合光脈沖中包含的波長分量。
下面將說明作為本發(fā)明第三模式的實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器。圖6說明了所述分析器的一般結(jié)構(gòu)，圖9說明了包括準(zhǔn)直儀116和放置在其后的其他元件的分析器的一部分。本實(shí)施方案中的分析器具有多個(gè)波長選擇裝置142和轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)141，所述轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)141用于選擇性地轉(zhuǎn)換波長選擇裝置142。每個(gè)波長選擇裝置142具有光吸收部分和反射部分，如圖6中所示的波長選擇裝置117b一樣制成。圖9中的轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)141為旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)，用于選擇性地將波長選擇裝置142放置在光路上。平行移動(dòng)機(jī)構(gòu)也可以用于構(gòu)成轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)141。用于轉(zhuǎn)換操作的指令是通過操作單元143給出的。
圖12說明了作為本發(fā)明第五模式的實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器。在圖12中，光源211例如可以是鉺摻雜的纖維激光器、鎖模鈦:藍(lán)寶石激光器或鎖模鉻:鎂橄欖石激光器，所述激光器能夠周期性地以大體上規(guī)則地時(shí)間間隔產(chǎn)生一系列超短光脈沖。如上所述，超短光脈沖的寬度為飛秒(10-15秒)級，脈沖產(chǎn)生的頻率大約是80至100MHz。
由光源211產(chǎn)生的超短光脈沖由第一光學(xué)系統(tǒng)212會聚在透明介質(zhì)213(例如水或石英晶體)的一點(diǎn)上。在此會聚點(diǎn)，介質(zhì)213與超短光脈沖之間發(fā)生非線性相互作用，產(chǎn)生一系列連續(xù)光譜白光脈沖。連續(xù)光譜白光脈沖進(jìn)入第二光學(xué)系統(tǒng)214，所述第二光學(xué)系統(tǒng)214包括透鏡、反射鏡等。第二光學(xué)系統(tǒng)214將所述光脈沖照射在色散元件215上，并進(jìn)而將脈沖色散為光譜。準(zhǔn)直儀216將色散光發(fā)送至波長選擇裝置217，其選出多個(gè)激發(fā)波長分量(λ1、λ2和λ3)用于激發(fā)目標(biāo)熒光物質(zhì)。
在經(jīng)過波長選擇裝置217之后，選出的激發(fā)波長分量λ1、λ2和λ3進(jìn)入強(qiáng)度調(diào)制器218，所述強(qiáng)度調(diào)制器218以不同的頻率f1、f2和f3對激發(fā)波長分量的強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)制。所述強(qiáng)度調(diào)制器218包括為每個(gè)波長分量設(shè)置的轉(zhuǎn)盤型中性密度(ND)濾光器。每個(gè)中性密度濾光器設(shè)計(jì)得其光學(xué)衰減系數(shù)隨著旋轉(zhuǎn)角度變化，如圖13所示。中性密度濾光器以不同得旋轉(zhuǎn)速度旋轉(zhuǎn)，從而激發(fā)波長分量的強(qiáng)度在與中性密度濾光器旋轉(zhuǎn)速度相對應(yīng)的不同頻率f1、f2和f3被調(diào)制。波長λ1的激發(fā)光的強(qiáng)度在頻率f1調(diào)制，其可以防止強(qiáng)度在頻率f1正弦變化。同樣，波長λ2和λ3的激發(fā)光的強(qiáng)度分別在頻率f2和f3調(diào)制。
激發(fā)波長分量λ1、λ2和λ3由會聚光學(xué)系統(tǒng)219照射至色散元件220上，所述色散元件220將波長分量混合為超短光脈沖。所述超短光脈沖照射至樣本221上。
如上所述，光源211在頻率80至100MHz產(chǎn)生超短光脈沖。因此，照射在樣本上的復(fù)合光脈沖以相同的頻率產(chǎn)生。在樣本221中，復(fù)合光脈沖中包含的所述多個(gè)激發(fā)波長分量激發(fā)多種熒光物質(zhì)，每個(gè)所述熒光物質(zhì)發(fā)射出熒光光線。由熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光光線同時(shí)從樣本211上發(fā)射出來，并由熒光檢測系統(tǒng)222檢測。
下面將參照附圖15對熒光檢測系統(tǒng)222的運(yùn)轉(zhuǎn)進(jìn)行說明。樣本221發(fā)射出的熒光由熒光色散裝置223色散為目標(biāo)熒光波長分量η1、η2和η3。色散的熒光分量η1、η2和η3的強(qiáng)度由檢測器224檢測。
檢測器224輸出與熒光分量η1、η2和η3對應(yīng)的檢測信號，并且檢測信號分別在激發(fā)波長分量的強(qiáng)度調(diào)制頻率f1、f2和f3進(jìn)行同步整流。同步整流由整流器陣列225進(jìn)行。在圖15中，使用了三個(gè)調(diào)制頻率f1、f2和f3，這是因?yàn)榫哂腥齻€(gè)激發(fā)波長(和熒光波長)η1、η2和η3。因此采用了9個(gè)整流器c11-c33。
例如，波長η1的熒光檢測信號被發(fā)送至整流器c11、c12和c13，所述整流器對信號在頻率f1、f2和f3分別進(jìn)行同步整流。由于波長η1的熒光由激發(fā)波長分量λ1產(chǎn)生，而激發(fā)波長分量λ1的強(qiáng)度在頻率f1進(jìn)行調(diào)制，波長η1的熒光檢測信號代表在頻率f1的周期性強(qiáng)度變化。因此，在頻率f1進(jìn)行同步整流的整流器c11的輸出信號s11只包含關(guān)于從目標(biāo)熒光物質(zhì)發(fā)射出來的熒光的信息。在另一方面，在頻率f2和f3分別進(jìn)行同步整流的另外兩個(gè)整流器c12和c13的輸出信號s12和s13只包含關(guān)于由與頻率f2和f3相對應(yīng)的激發(fā)波長分量λ1和λ2產(chǎn)生的其他熒光的信息。因此，從同一熒光中，目標(biāo)輸出信號s11和被認(rèn)為是噪聲的其他輸出信號s12和s13是分別產(chǎn)生的。
對于波長η2的熒光，在頻率f2進(jìn)行同步整流的整流器c22輸出目標(biāo)信號s22，并且在頻率f1和f3分別進(jìn)行同步整流的另外兩個(gè)整流器c21和c23輸出噪聲信號s21和s23。波長η2的熒光的情況解釋與之相同。
如上所述，本實(shí)施方案的熒光物質(zhì)分析器能只檢測由與目標(biāo)熒光物質(zhì)相對應(yīng)的激發(fā)波長分量造成的激發(fā)產(chǎn)生的目標(biāo)熒光，同時(shí)能清除由其他激發(fā)波長分量造成的不需要的熒光的檢測信號。
權(quán)利要求
1.一種掃描激光顯微鏡，包括a)光源，其用于采用超短光脈沖產(chǎn)生連續(xù)光譜白光脈沖；b)色散元件，其將超短光脈沖產(chǎn)生色散為光譜；c)波長選擇裝置，其只選擇出所述色散光中包括的多個(gè)目標(biāo)波長分量；d)反向色散元件，該反向色散元件將所述選擇出的多個(gè)目標(biāo)波長分量混合為復(fù)合光脈沖；和e)掃描光學(xué)系統(tǒng)，其用于將復(fù)合光脈沖掃描至樣本上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描激光顯微鏡，還包括沿光路在不同位置上在色散光的多個(gè)目標(biāo)波長分量的光路上放置的多個(gè)鏡子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的掃描激光顯微鏡，其中至少一個(gè)鏡子具有非平面的反射表面，以對與鏡子對應(yīng)的目標(biāo)波長分量進(jìn)行線性調(diào)頻。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描激光顯微鏡，還包括多個(gè)透明光學(xué)介質(zhì)，每個(gè)透明光學(xué)介質(zhì)具有不同的厚度，其放置在色散光的所述多個(gè)目標(biāo)波長分量的光路上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的掃描激光顯微鏡，其中至少一個(gè)介質(zhì)具有非平面的端面，以對與介質(zhì)對應(yīng)的目標(biāo)波長分量進(jìn)行線性調(diào)頻。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描激光顯微鏡，還包括光閘，該光閘用于任意地使由波長選擇裝置選出的目標(biāo)波長分量通過或停止，其中反向色散元件通過將通過光閘的目標(biāo)波長分量混合產(chǎn)生復(fù)合光脈沖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描激光顯微鏡，其中所述波長選擇裝置包括一個(gè)或多個(gè)波長選擇元件，其用于只分別選擇出色散光的目標(biāo)波長分量，和開/關(guān)機(jī)構(gòu)，其用于啟動(dòng)或禁止每個(gè)波長選擇元件；和所述反向色散元件通過將由啟動(dòng)的波長選擇元件選擇的目標(biāo)波長分量混合而產(chǎn)生復(fù)合光脈沖。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描激光顯微鏡，其中所述波長選擇機(jī)構(gòu)包括多個(gè)波長選擇元件，它們用于只選擇出色散光的目標(biāo)波長分量，和轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，其用于選擇性地轉(zhuǎn)換所述多個(gè)波長選擇元件；和所述反向色散元件通過將由轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)選擇的波長選擇元件所選擇的目標(biāo)波長分量混合而產(chǎn)生復(fù)合光脈沖。
全文摘要
一種掃描激光顯微鏡，包括a)光源，其用于采用超短光脈沖產(chǎn)生連續(xù)光譜白光脈沖；b)色散元件，其將超短光脈沖產(chǎn)生色散為光譜；c)波長選擇裝置，其只選擇出所述色散光中包括的多個(gè)目標(biāo)波長分量；d)反向色散元件，該反向色散元件將所述選擇出的多個(gè)目標(biāo)波長分量混合為復(fù)合光脈沖；和e)掃描光學(xué)系統(tǒng)，其用于將復(fù)合光脈沖掃描至樣本上。
文檔編號G01N21/64GK1619293SQ20041010028
公開日2005年5月25日 申請日期2002年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月6日
發(fā)明者伊東一良, 福井希一, 大久保邦彥 申請人:株式會社島津制作所