專利名稱：對樣品中分析物的診斷試驗的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及檢測樣品中分析物的側(cè)流快速目測試驗。
相關(guān)技術(shù)描述側(cè)流檢測裝置在本領(lǐng)域公知，在臨床診斷中可以用來檢測樣品如體液中是否含有目標(biāo)分析物。但是，這些裝置一般需要比較大的樣品體積和大量的偶聯(lián)物。在能夠讀取試驗結(jié)果之前也需要較長的等待時間。
發(fā)明概述一方面，提供了一種免疫診斷試紙條，用于檢測樣品中的目標(biāo)分析物。在一些實施方案中，分析物是抗體，如抗人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體或抗丙型肝炎病毒(HCV)抗體。在另外一些實施方案中，分析物是抗原，如人絨毛膜促性腺激素(hCG)。
該診斷試紙條優(yōu)選地包括含有設(shè)計用來結(jié)合目標(biāo)分析物的偶聯(lián)物的偶聯(lián)物來源區(qū)，位于偶聯(lián)物來源區(qū)下游并設(shè)計用來接收液體樣品的加樣區(qū)，和檢測區(qū)。檢測區(qū)位于偶聯(lián)物來源區(qū)下游，包括能夠特異性結(jié)合目標(biāo)分析物的固定的結(jié)合劑。例如，如果目標(biāo)分析物是抗體，則陽性檢測區(qū)優(yōu)選地包括固定的抗原。如果目標(biāo)分析物是抗原，則陽性檢測區(qū)優(yōu)選地包括固定的抗體。偶聯(lián)物包括能夠結(jié)合目標(biāo)分析物的第一結(jié)合成分和第二顯示成分。
試驗中使用的樣品可以是任何液體。優(yōu)選的樣品包括，例如，血液、血清、血漿、唾液和尿。將樣品加到陽性檢測區(qū)，接著使偶聯(lián)物從偶聯(lián)物來源區(qū)流出。偶聯(lián)物流動穿過膜，接觸已經(jīng)結(jié)合到陽性檢測區(qū)的所有分析物，產(chǎn)生可見信號。
在一個優(yōu)選實施方案中，試紙條包括具有固定的HIV抗原的檢測區(qū)，用于檢測抗HIV抗體。在該實施方案中，該試驗可用于診斷患者的HIV感染。在另一個優(yōu)選實施方案中，試紙條包括具有固定的HCV抗原的檢測區(qū)，用于檢測樣品中的抗HCV抗體。在該實施方案中，該試驗可用于診斷患者的HCV感染。在又一個實施方案中，試紙條包括具有固定的抗hCG抗體的檢測區(qū)。在該實施方案中，該試驗可用于確定個體是否懷孕。
偶聯(lián)物來源區(qū)優(yōu)選地包括干燥的偶聯(lián)物。例如，偶聯(lián)物來源區(qū)可以是偶聯(lián)物墊，偶聯(lián)物在其上干燥。偶聯(lián)物墊優(yōu)選地與膜流體連通。在一些實施方案中，向加樣區(qū)加樣后，偶聯(lián)物墊移動至與膜流體連通。在另一個實施方案中，偶聯(lián)物來源區(qū)是膜的一部分，偶聯(lián)物在其上干燥。
優(yōu)選地重懸浮干燥的偶聯(lián)物，通過使偶聯(lián)物來源區(qū)接觸洗滌緩沖液使偶聯(lián)物流動。在一個實施方案中，洗滌緩沖液含有約0.1％的封閉劑，優(yōu)選的是封閉蛋白，如酪蛋白。洗滌緩沖液優(yōu)選地也含有約0.1％的去污劑，優(yōu)選的是非離子型去污劑，例如Triton X100TM。在一個實施方案中，洗滌緩沖液含有約0.025％HEPES，約0.85％氯化鈉，約0.1％EDTA，約1％甘露醇，約0.1％酪蛋白，和約1％Triton X100TM去污劑。
在另一個實施方案中，偶聯(lián)物懸浮于緩沖液中。通過將含有偶聯(lián)物的緩沖液加至偶聯(lián)物來源區(qū)上使偶聯(lián)物流動至檢測區(qū)。
在一個特定的實施方案中，偶聯(lián)物包括與膠體金偶聯(lián)的蛋白A。在其他實施方案中，偶聯(lián)物包括與膠體金偶聯(lián)的抗體，優(yōu)選單克隆抗體。優(yōu)選地，膠體金的粒徑為約20納米至約80納米。
在另一個實施方案中，試紙條還包括位于膜上檢測區(qū)下游的對照區(qū)。對照區(qū)優(yōu)選地包括能夠結(jié)合偶聯(lián)物的對照結(jié)合劑。例如，如果目標(biāo)分析物是抗體且偶聯(lián)物包括抗體結(jié)合劑如蛋白A，則對照結(jié)合劑可以是兔IgG。如果目標(biāo)分析物是抗原且偶聯(lián)物包括該抗原特異性的單克隆抗體，則對照結(jié)合劑可以是例如蛋白A。
試紙條可以包括一種或一種以上的其他組件。緩沖液墊可以與偶聯(lián)物來源區(qū)流體連通，這樣向緩沖液墊上施加洗滌緩沖液可以使偶聯(lián)物從偶聯(lián)物來源區(qū)流出，穿過膜，接觸到檢測區(qū)。吸水帶和吸水墊可以位于膜的下游，當(dāng)緩沖液通過膜時用來吸收過量的緩沖液。干燥劑片也可以靠近膜，用來吸收過量的液體和濕氣。
試紙條可以任選地放置在外殼例如塑料外殼中。外殼優(yōu)選地包括位于檢測區(qū)和對照區(qū)上方的樣品窗口，和位于檢測區(qū)上游的緩沖液窗口。
還提供了檢測液體樣品中的分析物的方法，包括將樣品加到膜的檢測區(qū)，然后使檢測區(qū)接觸一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物能夠結(jié)合目標(biāo)分析物并產(chǎn)生指示結(jié)合的可見信號。
附圖簡述

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明一個方面的檢測卡。
圖2顯示根據(jù)本發(fā)明一個方面的檢測卡的頂視圖。
圖3顯示根據(jù)本發(fā)明一個方面的檢測卡的側(cè)視圖。
圖4顯示包括根據(jù)一個實施方案的試紙條的組件的剖視圖。
圖5顯示具有陽性結(jié)果的檢測卡，表明在樣品中檢測到目標(biāo)分析物。
圖6顯示具有陰性結(jié)果的檢測卡，表明在樣品中未檢測到目標(biāo)分析物。
圖7顯示根據(jù)本發(fā)明另一方面的帶有樣品杯的試紙條。
優(yōu)選實施方案詳述提供了用于快速檢測樣品中是否含有分析物的診斷裝置和方法。根據(jù)對用于檢測樣品中抗體或抗原的免疫診斷裝置的概述，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到本發(fā)明可以毫不困難地被變通以檢測所有目標(biāo)分析物。
過去，免疫診斷裝置一般包括預(yù)混合偶聯(lián)物與將要分析是否含有抗體的樣品。例如，在一些裝置中，加入液體樣品溶解干燥的偶聯(lián)物，以便預(yù)混合樣品與偶聯(lián)物。如果含有要檢測的抗體，則該抗體與偶聯(lián)物結(jié)合，并且在包括固定抗原的下游檢測區(qū)顯示。但是在該系統(tǒng)中，偶聯(lián)物與樣品中其他抗體或其他化合物的非特異性相互作用導(dǎo)致偶聯(lián)物信號淬滅。因此需要大量的偶聯(lián)物。由于使用大量的偶聯(lián)物，需要較長時間來清除反應(yīng)，從而延長了獲得試驗結(jié)果所需的時間。另外，該試驗的靈敏度使得為了產(chǎn)生可見的陽性信號，在檢測區(qū)需要大量的抗原。
本發(fā)明通過使檢測區(qū)直接接觸樣品，從而使所有目標(biāo)分析物都能夠特異性結(jié)合固定的結(jié)合劑，克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。例如，目標(biāo)抗體能夠結(jié)合固定的抗原。然后將偶聯(lián)物與緩沖液加至檢測區(qū)。緩沖液的溶劑前沿將未結(jié)合的化合物推出檢測區(qū)，從而減少了與偶聯(lián)物的非特異性相互作用。因此需要的偶聯(lián)物的量大大減少，反應(yīng)速度從而提高。另外，反應(yīng)靈敏度也得以提高，從而允許檢測區(qū)使用較少的抗原。
例如，所述的裝置和方法可以用來診斷患者的疾病與不適，例如人類免疫缺陷病毒(HIV)或肝炎病毒。也可以用來確定個體是否懷孕。根據(jù)下文的內(nèi)容，其他用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的。
定義除非另外定義，這里的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所知的相同的含意。本發(fā)明的實行中可以使用與本文所述相似或相當(dāng)?shù)乃蟹椒ā⒀b置和材料。
“目標(biāo)分析物”是指將要檢測它在樣品中是否存在的任何分子或化合物。分析物可以包括但不限于病毒抗原，細(xì)菌抗原，激素如胰島素、卵泡刺激素(FSH)、促甲狀腺素、松弛素、生長素和促性腺激素，酶，免疫球蛋白，細(xì)胞因子，藥物，癌抗原，抗原性多糖，和核酸?？梢杂锰峁┑姆椒ê脱b置在樣品中檢測的其他分析物對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。特別優(yōu)選的目標(biāo)分析物包括抗-HIV抗體、抗-HCV抗體和人絨毛膜促性腺激素(hCG)。
術(shù)語“偶聯(lián)物”是指設(shè)計用來結(jié)合目標(biāo)分析物并產(chǎn)生可檢測信號的組合物。偶聯(lián)物一般包括與標(biāo)記物偶聯(lián)的結(jié)合成分。該結(jié)合成分使偶聯(lián)物能夠結(jié)合目標(biāo)分析物，任選地結(jié)合對照化合物。標(biāo)記物產(chǎn)生可檢測信號，優(yōu)選可見信號。在一個實施方案中，只在偶聯(lián)物與分析物結(jié)合時才產(chǎn)生可見信號。在一個優(yōu)選實施方案中，目標(biāo)分析物是抗體且偶聯(lián)物包括能夠結(jié)合抗體的結(jié)合成分。例如，第一結(jié)合成分可以是蛋白A，盡管也可以使用其他能夠結(jié)合抗體的分子。在另一個實施方案中，目標(biāo)分析物是抗原且偶聯(lián)物的結(jié)合成分包括能夠結(jié)合抗原的抗體?？贵w優(yōu)選地是單克隆抗體。
標(biāo)記物是能夠與結(jié)合成分附著或偶聯(lián)并且能夠產(chǎn)生可檢測信號的任何分子或化合物。一種優(yōu)選的標(biāo)記物是膠體金。或者，標(biāo)記物還可以是例如染色的乳膠顆粒、膠體銀或其他膠體金屬、膠體黑或本領(lǐng)域公知的其他成分。優(yōu)選地，標(biāo)記物的粒徑不會干擾結(jié)合成分結(jié)合目標(biāo)分析物的能力。例如，當(dāng)結(jié)合成分為蛋白A時，標(biāo)記物的粒徑優(yōu)選為約5納米至約120納米，更優(yōu)選約20納米至約80納米。
偶聯(lián)物優(yōu)選地在可以穩(wěn)定并保存該偶聯(lián)物的“偶聯(lián)緩沖液”中制備。在一個實施方案中，如下文詳細(xì)描述，在偶聯(lián)緩沖液中制備偶聯(lián)物后，偶聯(lián)物可以在 “偶聯(lián)物墊”上干燥。在基底上干燥的偶聯(lián)物被認(rèn)為是“可擴散結(jié)合的”。如果能夠引起擴散或流動，例如將其與緩沖液接觸，則偶聯(lián)物是“可擴散結(jié)合的”。例如，通過干燥而可擴散結(jié)合到偶聯(lián)物來源區(qū)上的偶聯(lián)物可以用緩沖液溶解，從而使其沿試紙條的膜流動。
“對照偶聯(lián)物”是這樣一種偶聯(lián)物，其中結(jié)合成分對于對照化合物是特異性的。當(dāng)可能所有偶聯(lián)物都與檢測線上的分析物結(jié)合而無法用作對照時，優(yōu)選使用對照偶聯(lián)物。對照化合物一般是所分析的樣品中已知的，并且能夠結(jié)合對照帶上的對照結(jié)合劑。任選地，對照偶聯(lián)物的結(jié)合成分對于檢測膜的對照區(qū)中存在的化合物可能是特異性的。
偶聯(lián)物優(yōu)選地存在于“偶聯(lián)物來源區(qū)”中。偶聯(lián)物來源區(qū)一般包括與之可擴散結(jié)合的偶聯(lián)物，如干燥的偶聯(lián)物?；蛘?，偶聯(lián)物來源區(qū)可能包括懸浮于緩沖液如洗滌緩沖液或偶聯(lián)物緩沖液中的偶聯(lián)物。在一個實施方案中，偶聯(lián)物來源區(qū)是偶聯(lián)物墊，包括干燥的偶聯(lián)物，與檢測膜流體連通。在另外一個實施方案中，偶聯(lián)物來源區(qū)是檢測膜的一部分，偶聯(lián)物在其上干燥。在另外一個實施方案中，偶聯(lián)物來源區(qū)是緩沖液墊，可以向上面施加包含偶聯(lián)物的緩沖液，它與檢測膜流體連通。偶聯(lián)物來源區(qū)一般位于檢測膜的檢測區(qū)的上游，從而在加入包含偶聯(lián)物的溶液后或在可擴散結(jié)合的偶聯(lián)物溶解后，偶聯(lián)物流動穿過檢測膜，與檢測區(qū)接觸。
偶聯(lián)物優(yōu)選地用如下文詳細(xì)描述的“洗滌緩沖液”溶解。簡單的說，洗滌緩沖液是優(yōu)選含有“封閉劑”的緩沖溶液。封閉劑為本領(lǐng)域所公知，包括減少非特異性相互作用如非特異性抗體結(jié)合的任何分子或化合物。優(yōu)選的封閉劑是蛋白質(zhì)，如酪蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。可用的其他封閉劑可以購到，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道。
“樣品緩沖液”是優(yōu)選不含偶聯(lián)物的緩沖溶液。在一些實施方案中，樣品緩沖液含有封閉劑，而在另外一些實施方案中，它不含封閉劑。任選地可以在加樣之前將樣品緩沖液施加到膜上，如下文詳細(xì)描述的。
“檢測膜”是一種固體支持物，包括檢測區(qū)，和任選的對照區(qū)。待分析的樣品一般直接施加到檢測膜上，使其接觸檢測區(qū)和對照區(qū)。檢測膜可以是任何固體支持物，分析物結(jié)合劑和對照結(jié)合劑可以附著在上面。檢測膜優(yōu)選的是硝酸纖維素。
檢測膜為液體提供側(cè)流通道。如果液體如液體樣品或緩沖液能夠從一個組件流向另一個組件，則稱檢測膜和試紙條的其他組件是“流體連通的”。如果試紙條的組件彼此接觸，則它們是流體連通的。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，流體連通不需要兩個特定組件直接接觸。
“檢測區(qū)”、“檢測帶”和“檢測線”可以交換使用，都是指檢測膜上分析物結(jié)合劑所附著的區(qū)域。
“分析物結(jié)合劑”、“特異性結(jié)合配體”或“結(jié)合成分”是設(shè)計用來特異性結(jié)合目標(biāo)分析物的任何分子或化合物。例如，但并非限于，分析物結(jié)合劑可以包括抗原、抗體、受體、其他多肽、肽、半抗原、凝集素、核酸包括寡核苷酸或小分子。在一個實施方案中，分析物結(jié)合劑是一種抗原，它對于樣品中的待測抗體是特異性的。在另外一個實施方案中，分析物結(jié)合化合物是目標(biāo)抗原特異性的抗體。
“對照區(qū)”、“對照帶”和“對照線”可以交換使用，都是指膜上對照結(jié)合劑所附著的區(qū)域。
“對照結(jié)合劑”是能夠特異性結(jié)合偶聯(lián)物或?qū)φ张悸?lián)物的任何分子或化合物。
“試紙條”是指能夠用來檢測樣品中是否含有分析物的完整裝置。試紙條優(yōu)選地至少包括具有檢測區(qū)和對照區(qū)的檢測膜。如下文所述，試紙條可以放置在外殼如塑料外殼中。或者，試紙條也可以沒有外殼。如果放置在外殼中，試紙條和外殼一起可以被稱為“檢測卡”。
“檢測卡窗口”和“樣品窗口”是指檢測卡外殼上的孔，通過它可以加樣。檢測卡窗口優(yōu)選地位于檢測區(qū)和對照區(qū)的上方。檢測卡窗口也優(yōu)選允許觀察試驗結(jié)果。
“緩沖液窗口”是指檢測卡外殼上的孔，通過它可以施加緩沖液。在一個實施方案中，緩沖液窗口的位置優(yōu)選地允許將緩沖液施加到緩沖液墊上。在另外一個實施方案中，緩沖液窗口的位置允許將緩沖液直接施加到檢測膜上。
“體積指示劑窗口”是指檢測卡外殼上的孔，通過它可以看到可見的樣品體積指示劑。體積指示劑窗口位于樣品窗口下游。樣品體積指示劑發(fā)出信號指示已經(jīng)有可接受的樣品體積接觸到檢測區(qū)。樣品體積指示劑可以是例如亞甲基藍(lán)或其他有色化合物，施加至緊鄰體積指示劑窗口上游的膜上。樣品體積指示劑由于樣品的移動而被攜帶穿過體積指示劑窗口，在窗口內(nèi)產(chǎn)生可見信號。在其他實施方案中，樣品體積指示劑是在接觸樣品時改變顏色的化合物，例如pH指示劑。當(dāng)需要大樣品體積時，例如當(dāng)認(rèn)為在樣品中含有低濃度的目標(biāo)分析物時，一般使用樣品體積指示劑。例如，在分析尿中是否含有hCG時，優(yōu)選使用樣品體積指示劑。
“樣品”是指將要分析其是否含有目標(biāo)分析物的任何材料。樣品優(yōu)選為液體形式。代表性的樣品包括但不限于體液例如全血、血漿、血清、唾液和尿。如下文更詳細(xì)描述的，樣品可以是固體。但是在此情況下，樣品在用于試驗前優(yōu)選地溶解或提取。
“加樣區(qū)”是膜上施加樣品的位置。加樣區(qū)優(yōu)選地位于偶聯(lián)物來源區(qū)的下游和檢測區(qū)的上游。加樣區(qū)更優(yōu)選地包括檢測區(qū)。樣品可以直接施加到加樣區(qū)，例如通過移液管，或者間接施加，例如通過與膜接觸的引流條(wick)。
使用的術(shù)語“抗體”為其最寬的含意，包括例如但不限于完整抗體及單鏈抗體、抗體片段和嵌合抗體，只要它們保留需要的結(jié)合特異性。
檢測卡本文公開的診斷裝置優(yōu)選包括檢測卡1，如圖1-3所示。圖1示出了檢測卡1，包括塑料外殼10，塑料外殼10具有扣合在一起的上部15和下部18。塑料外殼10的上部15上有兩個開口樣品窗口20和緩沖液窗口30。樣品窗口20允許將樣品施加到容納于塑料外殼10內(nèi)的膜的加樣區(qū)。加樣區(qū)優(yōu)選包括檢測區(qū)140。對照區(qū)150優(yōu)選位于膜上檢測區(qū)140的下游。緩沖液窗口30允許將緩沖液施加到偶聯(lián)物來源區(qū)50。膜是下文詳述的試紙條的一部分。
在一些實施方案中，進(jìn)一步任選的體積指示劑窗口(未示出)位于檢測區(qū)下游。如果有體積指示劑窗口，則它允許使用者觀察檢測區(qū)下游的膜上的指示劑，例如顏色改變。指示劑發(fā)出信號指示已經(jīng)有足夠體積的樣品接觸到檢測區(qū)，使用者可以繼續(xù)將檢測區(qū)與偶聯(lián)物接觸，從而如下文所述檢測結(jié)合的分析物，例如通過將緩沖液施加到偶聯(lián)物來源區(qū)。
圖2示出了檢測卡1的頂視圖，顯示了塑料外殼10上的樣品窗口20和緩沖液窗口30。膜檢測區(qū)140通過樣品窗口20可以達(dá)到，偶聯(lián)物來源區(qū)50通過緩沖液窗口30可以達(dá)到。對照區(qū)150位于檢測區(qū)140下游。盡管示出的樣品窗口40是矩形的而示出的緩沖液窗口30是圓形的，但是窗口可以是任何形狀或大小的。但是，它們的形狀和大小優(yōu)選地能夠引導(dǎo)樣品至膜的加樣區(qū)40，引導(dǎo)緩沖液至偶聯(lián)物來源區(qū)50。另外，樣品窗口的結(jié)構(gòu)被設(shè)計允許在獲得陽性結(jié)果時觀察檢測區(qū)140，以及對照區(qū)150。
圖3示出了一個示例性檢測卡1的側(cè)視圖。示出了塑料外殼10的上部15和下部18。塑料外殼10的上部15的膨脹端(60)位于緩沖液窗口(未示出)的遠(yuǎn)端，允許在檢測卡(1)內(nèi)放置吸水材料，例如吸水墊或干燥劑片。膨脹端(60)的大小取決于所用吸水材料的量，從而取決于試驗中使用的樣品和緩沖液的體積。
試紙條試紙條包括具有至少一個檢測區(qū)的檢測膜。目標(biāo)分析物特異性的分析物結(jié)合劑結(jié)合或者固定到檢測區(qū)。如果樣品中含有目標(biāo)分析物，則在試驗結(jié)束時至少一部分檢測區(qū)可見。在一個特定實施方案中，檢測區(qū)包括固定的抗原，該試驗允許檢測樣品如生物流體中的特定抗體。在另外一個實施方案中，檢測區(qū)包括結(jié)合的抗體，該試驗允許檢測樣品中的特定抗原。
將樣品施加到位于偶聯(lián)物來源區(qū)下游例如偶聯(lián)物墊下游的加樣區(qū)。在優(yōu)選實施方案中，加樣區(qū)包括檢測區(qū)。但是在其他實施方案中，加樣區(qū)位于檢測區(qū)上游，樣品從加樣區(qū)向檢測區(qū)流動。
圖4示出了試紙條的一個優(yōu)選實施方案。用于檢測樣品是否含有目標(biāo)分析物如抗體的試紙條100優(yōu)選包括與偶聯(lián)物墊120相接觸的緩沖液墊110。偶聯(lián)物墊120又接觸包括檢測區(qū)140和對照區(qū)150的檢測膜130。膜130又接觸吸水墊160。吸水墊160任選地接觸另一吸水紙170。吸水墊160和/或任選的吸水紙170可能進(jìn)一步接觸任選的干燥劑180，如干燥劑片。
在一些實施方案中，一個可移除的濾器架190與試紙條100連接。濾器架190包括濾紙200。當(dāng)濾器架190與試紙條100連接時，濾紙200直接位于優(yōu)選包括檢測區(qū)140和對照區(qū)150的加樣區(qū)上方。
必須向檢測區(qū)提供足夠的樣品，以確保如果樣品中含有分析物則在試驗結(jié)束時可見陽性結(jié)果。因此，對于懷疑在樣品中低濃度存在的分析物，例如抗原如尿中的hCG，需要較大的樣品體積。試紙條100可以設(shè)置為接收較大的樣品體積。圖7示出了一個這樣的實施方案，其中樣品杯500與試紙條100連接。樣品杯500包括一個用于容納一定體積液體樣品的容器。樣品杯一般在底部有一個開口，允許樣品流出樣品杯500并接觸檢測膜130。因此，樣品杯500的位置使得樣品從樣品杯500向檢測膜130的加樣區(qū)流動，并接觸檢測區(qū)140和對照區(qū)150。加樣區(qū)優(yōu)選包括檢測區(qū)140和對照區(qū)150，樣品杯500直接位于檢測區(qū)140和對照區(qū)150的上方。樣品杯500任選地可包括濾器，樣品在接觸檢測膜之前通過該濾器。
當(dāng)樣品杯與檢測卡連接時，樣品可能沉積在樣品杯中。在另外一個實施方案中，將樣品置于檢測杯中，檢測杯然后與檢測卡連接，從而使樣品流到加樣區(qū)。
希望確保在偶聯(lián)物流到檢測區(qū)140之前，含有可檢測量分析物(如果含有的話)的一定體積的樣品接觸檢測區(qū)140。樣品體積指示劑，例如指示染料，位于檢測區(qū)140和對照區(qū)150下游，可以用來確定已有足量的樣品接觸檢測區(qū)140和對照區(qū)150。例如，可以將指示染料如亞甲基藍(lán)施加到檢測膜下游的吸水墊160或吸水紙170上。液體樣品沿吸水墊160或吸水紙170流動使染料流動，產(chǎn)生可見信號，例如可見的藍(lán)色。該信號可以通過檢測卡窗口中的體積指示窗口(未示出)觀察。
在一些實施方案中，特別是在施加大樣品體積(大于約50μl)的實施方案中，偶聯(lián)物墊120不與檢測膜130流體連通。圖7示出了一個這樣的實施方案。偶聯(lián)物墊120與檢測膜130的分離防止了在樣品接觸檢測區(qū)140之前偶聯(lián)物與樣品混合。在樣品接觸檢測區(qū)140和對照區(qū)150之后，偶聯(lián)物墊120移至與檢測膜130流體連通。然后向緩沖液墊110上施加緩沖液，開始試驗。緩沖液可以通過緩沖液窗口直接施加到緩沖液墊110上，或者通過折斷容納緩沖液的安瓿300施加，從而使緩沖液流到緩沖液墊110上。在一個實施方案中，在移動偶聯(lián)物墊120與膜130流體連通之前將緩沖液施加到緩沖液墊110上。在可供選擇的實施方案中，緩沖液直接施加到偶聯(lián)物墊120上。
使偶聯(lián)物墊120移至與膜130流體連通的方法沒有任何限制。在一個實施方案中，使用者滑動與偶聯(lián)物墊120和任選的緩沖液墊110相連接的外殼可移動部分，從而使偶聯(lián)物墊120接觸膜130。移動偶聯(lián)物墊120使之與檢測膜110流體連通的機構(gòu)優(yōu)選地也可以折斷緩沖液安瓿300。該機構(gòu)還可以從試紙條110上取下樣品杯500。
干燥劑片180優(yōu)選地與吸水紙170流體連通。選擇干燥劑片180的大小，使其能夠吸收施加到檢測膜130上的全部體積的樣品。干燥劑片和任何其他吸水材料位于加樣區(qū)下游，促進(jìn)樣品穿過檢測區(qū)流動。
在其他實施方案中，用接觸液體樣品的引流條代替樣品杯。樣品沿引流條向檢測膜的加樣區(qū)流動，并接觸檢測區(qū)和對照區(qū)。在一個特定實施方案中，將引流條置于尿流中，以分析尿中是否含有分析物，例如hCG。在這些實施方案中，在樣品加至引流條期間中，偶聯(lián)物墊優(yōu)選地不與檢測膜流體連通。在足夠的樣品接觸檢測區(qū)后，偶聯(lián)物墊移至接觸檢測膜。移動偶聯(lián)物墊的機構(gòu)還可以用來移除引流條。隨后將緩沖液加到緩沖液墊上，或者直接加到偶聯(lián)物墊上，開始試驗。如上所述，緩沖液可以通過緩沖液窗口直接加到緩沖液墊上?；蛘?，緩沖液可以容納在檢測卡內(nèi)的安瓿中，通過折斷或以其他方式打開安瓿使緩沖液向緩沖液墊和/或偶聯(lián)物墊流動。
試紙條優(yōu)選地容納在外殼內(nèi)，如圖2所示并如上所述。
圖5顯示陽性試驗結(jié)果，表明樣品中含有目標(biāo)分析物。通過樣品窗口20可見膜130的檢測區(qū)140為一條線。另外，通過樣品窗口20可見對照區(qū)150為一條線，表明偶聯(lián)物從偶聯(lián)物來源區(qū)50流出穿過檢測區(qū)140。相反，圖6顯示陰性結(jié)果。陰性結(jié)果是，通過樣品窗口20只可見對照區(qū)150為一條線。而且，對照表明偶聯(lián)物從偶聯(lián)物來源區(qū)50流出穿過檢測區(qū)140。因此，檢測區(qū)140沒有線是不含結(jié)合的目標(biāo)分析物的結(jié)果。
試紙條的使用將要檢測其是否含有特定目標(biāo)分析物的樣品加到檢測膜的加樣區(qū)上，使它接觸檢測區(qū)。在優(yōu)選實施方案中，在偶聯(lián)物接觸檢測區(qū)之前將樣品施加至膜上，使之接觸檢測區(qū)。因此，如果樣品中含有目標(biāo)分析物，則目標(biāo)分析物有機會在偶聯(lián)物結(jié)合之前結(jié)合檢測區(qū)中的分析物結(jié)合劑。
如果試紙條在外殼內(nèi)，優(yōu)選地通過樣品窗口加樣。在此情況下，膜包括通過樣品窗口可及的加樣區(qū)。優(yōu)選地加樣區(qū)包括至少一個陽性檢測區(qū)。更優(yōu)選地，加樣區(qū)包括檢測區(qū)和對照區(qū)?；蛘撸梢酝ㄟ^引流條或樣品杯加樣，使得樣品向膜的加樣區(qū)流動并接觸檢測區(qū)和對照區(qū)。
如果試紙條不在外殼內(nèi)，可以將樣品直接施加到優(yōu)選包括檢測區(qū)和對照區(qū)的膜的加樣區(qū)?；蛘撸梢詫悠芳拥侥ど衔挥跈z測區(qū)上游的加樣區(qū)，使之流動穿過膜，接觸檢測區(qū)。但是優(yōu)選地在將偶聯(lián)物加到膜上之前使樣品接觸檢測區(qū)。
在一個實施方案中，收集樣品或?qū)悠分糜跇悠繁?。樣品杯與外殼連接，允許樣品向膜的加樣區(qū)流動并接觸檢測區(qū)和對照區(qū)。如果樣品體積大于約10μl，優(yōu)選使用樣品杯。樣品杯可以任選地包括濾器，樣品通過濾器之后接觸膜。
在另外一個實施方案中，將樣品加到與膜接觸的引流條上。引流條可使樣品向膜的加樣區(qū)流動并接觸檢測區(qū)和對照區(qū)。引流條優(yōu)選地由玻璃紙、聚酯，纖維素或可使樣品向包括檢測區(qū)的膜上遷移的其他材料組成。如果檢測卡在外殼內(nèi)，則引流條可能從外殼突出，從而允許接近引流條以便加樣。例如，如果要檢測尿中是否含有特定分析物，例如hCG，可以把引流條放置在受檢者的尿流中。在另外一個實施方案中，引流條可以接觸待分析的樣品，例如體液，如唾液。
優(yōu)選地將待測樣品以液體形式加到膜的加樣區(qū)?？梢苑治龅拇硇詷悠钒ǖ幌抻谘?、血漿、全血、唾液和尿。固體或半固體樣品在加樣前可以增溶然后加到膜上或者提取。
在其他實施方案中，在加樣之前向膜上施加優(yōu)選不含偶聯(lián)物的樣品緩沖液。在一些實施方案中，樣品緩沖液含有封閉劑。優(yōu)選地將樣品緩沖液加到膜上的加樣區(qū)。優(yōu)選向膜上施加約1μl至約25μl的樣品緩沖液，更優(yōu)選約1μl至約10μl，更優(yōu)選約1μl至約5μl。在一個特別的實施方案中，向膜的加樣區(qū)施加5μl樣品緩沖液，然后加5μl血清、血漿、全血或其他液體樣品。如下文所述在HCV檢測中，以及在使用粘性樣品時，在施加洗滌緩沖液之前施加樣品緩沖液是特別優(yōu)選的。樣品緩沖液的使用提高了試驗的靈敏度，并且使粘性樣品可以更快地流動。
樣品緩沖液優(yōu)選含有緩沖劑和防腐劑。任選地，也可含有一種或多種去污劑和/或糖?？梢允褂萌魏尉彌_劑，優(yōu)選地以保持樣品緩沖液的期望pH的量使用。樣品緩沖液的pH優(yōu)選為約7.2至約7.6。例如，但并非限制，緩沖液可以選自HEPES、Tris和磷酸緩沖液。在一個優(yōu)選實施方案中，樣品緩沖液含有約0.01％至約0.5％HEPES，更優(yōu)選約0.02％至約0.05％HEPES。在另外一個實施方案中，樣品緩沖液含有約0.01％至約0.5％磷酸鹽，更優(yōu)選約0.02％至約0.05％磷酸鹽。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠調(diào)節(jié)緩沖劑的量以保持需要的pH。
樣品緩沖液優(yōu)選地還含有防腐劑，如疊氮鈉或Proclin。在一個優(yōu)選實施方案中，樣品緩沖液含有約0.1％至約1.0％疊氮鈉，更優(yōu)選約0.1％至約0.2％，更優(yōu)選約0.2％。
根據(jù)待測樣品的性質(zhì)，任選地將樣品通過濾器加到膜上。優(yōu)選過濾的代表性樣品材料包括全血、糞便樣品、尿、食物提取物和污物提取物。在一個實施方案中，全血通過濾膜加樣。濾膜除去污染物而使分析物如抗體通過，從而提高了試驗靈敏度。濾膜優(yōu)選地容納在必要時能夠與檢測卡或試紙條連接的容器中。如果與檢測卡連接，濾膜優(yōu)選地直接連接到樣品窗口上方。過濾介質(zhì)根據(jù)所要過濾的樣品的類型來選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠進(jìn)行這種選擇。例如對于全血樣品，過濾材料可以是但不限于Pall BTS-SP300TM。
如上所述，濾器優(yōu)選地通過一個可移除的濾器架與試紙條連接，但是對于特定用途，濾器可以永久固定。濾器架一般是扣合在檢測卡外殼上的裝置。該裝置的設(shè)計和類型可能不同，但是一般是由聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或其他塑料制成的。
檢測區(qū)是膜的一部分，包被了能夠特異性結(jié)合目標(biāo)分析物的結(jié)合劑，優(yōu)選蛋白質(zhì)。例如，陽性檢測區(qū)可以包被目標(biāo)抗體特異性的抗原。在特定實施方案中，檢測區(qū)包括結(jié)合的HIV抗原或肝炎抗原，如以下的實施例所詳述。當(dāng)檢測區(qū)包括抗原時，優(yōu)選使用約0.025μg至約0.4μg抗原。
在其他實施方案中，在檢測區(qū)固定目標(biāo)抗原特異性的抗體。該抗體可以是多克隆或單克隆抗體。當(dāng)檢測區(qū)包括抗體時，優(yōu)選施加約0.1μg至約20μg抗體，更優(yōu)選約0.2μg至約2μg，更優(yōu)選約0.5μg至約1μg。在一個特定實施方案中，檢測區(qū)包括抗hCG抗體，優(yōu)選抗hCG單克隆抗體。
結(jié)合劑可以以任何希望的模式施加到膜上；因此可見的陽性試驗結(jié)果可能是任何形狀。在一個優(yōu)選實施方案中，檢測區(qū)是線形的，形成一條從膜的一側(cè)向另一側(cè)延長的線，從而在獲得陽性結(jié)果時出現(xiàn)穿過樣品窗口的一條垂直線，表明樣品中含有分析物。在其他實施方案中，檢測區(qū)的形狀類似于一個符號，例如“+”。
用一個試紙條能夠檢測一種以上的分析物。在這種情況下，在檢測膜上制備另外的陽性檢測區(qū)。例如，第二個陽性檢測區(qū)可以包括針對第二類抗體的抗原或針對第二類抗原的抗體。在另外的陽性檢測區(qū)上的結(jié)合劑不一定與第一檢測區(qū)上的結(jié)合劑具有相同的類型。因此，第一檢測區(qū)上的結(jié)合劑可以是抗體，而第二檢測區(qū)上的結(jié)合劑可以是抗原。這樣可以分析樣品中是否含有一種以上的分析物。
每一個另外的陽性檢測區(qū)都可能與第一檢測區(qū)有不同的形狀，從而使使用者能夠容易地辨別陽性結(jié)果的性質(zhì)。根據(jù)所要檢測的其他分析物的類型，能夠結(jié)合不同分析物的其他偶聯(lián)物可能是必需的。例如，如果目標(biāo)分析物是兩種不同的抗體，可以使用單一的一種含有蛋白A的偶聯(lián)物。但是，如果一種分析物是抗體而第二種分析物是抗原，則需要兩種不同的偶聯(lián)物，一種特異性結(jié)合該抗體，而另一種特異性結(jié)合該抗原。
對照區(qū)優(yōu)選地包括能夠結(jié)合偶聯(lián)物的對照結(jié)合劑。通過使對照區(qū)位于陽性檢測區(qū)的下游，對照區(qū)上的反應(yīng)表明偶聯(lián)物遷移穿過檢測區(qū)，如果含有目標(biāo)分析物則可以在該檢測區(qū)反應(yīng)。如果偶聯(lián)物設(shè)計用來識別抗體，則對照區(qū)優(yōu)選地包括免疫球蛋白，例如兔IgG。如果偶聯(lián)物包括抗體，則對照區(qū)優(yōu)選地包括抗體結(jié)合劑如蛋白A。對照區(qū)可以是任何需要的形狀，如線形或符號，例如“-”。
在其他實施方案中，對照區(qū)包括能夠結(jié)合對照偶聯(lián)物的對照結(jié)合劑。例如，對照區(qū)可包括β-gal，對照偶聯(lián)物可包括與金偶聯(lián)的β-半乳糖苷酶。
結(jié)合劑和對照結(jié)合劑可以用本領(lǐng)域公知的任何方法加到檢測膜上。施加方法一般是通過使檢測膜接觸結(jié)合劑，例如使用泵分配系統(tǒng)噴射或接觸到檢測膜上。這些系統(tǒng)可以購自例如KinematicAutomation。
當(dāng)樣品接觸檢測區(qū)時，如果樣品中含有目標(biāo)分析物，則目標(biāo)分析物結(jié)合檢測區(qū)上的結(jié)合劑。如下文所述，緩沖液沿膜遷移從檢測區(qū)上洗去過量的未結(jié)合的分析物。
向膜上加樣后，向檢測膜上施加洗滌緩沖液。優(yōu)選地開始時施加約1滴至約20滴，更優(yōu)選約1-5滴洗滌緩沖液。如果必須清除反應(yīng)，則隨后再施加洗滌緩沖液。
洗滌緩沖液優(yōu)選地將偶聯(lián)物帶至檢測區(qū)。洗滌緩沖液可以直接施加到檢測膜上。但是在優(yōu)選實施方案中，洗滌緩沖液施加到上游的緩沖液墊上，它從該緩沖液墊流向檢測膜。緩沖液墊可以由能夠容納緩沖液并且允許它以需要的速度向膜流動的任何材料制成。例如，緩沖液墊可以由選自玻璃紙、纖維素和聚酯的一種或多種材料制成。在一個優(yōu)選實施方案中，緩沖液墊是Whatman GF/DVA玻璃紙。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)諸如側(cè)流試紙條的外殼設(shè)計、需要的流速及緩沖液墊所容納的緩沖液量等因素，為緩沖液墊選擇適當(dāng)?shù)牟牧稀?br> 洗滌緩沖液可以直接施加到緩沖液墊上，例如使用移液器或滴管。但是在另外一個實施方案中，適量的洗滌緩沖液容納在鄰近緩沖液墊的容器中。例如，洗滌緩沖液可以容納在玻璃或塑料安瓿中。在施加待測樣品后，打破或者以其他方式打開容納洗滌緩沖液的容器，使洗滌緩沖液接觸緩沖液墊。
為了提高試驗靈敏度，洗滌緩沖液的組成可能不同。優(yōu)選地，洗滌緩沖液含有緩沖劑、防腐劑、去污劑、糖和用來減少背景和/或非特異性結(jié)合的其他材料。
可以使用能夠保持需要的緩沖液pH的任何緩沖劑，優(yōu)選約7.2至約7.6。例如，但并非限制，緩沖液可以選自HEPES、Tris和磷酸緩沖液。在一個優(yōu)選實施方案中，洗滌緩沖液含有約0.01％至約0.5％HEPES，更優(yōu)選約0.02％至約0.2％HEPES，更優(yōu)選約0.02％至約0.05％HEPES。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，洗滌緩沖液含有0.025％的HEPES。
洗滌緩沖液還可含有防腐劑，例如疊氮鈉或Proclin。在一個優(yōu)選實施方案中，洗滌緩沖液含有約0.1％至約0.5％疊氮鈉，更優(yōu)選約0.1％至約0.2％疊氮鈉。
優(yōu)選含有濃度為約1％、更優(yōu)選約0.85％的氯化鈉或相當(dāng)?shù)柠}?？赡芎蠩DTA，優(yōu)選濃度為約0.1％。也可以含有糖，例如甘露醇。優(yōu)選的甘露醇濃度為約1％至約5％。在一個優(yōu)選實施方案中，甘露醇濃度為約1％。
洗滌緩沖液優(yōu)選地還含有封閉劑。封閉劑可以是本領(lǐng)域公知的任何封閉劑。封閉劑優(yōu)選的是蛋白質(zhì)，如酪蛋白或牛血清白蛋白(BSA)。洗滌緩沖液中優(yōu)選含有濃度約0.01％至約0.5％，更優(yōu)選約0.02％至約0.2％的封閉劑。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，洗滌緩沖液中含有濃度為約0.1％的酪蛋白。
洗滌緩沖液一般還含有去污劑，優(yōu)選非離子型去污劑，如TritonX100TM或Tween。優(yōu)選含有濃度約0.05％至約1％，更優(yōu)選約0.1％至約0.5％的去污劑。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，洗滌緩沖液含有濃度約0.1％的Triton X100。
將洗滌緩沖液的pH調(diào)節(jié)為約7-8，更優(yōu)選約7.2-7.6。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，洗滌緩沖液的pH約為7.2。
試紙條也包括偶聯(lián)物來源區(qū)。在一個優(yōu)選實施方案中，如下文所述，試紙條包括偶聯(lián)物墊，偶聯(lián)物在其上干燥。洗滌緩沖液從緩沖液墊流向偶聯(lián)物墊，并與之接觸。偶聯(lián)物墊因而又接觸檢測膜。但是在一些實施方案中，偶聯(lián)物墊在加樣后與膜接觸。特別是，當(dāng)使用大樣品體積時，優(yōu)選地在樣品接觸檢測區(qū)后，偶聯(lián)物墊與膜接觸。
將足夠的洗滌緩沖液加到緩沖液墊上，以溶解與偶聯(lián)物墊可擴散結(jié)合的偶聯(lián)物，并使偶聯(lián)物沿檢測膜向檢測線和對照線流動。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)諸如與偶聯(lián)物墊結(jié)合的偶聯(lián)物量、膜的大小和待分析的樣品量等因素確定所要使用的緩沖液量。優(yōu)選地，當(dāng)緩沖液墊約為2cm×5mm時，向緩沖液墊上施加1-10滴緩沖液，更優(yōu)選2-5滴，更優(yōu)選3-4滴。
在可供選擇的實施方案中沒有偶聯(lián)物墊。在一個可供選擇的實施方案中，洗滌緩沖液中含有濃度為約0.2OD/ml至約1.0OD/ml的偶聯(lián)物。可以向緩沖液墊上施加含有偶聯(lián)物的洗滌緩沖液。偶聯(lián)物于是與洗滌緩沖液一起從緩沖液墊向膜流動，并接觸檢測區(qū)和對照區(qū)。在另外一個實施方案中，直接將含有偶聯(lián)物的緩沖液墊加到檢測膜上。含有偶聯(lián)物的洗滌緩沖液可以容納在安瓿中，通過折斷或者以其他方式打開安瓿，使它向膜流動。優(yōu)選地將含有偶聯(lián)物的洗滌緩沖液加到膜上位于檢測區(qū)上游的位置。但是在一些實施方案中，在加樣后將含有偶聯(lián)物的洗滌緩沖液直接加到檢測區(qū)。
在另外一個實施方案中，例如通過干燥，偶聯(lián)物直接可擴散地結(jié)合到包括檢測區(qū)和對照區(qū)的膜上。然后可以將洗滌緩沖液加到與膜接觸的緩沖液墊上，或者直接加到檢測膜上。洗滌緩沖液溶解干燥的偶聯(lián)物，帶著偶聯(lián)物沿檢測膜向檢測區(qū)和對照區(qū)流動。
在加樣后含有偶聯(lián)物的洗滌緩沖液優(yōu)選地接觸檢測區(qū)，樣品中所含的所有分析物都有機會結(jié)合固定的結(jié)合劑。因此，優(yōu)選地在向檢測區(qū)加樣后將洗滌緩沖液加到試紙條上。
制備如上所述的偶聯(lián)物，用偶聯(lián)物緩沖液稀釋后在試驗中使用。優(yōu)選地用偶聯(lián)物緩沖液將偶聯(lián)物稀釋為大約3OD/ml制備工作偶聯(lián)物。偶聯(lián)物緩沖液的組成可能依偶聯(lián)物的性質(zhì)而不同。示例性偶聯(lián)物緩沖液包括例如HEPES、Tris、磷酸鹽等緩沖液或本領(lǐng)域公知的其他類似的緩沖液。一種優(yōu)選的偶聯(lián)物緩沖液含有約0.02％至約0.2％HEPES緩沖液，更優(yōu)選約0.025％HEPES。偶聯(lián)物緩沖液還可含有鹽，優(yōu)選氯化鈉。添加氯化鈉使?jié)舛葹榧s0.1％，更優(yōu)選約0.85％。偶聯(lián)物緩沖液中還可含有防腐劑，例如疊氮鈉或Proclin，濃度為約0.1％至約0.2％。
偶聯(lián)物緩沖液優(yōu)選地還含有EDTA(約0.1％)，濃度為約0.02％至約0.2％、更優(yōu)選約0.15％的酪蛋白，濃度為約0.5％至約3％、更優(yōu)選約1％的牛血清白蛋白(BSA)，濃度為約1％至約5％、更優(yōu)選約1％的甘露醇，濃度為約1％至約5％、更優(yōu)選約1％的蔗糖。緩沖液中可以含有Triton X100，濃度優(yōu)選為約0.1％至約0.5％、更優(yōu)選約0.1％。
優(yōu)選地調(diào)節(jié)偶聯(lián)物緩沖液的pH為約7.2至約7.6，更優(yōu)選約7.2。
在一個實施方案中，用偶聯(lián)物緩沖液稀釋偶聯(lián)物制備工作偶聯(lián)物后，例如通過真空干燥，將工作偶聯(lián)物在偶聯(lián)物墊上干燥。優(yōu)選地將偶聯(lián)物墊切成適當(dāng)大小的條，在試紙條中使用。在下面的實施例中，將偶聯(lián)物墊切成5mm×5mm的條。
偶聯(lián)物墊優(yōu)選地由玻璃纖維、玻璃紙、聚酯或纖維素紙制成。這些材料在本領(lǐng)域公知，例如可購自Millipore、S&S和Whatman。在一個優(yōu)選實施方案中，偶聯(lián)物墊是可以購到的玻璃纖維偶聯(lián)物墊GFCP203000(Millipore)。
如上所述，洗滌緩沖液溶解干燥的偶聯(lián)物并使偶聯(lián)物從偶聯(lián)物墊沿檢測膜向檢測區(qū)和對照區(qū)流動。
檢測膜可以是能夠與蛋白質(zhì)或其他結(jié)合劑共價或非共價結(jié)合的任何材料，偶聯(lián)物能夠與洗滌緩沖液一起沿檢測膜流動。檢測膜優(yōu)選的是硝酸纖維素膜。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要的靈敏度和檢測時間和成本等因素能夠選擇具有較高或較低流速的其他膜用作檢測膜。
當(dāng)偶聯(lián)物與洗滌緩沖液一起流動穿過膜時，偶聯(lián)物接觸檢測區(qū)。如果含有目標(biāo)分析物并且該分析物與檢測區(qū)上的結(jié)合劑結(jié)合，則緩沖液中的偶聯(lián)物與該分析物結(jié)合。
含有在檢測區(qū)不結(jié)合的偶聯(lián)物的洗滌緩沖液繼續(xù)流動，穿過膜到達(dá)對照區(qū)。偶聯(lián)物將與對照結(jié)合劑結(jié)合。洗滌緩沖液也從檢測區(qū)和對照區(qū)帶走未結(jié)合的樣品。
含有未結(jié)合的偶聯(lián)物和未結(jié)合的樣品的洗滌緩沖液然后流向與膜的下游端接觸的吸水墊。吸水墊可以由本領(lǐng)域公知的任何吸水材料制成。吸水墊優(yōu)選的是吸水紙，如S&S 900TM紙。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)試紙條的最終構(gòu)造選擇本領(lǐng)域公知的其他吸水紙。
洗滌緩沖液可以繼續(xù)流動，通過吸水墊，進(jìn)入與吸水墊接觸的吸水紙。如果必須吸收大量緩沖液，則優(yōu)選使用吸水紙。
也可以向試紙條中加入分子篩干燥劑片。在一個實施方案中，含有未結(jié)合的偶聯(lián)物的緩沖液從吸水紙流到與吸水紙接觸的干燥劑片內(nèi)。干燥劑片容納吸收的流體并防止回流到試紙條內(nèi)。
干燥劑片也可以使試紙條在使用前保持干燥。一種優(yōu)選的干燥劑片是可從Sud-Chemie購到的0.395g Tri-Sorb板(產(chǎn)品編號為43-01)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)試紙條的最終構(gòu)造，包括所要使用的樣品和緩沖液的總量，為吸水墊、吸水紙和干燥劑片選擇適當(dāng)?shù)拇笮『筒牧稀?br> 整個試紙條優(yōu)選地容納在外殼如塑料外殼中。如上所述，在一個實施方案中，外殼包括樣品窗口，通過樣品窗口能夠?qū)悠芳拥桨z測區(qū)和對照區(qū)的膜上。外殼還可包括緩沖液窗口，通過緩沖液窗口能夠?qū)⒕彌_液加到緩沖液墊或膜上。外殼還可包括體積指示劑窗口，通過體積指示劑窗口能夠觀察指示有足夠樣品體積接觸檢測區(qū)的信號。足夠的樣品體積是估計含有足夠目標(biāo)分析物的樣品體積，如果樣品中含有分析物則在試驗完成時在檢測區(qū)產(chǎn)生可見信號。例如，對于檢測尿hCG的試驗，足夠的樣品體積是大約200μl尿。
優(yōu)選地在向試紙條上施加洗滌緩沖液約1分鐘至約5分鐘后讀取試驗結(jié)果。在一個實施方案中，施加洗滌緩沖液約2-4分鐘后，更優(yōu)選約3-4分鐘后讀取結(jié)果。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，施加洗滌緩沖液1分鐘后讀取結(jié)果。如圖7所示，對于陽性結(jié)果，檢測線(300)將可見?？梢姷膶φ諑?400)表示該試驗正確地進(jìn)行。如圖6所示，如果對照線(400)可見但是檢測線不可見，則表示為陰性結(jié)果。
實施例1HIV檢測卡的構(gòu)建準(zhǔn)備用于檢測抗人類免疫缺陷病毒抗體的側(cè)流快速目測試驗。試紙條的排列基本如圖1所示。
試紙條包括一個兩面均為粘性的塑料支座(6cm×5mm)。該塑料支座的厚度為約2密耳至大約20密耳。
通過用泵分配系統(tǒng)(Kinematic Automation)噴射，在硝酸纖維素膜(Millipore HF09004)上制備檢測線和對照線。檢測線包括一條垂直HIV抗原線。HIV抗原是HIV-1重組糖蛋白抗原(GP120(約0.15mg/ml)和P24(約0.1mg/ml))和HIV-2重組糖蛋白抗原(GP36(約0.5mg/ml))的混合物，在含有5％海藻糖的PBS中制備，濃度為約0.5mg/ml至約1.0mg/ml。向檢測區(qū)上以垂直線的方式施加總量約0.1μg至約0.5μg的抗原。
制備在檢測線上含有單種HIV-1或HIV-2抗原的其他試紙條。
對于所有試紙條，對照區(qū)包括一條垂直的對照抗體線。對照抗體是兔IgG，用含有5％海藻糖的PBS稀釋為1mg/ml。向?qū)φ諈^(qū)上施加總量為在偶聯(lián)物結(jié)合后足以產(chǎn)生可見對照線的對照抗原。
對于每條試紙條，將適宜的硝酸纖維素膜切成約2.5cm×5mm的大小，并且貼在塑料支座上。
使用可從Sigma購得的附著于膠體金的蛋白A作為該試驗的偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物用偶聯(lián)物緩沖液稀釋至約3OD/ml的濃度。偶聯(lián)物緩沖液含有0.25％HEPES、0.85％氯化鈉、0.1％疊氮鈉、0.1％EDTA、0.1％酪蛋白、1％牛血清白蛋白、1％甘露醇、5％蔗糖和0.1％Triton X100。調(diào)節(jié)緩沖液的pH為7.2。
將偶聯(lián)物加至玻璃纖維偶聯(lián)物墊(Millipore GFCP203000)上，使其干燥并切成5mm×5mm的條。將一條貼在最靠近每個試紙條檢測區(qū)的硝酸纖維素膜的末端。
然后將Whatman GF/DVA玻璃紙緩沖液墊(2cm×5mm)連接到每個試紙條的干燥的偶聯(lián)物墊上，用作緩沖液墊。
由S&S 900紙制成的吸水墊(2cm×5mm)連接到最靠近對照區(qū)的硝酸纖維素膜的末端，另一張吸水紙(2.5cm×5mm；S&S 470)連接到該吸收墊上。吸水紙又接觸0.395g干燥劑片(Tri-Sorb，Sud-Chemie)。
將試紙條置于塑料外殼內(nèi)，制成類似于圖1-6所示的檢測卡。塑料外殼(10)包括一個暴露檢測區(qū)(140)和對照區(qū)(150)的檢測窗口(20)，和一個直接位于緩沖液墊上方的緩沖液窗口(30)。塑料外殼上也作出標(biāo)記，標(biāo)出檢測線和對照線的位置。
檢測卡用鋁箔(foil)單個包裝。
實施例2HIV檢測采用適當(dāng)?shù)撵o脈穿刺法從將要檢測HIV的患者中獲得全血樣品，由該樣品制備血清或血漿。樣品在2℃至8℃下貯存，在24小時內(nèi)使用，或者在-20℃下凍存，在2周內(nèi)使用。冷凍的樣品在使用前融化。
從鋁箔包裝中取出HIV檢測卡，該檢測卡如實施例1所述，在對照區(qū)上包括HIV-1和HIV-2抗原的混合物。
通過檢測卡窗口的中心向膜上施加約5μL含有0.025％HEPES和0.2％疊氮鈉的樣品緩沖液。
含有待測血清或血漿的樣品移液管垂直保持在檢測卡的檢測窗口上，將5μL樣品加到窗口中心的膜上。
向緩沖液墊上加4滴洗滌緩沖液(0.025％HEPES，0.85％氯化鈉，0.1％EDTA，1％甘露醇，0.1％酪蛋白，1％Triton X100，pH 7.2)。3分鐘后如果反應(yīng)未被清除，則向緩沖液墊上再加1滴緩沖液。
第一次添加緩沖液1至5分鐘后讀取試驗結(jié)果。
如圖5所示，陽性結(jié)果包括通過樣品窗口可見的兩條線檢測線(140)和對照線(150)。如果兩條線可見，即使是一條線比另一條弱，也是獲得了陽性結(jié)果。通過樣品窗口只有一條對照線可見則表示為陰性結(jié)果，如圖6所示。
實施例3HCV檢測卡用于診斷丙型肝炎病毒的試紙條如實施例1所述制備。但是不同的是，在膜的檢測線上噴上包含核心(0.3mg/ml)、NS3(0.4mg/ml)和NS4(0.1 mg/ml)的丙型肝炎抗原混合物而不是HIV抗原。在檢測線上總共施加約0.4μgHCV抗原混合物。在對照線上噴有稀釋為1mg/ml的兔IgG。
實施例4HCV檢測從鋁箔包裝中取出HCV檢測卡，該檢測卡如實施例3所述，在檢測區(qū)上包括HCV抗原。
通過檢測卡窗口的中心向膜上施加約5μL含有磷酸緩沖液和0.2％疊氮鈉的樣品緩沖液。
由全血樣品制備血清或血漿。含有待測血清或血漿的樣品移液管垂直保持在檢測卡的檢測窗口上方，將5μL樣品加到窗口中心的膜上。
向緩沖液墊上加4滴洗滌緩沖液(0.025％磷酸鹽，0.85％氯化鈉，0.1％EDTA，1％甘露醇，0.1％酪蛋白，1％Triton X100，pH 7.2)。3分鐘后如果反應(yīng)未被清除，則向緩沖液墊上再加2滴緩沖液。
第一次添加緩沖液1至5分鐘后讀取試驗結(jié)果。
如圖5所示，陽性結(jié)果包括通過樣品窗口可見的兩條線檢測線(140)和對照線(150)。如果兩條線可見，即使是一條線比另一條弱，也是獲得了陽性結(jié)果。通過樣品窗口只有一條對照線可見則表示為陰性結(jié)果，如圖6所示。
實施例5妊娠試驗準(zhǔn)備側(cè)流快速目測妊娠試驗。試紙條的排列基本如圖7所示。
每個試紙條都包括一個兩面均為粘性的塑料支座(6cm×5mm)。塑料支座的厚度為約2密耳至約20密耳。
通過用泵分配系統(tǒng)(Kinematic Automation)噴射，在硝酸纖維素膜(Millipore HF09004)上制備檢測線和對照線。檢測線包括一條垂直的抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)抗體，優(yōu)選單克隆抗體線。抗hCG抗體可以廣泛購到，例如購自Research Diagnostics Inc.(RDI-CBL74；New Jersey，USA)、Charles River Labs和其他來源，或者可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法制備。向檢測區(qū)上以垂直線的方式施加總量約0.2μg至約1μg的抗體。
對照線包括一條垂直的蛋白A線。向?qū)φ站€上施加總量為在偶聯(lián)物結(jié)合后足以產(chǎn)生可見信號的蛋白A，一般約為0.25μg。
對于每條試紙條，將適宜的硝酸纖維素膜切成約2.5cm×5mm的大小，并且貼在塑料支座上。
抗hCG第二抗體與膠體金連接，用作試驗的偶聯(lián)物。膠體金-hCG抗體偶聯(lián)物例如可以購自Research Diagnostics Inc.。另外也可以用眾所周知的方法制備hCG抗體偶聯(lián)物(參見，例如，美國專利No.6,485,982，在此引用作為參考)。該偶聯(lián)物用偶聯(lián)物緩沖液稀釋至約3OD/ml的濃度。偶聯(lián)物緩沖液優(yōu)選含有0.25％HEPES、0.85％氯化鈉、0.1％疊氮鈉、0.1％EDTA、0.1％酪蛋白、1％牛血清白蛋白、1％甘露醇、5％蔗糖和0.1％Triton X100。調(diào)節(jié)緩沖液的pH為7.2。
將偶聯(lián)物加至玻璃纖維偶聯(lián)物墊(Millipore GFCP203000)上，將其干燥并切成5mm×5mm的條。
將Whatman GF/DVA玻璃紙緩沖液墊(2cm×5mm)連接到每個試紙條的干燥的偶聯(lián)物墊上，用作緩沖液墊。
由S&S 900紙制成的吸水墊(2cm×5mm)連接到最靠近對照區(qū)的硝酸纖維素膜的末端，另一張吸水紙(2.5cm×5mm；S&S 470)連接到該吸收墊上。吸收紙又接觸干燥劑片(例如Tri-Sorb，Sud-Chemie)，該干燥劑片能夠吸收相當(dāng)一部分樣品體積，從而吸引樣品和分析物穿過檢測區(qū)。
亞甲基藍(lán)或另外一種指示劑沉積在位于檢測區(qū)下游的吸水墊或吸水紙之一上。該體積指示劑的移動是表示已經(jīng)有足夠的樣品接觸檢測區(qū)從而可以準(zhǔn)確檢測的信號。
將試紙條置于塑料外殼內(nèi)制成檢測卡。塑料外殼包括一個位于檢測區(qū)和對照區(qū)上方的檢測窗口，以允許觀察試驗結(jié)果。該外殼也包括一個體積指示劑窗口，通過該窗口能夠觀察體積指示劑的移動。
在有些檢測卡中，樣品杯連接到檢測窗口上方。樣品杯包括一個容納樣品的容器，它具有一個出口，可使樣品通過樣品窗口流向檢測膜的加樣區(qū)。樣品杯也可以在出口中包括濾器。向膜上加樣之后，取下樣品杯，從而能夠觀察到試驗結(jié)果。
在其他檢測卡中，有一個引流條從外殼的端部或側(cè)部突出。該引流條提供一條通道，樣品能夠沿著該通道流向加樣區(qū)和檢測區(qū)。
外殼還具有一個機構(gòu)，該機構(gòu)可將偶聯(lián)物墊移動至與膜流體連通。
在一些檢測卡中，外殼中在偶聯(lián)物墊的上游還有一個含有洗滌緩沖液的安瓿。在其他檢測卡中，通過緩沖液窗口將緩沖液加至緩沖液墊上。
擊發(fā)該機構(gòu)使偶聯(lián)物墊移動接觸檢測膜，折斷了安瓿，使緩沖液流到偶聯(lián)物墊上。優(yōu)選地約有5滴洗滌緩沖液接觸偶聯(lián)物墊。該機構(gòu)的擊發(fā)也從外殼上移除樣品杯或引流條。
塑料支座上做出標(biāo)記，標(biāo)出樣品窗口中檢測線和對照線的位置。
實施例6帶有樣品杯的妊娠試驗的應(yīng)用如實施例5所述準(zhǔn)備帶有樣品杯的側(cè)流快速目測妊娠試驗。
收集受試者的尿液，向樣品杯中加入約500μl，該樣品杯與檢測卡在樣品窗口上連接。當(dāng)在體積指示劑窗口中看到藍(lán)色時，機構(gòu)被擊發(fā)，使偶聯(lián)物墊與膜流體連通。這折斷了含有緩沖液的安瓿并啟動試驗。取下樣品杯，1至5分鐘后從樣品窗口肉眼觀察試驗結(jié)果。
如圖5所示，陽性結(jié)果包括通過樣品窗口可見的兩條線檢測線(140)和對照線(150)。如果兩條線可見，即使是一條線比另一條弱，也是獲得了陽性結(jié)果。通過樣品窗口只有一條對照線150可見則表示為陰性結(jié)果，如圖6所示。
實施例6帶有引流條的妊娠試驗的應(yīng)用如實施例5所述準(zhǔn)備帶有引流條的側(cè)流快速目測妊娠試驗。
受試者將引流條放置在他的尿流中。在體積指示窗口觀察到藍(lán)色表明已經(jīng)有足夠的樣品體積接觸到測試區(qū)。
外殼上的機構(gòu)被擊發(fā)，使偶聯(lián)物墊與膜流體連通。這也折斷了外殼內(nèi)含有緩沖液的安瓿，并且通過使緩沖液流動到偶聯(lián)物墊上，啟動試驗。移除引流條，1至5分鐘后從樣品窗口肉眼觀察試驗結(jié)果。
如圖5所示，陽性結(jié)果包括通過樣品窗口可見的兩條線檢測線(140)和對照線(150)。如果兩條線可見，即使是一條線比另一條弱，也是獲得了陽性結(jié)果。通過樣品窗口只有一條對照線可見則表示為陰性結(jié)果，如圖6所示。
已經(jīng)結(jié)合某些優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不超出本發(fā)明范圍的情況下，可以進(jìn)行各種變化，并且可以將它的要素替換為其他相當(dāng)?shù)囊?。另外，在不超出本發(fā)明基本范圍的情況下，也可以進(jìn)行許多改變以使本文的教導(dǎo)適應(yīng)于特定的情況。因此，本發(fā)明不僅限于公開的所有具體實施方案，而是本發(fā)明包括落入權(quán)利要求書范圍內(nèi)的所有實施方案。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測液體樣品中的目標(biāo)分析物的診斷試紙條，該試紙條包括偶聯(lián)物來源區(qū)，包括設(shè)計用來結(jié)合目標(biāo)分析物的偶聯(lián)物；位于偶聯(lián)物來源區(qū)下游并且用來接收液體樣品的加樣區(qū)；和位于偶聯(lián)物來源區(qū)下游的檢測區(qū)，包括固定的對于目標(biāo)分析物特異性的結(jié)合劑。
2.權(quán)利要求1的試紙條，其中所述加樣區(qū)包括檢測區(qū)。
3.權(quán)利要求1的試紙條，其中所述目標(biāo)分析物是抗體。
4.權(quán)利要求3的試紙條，其中所述目標(biāo)分析物是抗人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體。
5.權(quán)利要求3的試紙條，其中所述目標(biāo)分析物是抗丙型肝炎(HCV)抗體。
6.權(quán)利要求1的試紙條，其中所述目標(biāo)分析物是抗原。
7.權(quán)利要求6的試紙條，其中所述目標(biāo)分析物是人絨毛膜促性腺激素(hCG)。
8.權(quán)利要求1的試紙條，其中所述偶聯(lián)物來源區(qū)包括干燥的偶聯(lián)物。
9.權(quán)利要求8的試紙條，其中所述偶聯(lián)物來源區(qū)包括偶聯(lián)物墊，該偶聯(lián)物墊包括干燥的偶聯(lián)物，并且與該試紙條流體連通。
10.權(quán)利要求8的試紙條，其中所述偶聯(lián)物來源區(qū)是該試紙條的一部分。
11.權(quán)利要求1的試紙條，其中通過使偶聯(lián)物來源區(qū)接觸洗滌緩沖液使偶聯(lián)物流向檢測區(qū)。
12.權(quán)利要求11的試紙條，其中所述洗滌緩沖液含有封閉劑蛋白質(zhì)和非離子型去污劑。
13.權(quán)利要求12的試紙條，其中所述洗滌緩沖液含有0.1％酪蛋白和1％Triton X100。
14.權(quán)利要求1的試紙條，其中所述偶聯(lián)物含有結(jié)合成分和標(biāo)記物。
15.權(quán)利要求14的試紙條，其中所述結(jié)合成分是蛋白A。
16.權(quán)利要求14的試紙條，其中所述標(biāo)記物選自膠體金、膠體銀、膠體黑和染色的乳膠顆粒。
17.權(quán)利要求16的試紙條，其中所述標(biāo)記物是膠體金。
18.權(quán)利要求17的試紙條，其中膠體金的粒徑為約20納米至約80納米。
19.權(quán)利要求3的試紙條，其中所述偶聯(lián)物含有與膠體金偶聯(lián)的蛋白A。
20.權(quán)利要求6的試紙條，其中所述偶聯(lián)物含有與膠體金偶聯(lián)的抗體。
21.權(quán)利要求1的試紙條，其中該試紙條包括硝酸纖維素膜。
22.權(quán)利要求1的試紙條，其中該試紙條還包括位于檢測區(qū)下游的對照區(qū)，該對照區(qū)包含能夠結(jié)合所述偶聯(lián)物的固定的對照結(jié)合劑。
23.權(quán)利要求22的試紙條，其中所述對照區(qū)包括固定的兔IgG。
24.權(quán)利要求22的試紙條，其中所述對照區(qū)包括固定的蛋白A。
25.權(quán)利要求1的試紙條，還包括與偶聯(lián)物來源區(qū)流體連通的緩沖液墊。
26.權(quán)利要求1的試紙條，在檢測區(qū)下游的位置處還包括與膜流體連通的吸收墊。
27.權(quán)利要求1的試紙條，還包括直接位于加樣區(qū)上方的樣品濾器。
28.一種用于檢測樣品中的抗HIV抗體的試紙條，包括檢測區(qū)和位于該檢測區(qū)上游的偶聯(lián)物來源區(qū)；在所述檢測區(qū)結(jié)合的固定抗原，其中該固定抗原包括約0.1μg至約0.5μg HIV抗原；和與所述偶聯(lián)物來源區(qū)可擴散結(jié)合的偶聯(lián)物，其中該偶聯(lián)物設(shè)計用來結(jié)合抗體。
29.權(quán)利要求28的試紙條，其中所述HIV抗原包括選自GP120、P24和GP36的一種或多種抗原。
30.權(quán)利要求28的試紙條，其中所述偶聯(lián)物包括蛋白A。
31.權(quán)利要求30的試紙條，其中蛋白A與膠體金偶聯(lián)。
32.一種檢測液體樣品中的目標(biāo)抗體的方法，包括使試紙條的檢測區(qū)接觸樣品，其中該檢測區(qū)包括固定的目標(biāo)抗體特異性的抗原；以及然后使檢測區(qū)接觸設(shè)計用來結(jié)合目標(biāo)抗體的偶聯(lián)物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述偶聯(lián)物包括蛋白A。
34.權(quán)利要求33的方法，其中蛋白A與膠體金偶聯(lián)。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述目標(biāo)抗體是抗HIV抗體。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述檢測區(qū)包括選自HIV-1和HIV-2抗原的固定抗原。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述HIV抗原選自GP120和P24。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述HIV-2抗原是GP36。
39.權(quán)利要求32的方法，其中所述液體樣品選自全血、血清和血漿。
40.一種免疫診斷妊娠試驗試紙條，包括用于接收液體樣品的加樣區(qū)；檢測區(qū)，包括固定的第一抗hCG抗體；和偶聯(lián)物來源區(qū)，包括設(shè)計用來結(jié)合hCG的偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物來源區(qū)位于所述加樣區(qū)和檢測區(qū)的上游。
41.權(quán)利要求40的妊娠試驗試紙條，還包括與加樣區(qū)流體連通的引流條。
42.權(quán)利要求40的妊娠試驗，還包括用于收集尿樣的樣品杯。
43.權(quán)利要求40的妊娠試驗，其中所述偶聯(lián)物包括第二hCG抗體。
44.權(quán)利要求43的妊娠試驗，其中所述第二hCG抗體與膠體金偶聯(lián)。
全文摘要
提供了診斷裝置和方法。診斷裝置優(yōu)選地包括具有檢測區(qū)140的試紙條。所分析的樣品與檢測區(qū)接觸，檢測區(qū)包含目標(biāo)分析物的特異性結(jié)合配體。如果樣品中存在分析物，則分析物與檢測區(qū)中固定的結(jié)合配體相結(jié)合，然后接觸偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物特異性地結(jié)合分析物，產(chǎn)生表示存在分析物的可見信號。該裝置可用于診斷患者的特定疾病，如HIV或肝炎。也可用于確定個體是否懷孕。
文檔編號G01N33/558GK1902489SQ200480015772
公開日2007年1月24日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日
發(fā)明者戴維·查爾頓 申請人:優(yōu)勢診療技術(shù)公司