專利名稱：表面等離子共振的測定方法及用于該方法的貴金屬化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于表面等離子共振的測定方法及用于該方法的貴金屬化合物。
背景技術：
某種生物體內(nèi)酶，在以活性中心和變構(gòu)部位為代表的特定部位具有絲氨酸和蘇氨酸、酪氨酸殘基，這些羥基通過被稱為激酶的酶磷酸化或脫磷酸化，以此調(diào)節(jié)酶活性。此外，也有的酶通過賴氨酸、精氨酸、組氨酸的氨基或亞氨基和天冬氨酸、谷氨酸的羧基被磷酸化(或脫磷酸化)來調(diào)節(jié)活性。
作為通過這樣的磷酸化-脫磷酸化進行調(diào)節(jié)的代謝系統(tǒng)，廣為人知的有糖原合成的抑制與分解系統(tǒng)。該代謝系統(tǒng)主要通過磷酸化-脫磷酸化進行級聯(lián)控制，進行調(diào)節(jié)。
而且，近年來，越來越明顯的是，該磷酸化-脫磷酸化在與疾病相關的代謝系統(tǒng)中具有重要的作用。
例如，細胞癌化的一個原因被認為是磷酸化-脫磷酸化的異常。即，細胞周期的進行和停止是通過各種酶(蛋白質(zhì))的磷酸化(或脫磷酸化)進行控制的，在該磷酸化(或脫磷酸化)過程中，雖然有細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)參與，但這樣的機制若受到損傷，則會擾亂磷酸化(或脫磷酸化)，其結(jié)果會引發(fā)細胞的異常增殖。
另外還明確的有蛋白激酶C參與成為特應性皮炎和花粉癥等過敏癥的原因的組胺的脫顆粒；阿爾茨海默病患者腦部產(chǎn)生的神經(jīng)元纖維變化是由被磷酸化的Tau蛋白(タウタンパク質(zhì))造成的。
因此，把握蛋白質(zhì)的磷酸化-脫磷酸化狀況，不僅對生物組織細胞基因發(fā)現(xiàn)的探索和酶活性評價起到作用，也可能對疾病的診斷和治療發(fā)揮作用。
但是，迄今以來使用的磷酸化蛋白質(zhì)(或脫磷酸化蛋白質(zhì))的確定(日文特定)方法存在各種缺點。
例如，酶免疫法雖然具有僅需微量的對象蛋白質(zhì)試樣即可進行分析的優(yōu)點，但要得到必要的充分量的抗體卻很困難。此外，當對象蛋白質(zhì)在數(shù)kDa以下時，不能調(diào)制與蛋白質(zhì)中的磷酸化部位結(jié)合的抗體。
此外，雖然也可考慮使用放射性同位素32P標記的磷酸來檢測出它對蛋白質(zhì)的特異結(jié)合，但放射性同位素的使用當然需要注意，乃至對廢液的管理和處理也有要求。
另外，由于磷酸化蛋白質(zhì)和脫磷酸化蛋白質(zhì)的電荷不同，也可使用二維電泳法。但是，特別是在分析生物試樣時的場合，由于試樣中包含有多種蛋白質(zhì)，因此斑點的確定非常困難。再加上若為斑點的確定而使用放射性同位素，則會產(chǎn)生前文所述的問題。
此外，除了確定磷酸化(或脫磷酸化)蛋白質(zhì)的這些技術以外，作為用于探索對特定化合物(配位體等)特異結(jié)合的化合物(蛋白質(zhì)等)的一般方法，開發(fā)出了利用表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance、以下稱為“SPR”)的技術(參照圖1)。該技術詳細敘述如下。
光在屈折率不同的界面全反射時，在全反射表面會產(chǎn)生被稱為倏逝波(evanescentwave)的光。此外，在金屬表面會產(chǎn)生表面等離子體振子(日文表面プラズモン)這一產(chǎn)生于金屬-電介質(zhì)界面的一種電子的疏密波。由于通過調(diào)整入射光的角度，令兩者(倏逝波和表面等離子體振子)的相位速度一致，以此激起該表面等離子體振子的共振，所以可以大幅增大金屬表面的電磁場。此時，由于入射光的能量被表面電子波的激起所剝奪，因此反射光的強度會減小。
而且，該種吸收產(chǎn)生的入射角度和入射光的波長，尤其根據(jù)數(shù)百nm以內(nèi)的金屬表面的狀態(tài)而非常敏銳地發(fā)生變化。即，根據(jù)金屬表面上是否含有化合物等狀態(tài)的變化，反射光的強度會敏感地反應，因此，若在金屬表面形成配位基等的結(jié)合后，使被檢試樣發(fā)生作用，則根據(jù)是否存在與該配位基等相互作用的化合物，反射光的強度會變化。因此，如圖1所示，通過使配位基等在金屬表面載持、進一步與未添加被檢試樣的場合的反射光強度進行比較，可以判斷是否存在與該配位基等相互作用的化合物。再有，該技術也可應用于光學生物成像(バイオイメ一ジング)。即，在細胞或生物組織中可以通過成像捕捉到與特定化合物相互作用的化合物的局部存在。
作為這樣的技術的例子，可舉出的有特表平11-512186號公報中記載的技術。根據(jù)該文獻，若使電泳緩沖液(running buffer)→被檢試樣→電泳緩沖液對圖1所示的那樣的貴金屬膜連續(xù)發(fā)揮作用，則SPR觀測到的入射角度顯示出圖2所示的經(jīng)時變化。而且在該技術中，通過測定該經(jīng)時變化、求出反射率的最小值和最大值以及屈折率和時間的關系，可以決定貴金屬膜上載持的化合物和被檢試樣中的化合物的解離常數(shù)和偶合常數(shù)及樣品中化合物的濃度。
另外，在特表平10-505910號公報中公開的技術是通過羧甲基葡聚糖，使得N-(5-氨基-1-羧基戊基)亞氨(二)乙酸結(jié)合于貴金屬膜上，再配位以鎳，使用這樣的物質(zhì)進行SPR測定。由于該鎳配位基對具有2個相鄰組氨酸殘基的肽顯示出特異的親和性，因此被稱為組氨酸標記(His-tag)，可以從被檢試樣中檢測出含有二組氨酸殘基的肽。
另外，作為測定表面等離子共振的方法可考慮應用拉曼光譜法。拉曼光譜法是通過測定向物質(zhì)照射一定振動頻率v0的單色光時產(chǎn)生的散射光中的同一振動頻率以外(v0±v1)的散射光(拉曼散射光)，由此得到化合物信息的技術。詳細地說，由于該拉曼振動頻率v1等于構(gòu)成物質(zhì)的分子和結(jié)晶的振動和回轉(zhuǎn)的能量級間的振動頻率，因此成為決定、鑒定、定量物質(zhì)的能量級的信息源(參照《化學大辭典》東京化學同人)。
但是，由于該拉曼散射光非常微弱，一直以來，都是利用表面等離子共振效果進行了增強之后再進行測定的(例如，特開平9-257578號公報)。即，一般光不會與電子波(等離子體振子)偶聯(lián)，但會在金屬粒子表面引起偶聯(lián)。因此，該技術通過在測定樣品近旁放置金屬，以此增強微弱的拉曼譜帶的強度。
但是，根據(jù)這樣的已有技術的拉曼譜帶強度的增強效果并不一定能令人滿意。這是因為，雖然靶分子和金屬間的距離越近，表面等離子共振效果越高，但是，并不是說如特開平9-257578號公報的圖1那樣地，即使令基板(金屬)2與樣品3接近，所有的靶分子與金屬相接。這樣的狀況在水溶液樣品中添加金屬的情況下也是一樣的。
但是，在Hironori Takeda等人的RAPID COMMUNICATIONS IN MASSSPECTROMETRY，Vol.17，Issue 18，pp.2075-2081(2003年)中，記載了通過使用對磷酸基(磷酸單酯基)特異結(jié)合的化合物，求出磷酸化化合物的分子量的方法。但是，該文獻中，對通過該特異結(jié)合化合物令金屬接近靶化合物這一技術思想、以及將該化合物應用于表面等離子共振的測定的想法卻完全沒有記載和啟示。

發(fā)明內(nèi)容
在上述情況下，本發(fā)明欲解決的課題是，提供一種用于檢測出被檢試樣中的磷酸化肽(蛋白質(zhì))、判斷肽是否被磷酸化的表面等離子共振測定方法及用于該方法的物質(zhì)，該物質(zhì)是一種其表面具有取代基(磷標記)的貴金屬化合物，所述取代基(磷標記)在磷酸單酯基上具有特異且高配位能。
此外，本發(fā)明的目的也在于，提供一種用于制造表面具有磷標記作為取代基的貴金屬化合物的前驅(qū)體化合物。
本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題，對可以配位于結(jié)合有蛋白質(zhì)的磷酸基(磷酸單酯基)的金屬配位基進行了專心研究后發(fā)現(xiàn)本發(fā)明涉及的取代基對磷酸離子或磷酸單酯中的2個羥基的配位鍵能極其高，其結(jié)果，可以強力配位于結(jié)合于肽的磷酸基(磷酸單酯基)，即使是在含有多種肽的混合試樣中，也可以對磷酸化肽作特異結(jié)合后形成復合體。因此發(fā)現(xiàn)若使用該取代基進行SPR的測定，則可以解決上述課題，完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及的第1表面等離子共振的測定方法，其特征在于，在棱鏡底面配放貴金屬化合物，向該棱鏡照射光后，檢測出其反射光，作為該貴金屬化合物使用在與該棱鏡相接一側(cè)的相反側(cè)含有下述式(I)表示的取代基的貴金屬化合物，在該貴金屬化合物中，在含有該取代基(I)的一側(cè)添加被檢試樣。
[式中，X表示連接基。]此外，本發(fā)明涉及的第2表面等離子共振的測定方法，其特征在于，對被檢試樣中添加表面具有上述式(I)表示的取代基的貴金屬化合物，進行拉曼光譜法。
本發(fā)明的貴金屬化合物是用于上述表面等離子共振的測定方法的貴金屬化合物，其表面具有上述式(I)表示的取代基。此外，該貴金屬化合物用于上述第1方法的場合，較好的是呈膜狀，用于第2方法的場合，較好的是呈粒子狀。
成為上述貴金屬化合物的制造前驅(qū)體的前驅(qū)體化合物是籍由令鋅金屬鹽等作用，可容易地變換為上述貴金屬化合物的物質(zhì)，在貴金屬表面含有式(VII)表示的取代基。由于該前驅(qū)體化合物的形狀根據(jù)制造目的物-上述貴金屬化合物的形狀而定，因此可以考慮的有金屬膜狀和金屬粒子狀。
[式中，X表示連接基。]


圖1是用于測定SPR的一種方法的模型化圖。調(diào)整入射光的波長和入射角度以測定SPR(反射光強度減少)，然后向結(jié)合有配位基的貴金屬膜添加被檢試樣，觀測入射光強度的變化。圖中的1為棱鏡，2為貴金屬膜，3為配位基，4為被檢試樣中所含的蛋白質(zhì)，顯示與配位基相互作用的物質(zhì)。
圖2是顯示圖1所示的SPR測定中，使電泳緩沖液→被檢試樣→電泳緩沖液連續(xù)作用的場合中的SPR角度的經(jīng)時變化的模型化圖。顯示被檢試樣中的化合物與貴金屬膜結(jié)合時，SPR所測定的入射角度上發(fā)生了變化。
圖3是對含有磷酸化的β-酪蛋白的試樣進行SPR測定的結(jié)果。
圖4是對含有脫磷酸化的β-酪蛋白的試樣品進行SPR測定的結(jié)果。
圖5是對含有未被磷酸化的一般蛋白質(zhì)-牛血清白蛋白(BSA)的試樣進行SPR測定的結(jié)果。
圖6是圖3～5所示的測定結(jié)果中，顯示流動池A(Flow cell A)的RU值至流動池B(Flowcell B)的RU值的差。
圖7是對含有磷酸化肽(P-p60csrc)和非磷酸化肽(p60csrc)的試樣進行SPR測定的結(jié)果。
圖8是對含有磷酸化的β-酪蛋白的試樣進行SPR測定的結(jié)果。
具體實施例方式
以下，首先例示本發(fā)明涉及的SPR的測定方法。
在本發(fā)明的第1方法中的SPR的測定，使用公知的裝置進行測定即可。例如，可使用美國專利第5,313,264號說明書中公開的裝置。還有，由于這樣的SPR測定法，(1)無需進行引進熒光發(fā)色基等標記化操作(2)對較高分子量的分子的靈敏度高(3)含有硫代基和二硫化基的分子容易與金等貴金屬化合物表面結(jié)合，因此具有可將取代基高密度地引入表面的優(yōu)點，所以非常適合于磷酸化肽的檢測。
其測定原理如同用圖1和2如上所述，但對上述SPR測定裝置的具體說明如下。圖1中，若將光從棱鏡側(cè)照射向貴金屬膜，使成為全反射，則存在由產(chǎn)生SPR而引起的反射光強度下降的入射角度。此時的角度根據(jù)與貴金屬膜結(jié)合的化合物量、即根據(jù)質(zhì)量變化而敏銳變化，因此上述SPR測定裝置可將該質(zhì)量變化從反射光強度表示為測定數(shù)據(jù)(共振單位、1RU＝1pg/mm2)。
因此，通過將對磷酸化肽顯示出特異鍵能的取代基引入貴金屬膜后，使被檢試樣發(fā)揮作用，取得數(shù)據(jù)，將其與正常狀態(tài)下的數(shù)據(jù)進行比較，可以掌握被檢試樣中是否存在磷酸化肽及其存在量。
本發(fā)明的第2方法中可直接使用傳統(tǒng)的拉曼光譜法的裝置。但是，使本發(fā)明的貴金屬化合物(貴金屬粒子)作用于被檢試樣。其結(jié)果，與不使用本發(fā)明的貴金屬化物的場合相比，磷酸化肽的波峰不僅會根據(jù)該貴金屬化合物的結(jié)合而產(chǎn)生位移，還會通過表面等離子共振效果增強其強度。因此，通過與未使本發(fā)明的貴金屬化合物發(fā)揮作用的場合的拉曼光譜相比較，可以判斷肽是否被磷酸化。
本發(fā)明的第2方法中使用的被檢試樣是水溶液或水分散液。這是為了令本發(fā)明的貴金屬化合物結(jié)合到磷酸化肽。此外，被檢試樣也可直接使用生物樣品，但較好的是將應判斷是否被磷酸化的肽進行精制的生物樣品。這是因為在拉曼光譜法中，由于雜質(zhì)的存在，可能不能得到令人滿意的光譜。
本發(fā)明的貴金屬化合物中使用的取代基是對磷酸化肽的特異鍵能極高、具有以下的結(jié)構(gòu)。
[式中，X表示連接基。]上述式(I)中，選擇Zn作為配位金屬的理由是，它對磷酸化蛋白質(zhì)的磷酸基(磷酸單酯基)的配位能極高。
“連接基”指本發(fā)明的貴金屬化合物中貴金屬部分與上述主骨架(與磷酸化蛋白質(zhì)相互作用的主要部分。以下有時稱為“磷標記”或“phos-tag”)結(jié)合的基，它具有令本發(fā)明涉及的貴金屬化合物的制造變得容易，或增加取代基(I)的自由度、令取代基(I)與結(jié)合于肽的磷酸基的配位變得容易的作用。
作為“連接基”，只要是具有上述作用的物質(zhì)即可，并無特別限定，例如可以舉出糖鏈、C1-C6亞烷基、氨基(-NH-)、醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、碳酰基(-C(＝O)-)、亞硫?；?-C(＝S)-)、酯基、酰胺基、脲基(-NHC(＝O)NH-)、硫脲基(-NHC(＝S)NH-)、生物素與鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合體、生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合體；在一端具有選自氨基、醚基、硫醚基、碳?；?、亞硫?；?、酯基、酰胺基、脲基、硫脲基群中的基的糖鏈；以及在一端具有選自氨基、醚基、硫醚基、碳?；喠蝓；Ⅴセ?、酰胺基、脲基、硫脲基、生物素與鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合體、生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合體群中的基的C1-C6亞烷基；在兩端具有選自氨基、醚基、硫醚基、碳酰基、亞硫酰基、酯基、酰胺基、脲基、硫脲基群中的相同或不同基的C1-C6亞烷基；以及選自這些基群中的2個以上(含2個)基作直線狀結(jié)合的基。
該連接基中結(jié)合于貴金屬部分一側(cè)的一端，較好的是硫醚基。這是因為這樣的貴金屬化合物可以用硫代化合物或二硫化物化合物容易地制造。
本發(fā)明中“糖鏈”指普通糖類呈直鏈狀或支鏈狀連接，如，D-葡萄糖通過葡糖苷鍵聚合的葡聚糖。該糖鏈除了具有上述的連接基的作用，再加上高親水性帶來的與生物樣品的相合較好，或可以容易地合成為支鏈狀，因此具有可以更多地結(jié)合取代基(I)的主骨架的優(yōu)點。
在這里，“C1-C6亞烷基”指碳數(shù)1～6的直鏈狀或支鏈狀的2價脂肪族烴基，例如亞甲基、亞乙基、亞丙基、四亞甲基、六亞甲基、甲基亞乙基、甲基亞丙基、二甲基亞丙基等，較好的是C1-C4亞烷基，更好的是C1-C2亞烷基。
以上說明的連接基的長度并無特別限制，但較好的是在200nm以內(nèi)(含200nm)，更好的是在100nm以內(nèi)(含100nm)。這是因為連接基的長度越短，越能敏銳地檢測出磷酸化肽。
此外，取代基(I)中，作為與本發(fā)明享有同樣作用效果的物質(zhì)，也可以在吡啶環(huán)中引入甲基等，但該種相等物也包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此外，本發(fā)明涉及的取代基(I)中的連接基的位置并無特別限定，有時存在于下述取代基(I’)所示位置。
該取代基(I’)與取代基(I)完全等價，雖不明確合成中會成為哪種取代基，但實際上可認為是兩者的混合物，當然，取代基(I’)也包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明中的“貴金屬”指金、銀、鉑、銠、釕、鈀、鋨、銥，在本發(fā)明中，較好的是使用金、銀、鉑或銠的任意一種，特別好的是使用金。這是因為實驗證明金能夠良好地發(fā)揮表面等離子共振效果。
本發(fā)明涉及的貴金屬化合物的形狀，上述第1方法中較好的是膜狀。這是因為可以直接適用于表面等離子的測定裝置。該貴金屬膜的厚度并無特別限制，但較好的是10～100nm，通常為約50nm。
另一方面，第2方法中貴金屬化合物的形狀較好的是粒子狀。這是因為本發(fā)明中，對于溶解或分散于被檢試樣中所含有的磷酸化肽，要使貴金屬化合物與其結(jié)合，必須將貴金屬化合物分散于該被檢試樣中。此外，其平均粒徑較好的是在30～50nm的范圍內(nèi)。若不足30nm，則拉曼散射光的增強效果有時不充分，另外，若超過50nm，則測定時粒子可能會過度凝集。但是，該范圍為由于是平均粒徑，所以也可存在超過該范圍的粒子。
平均粒徑的測定方法并無特別限制，但考慮到測定對象的粒子直徑在數(shù)nm～數(shù)十nm的范圍內(nèi)，因此可以通過適于測定微粒子粒徑的激光散射法所適用的裝置(激光散射光度計)，測定粒徑分布后計算平均粒徑。
本發(fā)明的貴金屬化合物可以通過以含有流程1為特征的方法，簡單地進行制造，但制造方法并不局限于以下所示。
[式中，X表示上述的連接基，R1和R2表示用于在貴金屬表面形成-X-磷標記基的活性基。]在上述流程1中，首先將用于形成連接基X的活性基R1置換到貴金屬上。此處，活性基R1與貴金屬的鍵種類并不需要明確，并不特別要求鍵的種類。例如，已知的有，硫代化合物或二硫化物化合物向貴金屬表面自發(fā)吸附，形成被稱為自組裝單分子膜(日文自己組織化単分子膜)的單分子膜。因此，當活性基R1和貴金屬通過硫原子結(jié)合時，上述式中的貴金屬與硫原子的鍵種類并無特別限制，是通過某種相互作用連接在一起的。
對于應置換活性基R1的貴金屬，當最終目的物是貴金屬膜的場合，將原料貴金屬延展至合適的厚度后，切成適用于所使用的SPR測定裝置的形狀即可。在最終目的物是粒子的場合，適用公知的金屬粒子制造方法進行制造后，使用與希望的粒徑相應的膜濾器等，除去過大過或過小的粒子即可。
在上述流程1中，已知通過硫原子令活性基R1結(jié)合到貴金屬表面時，硫代化合物(例如，R1-SH)與貴金屬的反應極其容易，因此其反應條件根據(jù)已有方法即可。例如，可僅令貴金屬表面與硫代化合物的溶液接觸，即可令兩者縮合。
接著，為了通過連接基X令磷標記前驅(qū)體結(jié)合，令含有取代基R2的四(吡啶-2-基甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇衍生物(化合物(VI))反應。在上述流程1中的令R1與R3反應的工序中，R1和R2的種類和溶劑、反應溫度、其他試劑、精制方法等主要根據(jù)X的種類決定。例如，通過酰胺鍵令R1和R2結(jié)合、形成X的情況下，作為R1和R2的組合可以舉例有末端具有氨基(一級氨基)的基和活性化的羧基的組合。此時的一般反應條件可適用有機合成化學領域中一般的條件。如此，可以得到表面具有取代基(VII)的貴金屬化合物。
此外，表面有取代基(VII)的貴金屬化合物也可以通過以下方法制造。
[式中，X”所示為上述的連接基中貴金屬一側(cè)為硫原子，X’顯示的是X”中末端硫原子以外的部分(但是，X”僅為硫原子時，X’所示僅為共有鍵)。]如上所述，由于硫代化合物與貴金屬的反應極為容易進行，因此，通過末端為硫代基的基置換的四(吡啶-2-基甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇衍生物，可以合成表面具有磷標記的貴金屬化合物的前驅(qū)體化合物。
最后，通過向具有取代基(VII)的貴金屬化合物中添加金屬鹽，可以得到表面具有磷標記的貴金屬化合物。例如可添加硝酸鋅(II)和醋酸鋅(II)，但添加醋酸鋅(II)的場合，一旦醋酸配位，即可得到以下的化合物。
該化合物較取代基(I)更穩(wěn)定且保存方便，但它與取代基(I)等價，可與取代基(I)相同地進行使用。即，進行SPR測定時，由于磷酸單酯基與醋酸交換配位，因此可以檢測出磷酸化肽。
在上述流程1中，用于令磷標記與貴金屬結(jié)合的原料化合物(化合物(VI))可通過下述流程2制造。
[式中，R2與上述相同。此外，“Hal”表示鹵素原子，較好的是溴原子。]原料化合物-化合物(II)(1，3-二氨基-2-丙醇)可以使用市售的產(chǎn)品。此外，化合物(III)與化合物(V)由于具有比較簡單的結(jié)構(gòu)，可以使用市售的、或通過本領域技術人員公知的方法進行合成。
在流程2中，首先在催化劑存在的情況下令化合物(II)與(III)進行縮合反應，得到化合物(IV)。本反應中可以逐階段引入化合物(III)，也可以通過使用3當量或3當量以上的化合物(III)，通過單一階段反應得到化合物(IV)。
在流程2中，作為縮合反應進行的是還原性氨基化反應。此時所使用的溶劑只要是能實質(zhì)性地溶解化合物(II)和(III)、對反應無阻礙的即可，并無特別限制，例如，可使用甲醇、乙醇、異丙醇等醇類；(二)乙醚、四氫呋喃、二噁烷等醚類；水；或它們的混合溶劑。
在還原性氨基化反應中，首先可以在濃鹽酸作為催化劑的條件下令化合物(II)和(III)縮合之后，通過通常的還原試劑進行還原。
反應溫度與反應溫度，只要根據(jù)原料化合物的種類等采用適合的條件即可，例如在20～80℃反應12～100小時。
反應結(jié)束后，將溶劑等減壓蒸餾后加入水，用非水溶性溶劑抽出，將油相用無水硫酸鎂等干燥后，減壓蒸餾去除溶劑。接著，可以用硅膠柱色譜法等公知的方法對殘渣進行精制，得到化合物(IV)。
此外，得到化合物(IV)的方法并不僅限于流程2中所示的方法，例如，可以通過化合物(II)和鹵素化合物合成化合物(IV)。
接著，通過令化合物(V)反應，可以得到化合物(VI)。該反應可采用一般的三級胺的合成反應。例如，在溶劑中存在堿的情況下進行縮合。此外，在該步驟中，根據(jù)R2的種類，也可適當引入保護基及進行脫保護?；蛘咭部梢杂煤卸栊匀〈幕衔锎婊衔?V)中的R2，進行該步驟后，通過官能團變換將該惰性取代基變換為R2，以此合成化合物(VI)。例如，可以使用含有惰性取代基——硝基的化合物，在該步驟之后，將硝基變換為活性基——氨基。
可用于本發(fā)明涉及的方法中的取代基也可以使用下述配位化合物(VIII)來代替取代基(I)。
[式中，X與上述相同。此外，R3～R5表示吡啶環(huán)上的4或6位的電子給予性取代基。]由于吡啶氮通過引入到適當置換位置的電子給予性取代基而變得富電性，因此本發(fā)明方法使用的取代基(VIII)對鋅的配位性極佳，因而制造較為容易，且具有穩(wěn)定性?？梢允褂靡匀〈?I)為標準的物質(zhì)。
以下通過制造例和試驗例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不局限于此。
實施例制造例1用于SPR分析的磷標記傳感芯片(Phos-tag sensor chip)的制造將涂有羧甲基葡聚糖的傳感芯片(BIOCRE公司制造，Sensor Chip CM5)裝入SPR測定裝置(BIOCRE公司制造，BIOCORE J)。
使用的電泳緩沖液是含有5×10-3％(v/v)Tween 20、0.20M硝酸鈉以及10μM硝酸鋅的10mM HEPES(2-[4-(2-羥乙基)-1-piperazinyl]乙基磺酸)-氫氧化鈉水溶液(pH7.4)。設傳感芯片的溫度為25℃、電泳緩沖液的流速為30μL/min。確認了表面等離子共振的值穩(wěn)定之后，添加6分鐘的羧基活性劑-EDC(1-乙基-3，4-二甲基氨丙基碳化二亞胺、200mM)與NHS(N-羥基琥珀酰亞胺、50mM)的混合水溶液，激活傳感芯片的羧基。
接著，為了在傳感芯片搭載磷標記，添加6分鐘的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-(2-氨乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇的50％(v/v)乙腈溶液(10mM)。然后，為了封閉(ブロツキングする)殘存的活性羧基，添加6分鐘的(一)乙醇胺水溶液(1.0M)。
通過以上的操作，制作出具有結(jié)合了磷標記的傳感部分的樣品流路(流動池A)。
比較制造例1除未附載磷標記以外，使用與制造例1相同的方法(包括羧基的活化及其封閉)與流動池A平行地制作樣品流路(流動池B)。
試驗例1使用的分析樣品是(i)β-酪蛋白(五磷酸化蛋白質(zhì)、SIGMA公司)、(ii)脫磷酸化β-酪蛋白及(iii)牛血清白蛋白(BSA、New England BioLabs公司)。脫磷酸化β-酪蛋白的調(diào)制是將β-酪蛋白10mg/mL(50μL)與來源于馬鈴薯的酸性磷酸(酯)酶(SIGMA公司)與0.20M的MES-NaOH(pH6.8，50μL)的混合溶液以38℃保溫12小時。將這些樣品分別溶解于上述制造例1中使用的電泳緩沖液中，得到樣品濃度1.5μM的樣品溶液。
對上述樣品溶液進行SPR測定。具體的說分別制作上述制造例1和比較制造例1，對用電泳緩沖液穩(wěn)定化的流動池A、B，將各樣品溶液以溫度25℃、流速30μL/min進行沖洗結(jié)合15分鐘，接著，僅用電泳緩沖液沖洗15分鐘，進行解離。在測定了各樣品溶液之后，用25mM硫酸-鉀-25mM磷酸二鈉水溶液(pH6.86)沖洗6分鐘，用0.20M乙二胺四乙酸二鈉水溶液(pH7.4)沖洗6分鐘，用上述電泳緩沖液沖洗5分鐘，進行傳感芯片的再活性化(除去殘存結(jié)合物)。
各樣品(i)～(iii)的SPR測定結(jié)果分別如圖3～5所示，在各樣品的測定結(jié)果中，從流動池A的RU值至流動池B的RU值的差如圖6所示。根據(jù)圖4～6的結(jié)果，流動池A與B的變化基本相同，脫磷酸化β-酪蛋白與BSA并未特異結(jié)合。另一方面，根據(jù)圖3和6的結(jié)果，被磷酸化的β-酪蛋白與結(jié)合有磷標記的傳感部分產(chǎn)生了特異結(jié)合(最大鍵量3150RU)。因此，驗證了根據(jù)本發(fā)明方法，可以僅檢測出被磷酸化的肽。
試驗例2
使用的分析樣品是(iv)磷酸化SRC肽(磷酸化肽、ANA SPEC公司)以及(v)SRC肽(非磷酸化肽、ANA SPEC公司)。將這些樣品分別溶解于上述制造例1中使用的電泳緩沖液中，得到樣品濃度1～15μM的樣品溶液。
使用上述制造例1和比較制造例1制作的流動池A、B，對上述樣品溶液進行SPR測定。具體的說，除進行上述試驗例1中的樣品的結(jié)合時間與離解時間5分鐘，傳感芯片的再活性化(除去殘存結(jié)合物)用0.40M磷酸緩沖液(pH7.0)沖洗5分鐘，0.20M乙二胺四乙酸二鈉水溶液(pH7.4)沖洗5分鐘，上述制造例1的電泳緩沖液沖洗5分鐘外，其余用與上述試驗例1相同的條件進行SPR測定。結(jié)果在圖7表示。
根據(jù)該結(jié)果，與非磷酸化肽即使?jié)舛葹?5μM也幾乎沒有變化相比，磷酸化肽不僅在濃度為15μM的場合，而且即使在1和5μM的場合，也能明確地把握到它的存在。因此，可以明確，根據(jù)本發(fā)明，即使是具有同樣氨基酸配列的肽，也可以明確地判斷是否結(jié)合有磷酸。
制造例2用于SPR分析的磷標記傳感芯片的制造將表面結(jié)合有鏈霉抗生物素蛋白的鏈霉抗生物素蛋白-傳感芯片(BIOCRE公司制造，傳感芯片SA)裝入SPR測定裝置(BIOCRE公司制造，BIOCORE J)。
作為電泳緩沖液使用的是含有5×10-3％(v/v)Tween 20、0.20M硝酸鈉以及10μM硝酸鋅的10mM HEPES(2-[4-(2-羥乙基)-1-piperazinyl]乙基磺酸)-氫氧化鈉水溶液(pH7.4)。將傳感芯片的溫度設為25℃，用流速為30μL/min的電泳緩沖液沖洗至表面等離子共振的值穩(wěn)定。
接著，為了令傳感芯片搭載磷標記，用末端具有生物素結(jié)構(gòu)的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-2-(6-D-生物素酰胺六羧基酰胺乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇(具有下述結(jié)構(gòu)的化合物)的1.0mM上述電泳緩沖液沖洗。溫度為25℃，流速為30μL/min，結(jié)合時間為6分鐘。
由于上述化合物被配位于電泳緩沖液中的鋅離子，成為磷標記，且末端的生物素對鏈霉抗生物素蛋白顯示出極高的親和性，因此磷標記被搭載在傳感芯片上。
比較制造例2上述制造例2中，除了附載磷標記以外，其余使用相同的方法，制作未結(jié)合磷標記的傳感芯片。
試驗例3使用的分析樣品是溶解于電泳緩沖液(5×10-3％(v/v)Tween 20、含有0.20M硝酸鈉與10μM硝酸鋅的10mM HEPES-氫氧化鈉水溶液(pH7.4))的β-酪蛋白(五磷酸化蛋白質(zhì)，SIGMA公司)。樣品濃度為1.5μM。
用溫度25℃、流速30μL/min、結(jié)合時間15分鐘、離解時間10分鐘對上述分析樣品進行SPR測定。測定后，用0.40M磷酸水溶液沖洗6分鐘，0.20M乙二胺四乙酸二鈉水溶液(pH8.0)水溶液沖洗6分鐘，上述電泳緩沖液沖洗5分鐘，進行傳感芯片的再活性化(除去殘存結(jié)合物)。
測定結(jié)果如圖8所示。根據(jù)該結(jié)果，通過沖洗分析樣品，RU增加了2056，因此可知，本發(fā)明的貴金屬膜(結(jié)合了磷標記的貴金屬傳感芯片)上結(jié)合有磷酸化蛋白質(zhì)。此外，在與上述相同的條件下用非磷酸化蛋白質(zhì)—牛血清白蛋白代替磷酸化蛋白質(zhì)進行試驗，但RU完全沒有變化。因此，明確了本發(fā)明的貴金屬膜可以僅檢測出結(jié)合了磷酸的蛋白質(zhì)。
此外，對于比較制造例2中制造的傳感芯片也在同樣條件下進行了試驗，但RU完全沒有變化。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性根據(jù)本發(fā)明涉及的表面等離子共振(SPR)的測定方法，即使是含有生物試樣等多種多樣化合物的被檢試樣，也可以很容易地判斷是否存在磷酸化肽(蛋白質(zhì))。而且，還能決定磷酸化肽的量和濃度。又，也可以判斷肽是否被磷酸化。因此，通過對生物樣品等適用本發(fā)明方法，可應用于疾病的診斷等，這一點是非常有用的。
此外，由于本發(fā)明的貴金屬化合物顯示出以往所不具有的、對磷酸化肽的配位結(jié)合性，所以有利地用上述方法使用中，其前驅(qū)體化合物也同樣很有用。
權利要求
1.一種表面等離子共振的測定方法，所述表面等離子共振的測定方法是在棱鏡底面配放貴金屬化合物，向該棱鏡照射光后，檢測出其反射光，其特征在于，作為所述貴金屬化合物，使用在與所述棱鏡相接側(cè)的相反側(cè)具有下述式(I)表示的取代基的貴金屬化合物，該貴金屬化合物中，在其具有該取代基(I)的一側(cè)添加被檢試樣。 [式中，X表示連接基。]
2.一種表面等離子共振的測定方法，其特征在于，對被檢試樣添加在其表面具有下述式(I)表示的取代基的貴金屬化合物，進行拉曼光譜法。 [式中，X表示連接基。]
3.一種貴金屬化合物，其特征在于，在其表面具有下述式(I)表示的取代基。 [式中，X表示連接基。]
4.如權利要求3所述的貴金屬化合物，其特征在于，所述化合物為膜狀。
5.如權利要求3所述的貴金屬化合物，其特征在于，所述化合物為粒子狀。
6.一種前驅(qū)體化合物，其特征在于，在貴金屬表面具有用下述式(VII)表示的取代基。 [式中，X表示連接基。]
7.如權利要求6所述的前驅(qū)體化合物，其特征在于，所述化合物為膜狀。
8.如權利要求6所述的前驅(qū)體化合物，其特征在于，所述化合物為粒子狀。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可以從生物試樣等中容易地檢測出磷酸化肽(蛋白質(zhì))的存在，判斷肽是否被磷酸化的表面等離子共振測定方法及因?qū)α姿峄木哂懈吲湮绘I能而可適合應用于該方法中的貴金屬化合物。本發(fā)明所述的第1表面等離子共振的測定方法是在棱鏡底面配放貴金屬化合物，向該棱鏡照射光后，檢測出該反射光的表面等離子共振的測定方法，其要點是作為該貴金屬化合物，可使用在與該棱鏡相接一側(cè)的相反側(cè)具有式(I)表示的取代基的貴金屬化合物，該貴金屬化合物中，在具有該取代基(I)的一側(cè)添加被檢試樣。[式中，X表示連接基。]
文檔編號G01N21/27GK1867823SQ200480029990
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月12日 優(yōu)先權日2003年10月16日
發(fā)明者小池透, 川崎昭彥, 小橋達弘, 高萩誠 申請人:株式會社納德研究所