專利名稱：純化百日咳毒素的方法及其中有用的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到純化百日咳毒素(PT)的試劑和方法。
背景技術(shù)：
百日咳毒素(PT)由百日咳桿菌(Bordetella pertussis)產(chǎn)生，是所有預(yù)防百日咳的疫苗的主要成分，通常情況下，PT與破傷風毒素和白喉毒素聯(lián)合使用。通常通過在一定的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)百日咳桿菌，然后分離出上清中的PT，再用已知技術(shù)進行純化來實現(xiàn)PT的工業(yè)化生產(chǎn)(即，美國專利號6,399,076；5,877,298；和Sekura等.J.Biol.Chem.25814647-14651，1983；Bogdan等.Appl.Env.Micro.69(10)6272-6279，Oct.2003)。大多數(shù)已知的方法都需要用到牛胎球蛋白(BF)或去唾液酸胎球蛋白結(jié)合的基質(zhì)，它們的來源和純度非常關(guān)鍵。使用牛來源的試劑也帶來了對牛相關(guān)疾病如牛海綿狀腦病(BSE)的擔憂。
于是本領(lǐng)域的技術(shù)人員期望有一種無需依靠BF的方法來純化PT，其中Bogdan等描述了一個這樣的方法(Appl.Env.Micro.69(10)6272-6279，Oct.2003)，通過噬菌體展示系統(tǒng)確認了具有模擬牛胎球蛋白的糖苷部分與PT結(jié)合能力的肽，三個具有共同序列XGSFSGF(X為任何氨基酸)的肽(3GFNGSGSGF；3G8NGSFSGC；3G2DGSFSGF)被確認具有PT結(jié)合能力。3G2還被用于親和層析柱以純化經(jīng)部分純化的PT制劑。
其他設(shè)計和使用肽而不用牛來源的產(chǎn)品來純化PT的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所期待。這里提供的親和純化PT的試劑和方法不涉及到任何形式的肽球蛋白的使用。
附圖簡述

圖1.A)匙羹藤抑甜味肽(gurmarin)文庫示意圖，文庫中翻譯成氨基酸序列的位置被突出顯示，蛋白部分(59個氨基酸長度)的序列用單字母氨基酸碼表示，其中X代表任何氨基酸。文庫中不被翻譯的位置用灰色方框表示。(a)T7啟動子，用于文庫的體外最適轉(zhuǎn)錄，(b)TMV-煙草花葉病毒的翻譯啟動序列，用于文庫的體外理想翻譯，(c)His6-tag，用于PROfusionTM文庫的有效親和純化，(d)結(jié)構(gòu)性的柔性接頭，(e)帶有兩個分別含有5個和9個氨基酸的隨機環(huán)狀結(jié)構(gòu)的匙羹藤抑甜味肽核心，(f)結(jié)構(gòu)性的柔性接頭和(g)與嘌呤霉素受體分子有效結(jié)合的最佳接頭。B)匙羹藤抑甜味肽PROfusionTM文庫的構(gòu)建是一個多步驟的過程，包括以下反應(yīng)PCR、體外轉(zhuǎn)錄、RNA與嘌呤霉素寡核苷酸接頭的化學(xué)連接、體外翻譯、寡-dT純化、逆轉(zhuǎn)錄和His-tag純化。
圖2.PROfusionTM選擇循環(huán)示意圖。
圖3.篩選出的應(yīng)該進行PT結(jié)合活性測試的匙羹藤抑甜味肽變異體。保守基序用有色方框突出表示。
圖4.經(jīng)過PT 4輪篩選的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各個變異體的氨基酸序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)和匙羹藤抑甜味肽支架結(jié)構(gòu)的恒定區(qū)被突出標出。隨機環(huán)狀結(jié)構(gòu)1和2的位置被指明。
圖5.經(jīng)過PT(環(huán)氧)5a輪篩選的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各個變異體的氨基酸序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)和匙羹藤抑甜味肽支架結(jié)構(gòu)的恒定區(qū)被突出標出。隨機環(huán)狀結(jié)構(gòu)1和2的位置被指明。
圖6.經(jīng)過PT(strep)5b輪篩選的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各個變異體的序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)和匙羹藤抑甜味肽支架結(jié)構(gòu)的恒定區(qū)被突出標出。隨機環(huán)狀結(jié)構(gòu)1和2的位置被指明。
圖7.經(jīng)過PT(strep)6a輪篩選的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各個變異體的序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)和匙羹藤抑甜味肽支架結(jié)構(gòu)的恒定區(qū)被突出標出。隨機環(huán)狀結(jié)構(gòu)1和2的位置被指明。
圖8.經(jīng)過PT(strep)6b輪篩選的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各個變異體的序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)和匙羹藤抑甜味肽支架結(jié)構(gòu)的恒定區(qū)被突出標出。隨機環(huán)狀結(jié)構(gòu)1和2的位置被指明。
圖9.篩選出的將進行PT結(jié)合活性測試的PP26變異體。保守基序被突出標出。
圖10.經(jīng)過PT 4輪篩選的PP26的序列分析。各變異體的氨基酸序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)被突出標出。
圖11.經(jīng)過PT(環(huán)氧)5a輪篩選的PP26的序列分析。各變異體的氨基酸序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)用淡黃色的方框標示，保守基序被突出標出。
圖12.經(jīng)過PT(strep)5b輪選擇的PP26的序列分析。各變異體的氨基酸序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)用淡黃色的方框標示，保守基序被突出標出圖13.經(jīng)過PT(strep)6a輪選擇的PP26的序列分析。各變異體的氨基酸序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)用淡黃色的方框標示，保守基序被突出標出。
圖14.經(jīng)過PT(strep)6b輪選擇的PP26的序列分析。各變異體的氨基酸序列用單字母氨基酸碼表示。文庫的恒定側(cè)翼區(qū)被突出標出。
圖15.生物素標記的合成的核心肽被固化到鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上，求證其與純化的PT結(jié)合。取1/40結(jié)合反應(yīng)后的上清通過12％的NuPage凝膠用MES電泳緩沖液(running buffer)進行分離來對未結(jié)合的PT組分進行分析(上面的凝膠)，取50％的洗脫液通過12％的NuPage凝膠用MES電泳緩沖液進行分離來分析與瓊脂糖結(jié)合的PT(下面的凝膠)，用銀染的方法著色顯示。一定量的純化的PT被用作定量的標準，匙羹藤抑甜味肽15和9除外。
圖16.從樣品A(左凝膠)和樣品B(右凝膠)純化PT。取50％的洗脫液通過12％的NuPage凝膠用MES電泳緩沖液進行分離來分析瓊脂糖結(jié)合的PT(下面的凝膠)，用銀染的方法著色顯示。一定量的純化的PT被用于定量的標準，匙羹藤抑甜味肽9除外。
圖17.結(jié)合到固定化的肽pp26克隆9和克隆15和匙羹藤抑甜味肽克隆9和匙羹藤抑甜味肽克隆15的來自樣品A或B的PT的洗滌條件的優(yōu)化，用50mM Tris/HCl，pH 7.5或50mM乙酸鹽，pH 6進行3次洗滌，PT用12％的Bis Tris凝膠分析并用銀染法著色顯示。PPM為蛋白完美標記(protein perfect marker)。
圖18.結(jié)合到固定化的肽pp26克隆9和克隆15的來自樣品B的PT的洗滌條件的優(yōu)化，用50mM Tris/HCl，pH 7.5或50mM乙酸鹽，pH 6進行3到20次洗滌，PT用12％的Bis Tris凝膠分析并用銀染法著色顯示。
圖19.用含0.2到2.0M MgCl2的50mM Tris/HCl從肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上洗脫PT，肽結(jié)合的PT經(jīng)過用所指定的洗脫緩沖液(每次20μl)連續(xù)3次洗脫后從肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上置換出，殘留的物質(zhì)繼之用凝膠上樣緩沖液洗脫。所有洗脫物用12％的Bis Tris凝膠(1x MES電泳緩沖液)分析并用銀染法著色顯示。
圖20.在酸性(50mM甘氨酸，pH2.5)或堿性(100mM碳酸鹽緩沖液，pH 10.5)條件下從肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上洗脫PT。肽結(jié)合的PT經(jīng)過用所指定的洗脫緩沖液(每次40μl)連續(xù)3次洗脫后從肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠(20μl含約200pmol的肽)上置換出，殘留的物質(zhì)繼之用凝膠上樣緩沖液洗脫。所有洗脫物用12％的Bis Tris凝膠(1xMES緩沖液)分析并用銀染法著色顯示。取1/40體積的肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠與樣品A孵育后的流通液與各個肽在同一凝膠上進行分析。
圖21.用固定有pp26肽9的鏈霉親和素瓊脂糖凝膠作為親和配體小規(guī)模柱純化樣品B中的PT(A)，用凝膠估計的純化的PT產(chǎn)量(B)。
圖22.用固化有匙羹藤抑甜味肽15作為親和配體從鏈霉親和素瓊脂糖凝膠小規(guī)模柱純化樣品B中的PT(A)，用凝膠估計的純化的PT產(chǎn)率(B)。
圖23.PT與肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠的結(jié)合取決于用于固定化到鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上的肽量的變化(每1ml)。結(jié)合的PT的量通過與同一凝膠上的已知量的純化PT直接比較來決定。例如，將pp26/9對每ml鏈霉親和素瓊脂糖凝膠的用于固定化的肽量繪圖。最大PT結(jié)合量估計在100-150pmol。
圖24.PT產(chǎn)率作為每μl肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠或每6.85μl去唾液酸胎球蛋白瓊脂糖凝膠中不同量的加入物質(zhì)(樣品B)的函數(shù)。洗脫的PT量根據(jù)與同一凝膠上的已知量的純化了的PT直接比較計算出并列于表2中。
圖25.再利用的肽瓊脂糖凝膠反復(fù)用于PT的結(jié)合和洗脫。結(jié)合于鏈霉親和素瓊脂糖凝膠的PT用100mM的pH10.5的碳酸鹽緩沖液洗脫4次，柱內(nèi)基質(zhì)用10mM HCl進行再生處理。
圖26.經(jīng)過FPLC柱用pp26/9肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠(0.5ml)對樣品B進行純化得到的PT洗脫組分。該洗脫組分(各500μl中的0.5μl)用PAGE分析(12％Bis-Tris-Gel，MES電泳緩沖液)并用銀染著色，已知量的純化的PT在同一凝膠上電泳用于直接比較。通過測定洗脫組分在280nm的吸收值并與純化的PT標準(見表)進行比較來確定PT的濃度。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及到純化百日咳毒素(PT)的方法。在一個實施方案中，其方法是通過共價連接將一個結(jié)合在肽受體(peptide acceptor)上的核酸逆轉(zhuǎn)錄引物連接到RNA上，翻譯該RNA產(chǎn)生一個蛋白產(chǎn)物與引物共價連接的肽產(chǎn)物，逆轉(zhuǎn)錄該RNA形成DNA-蛋白質(zhì)融合體，測試該融合體產(chǎn)物來確定那些含有PT結(jié)合功能的肽，然后通過測序來確認肽的序列。在其他實施方案中，提供具有PT結(jié)合能力的肽，用于從復(fù)雜生物液體中純化出PT。還提供結(jié)合于固體支持體和/或?qū)游鎏盍嫌糜趶膹?fù)雜生物液體中純化出PT的肽以及進行這種純化的方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種純化百日咳毒素(PT)的新方法的試劑和一套思路。如以上所描述，其中一個這樣的方法已由Bogdan等所證實，在那一方法中，噬菌體展示試驗被用于確認PT結(jié)合肽。為了實施本發(fā)明的目的，PT包括自然表達的PT、減毒的PT(基因工程或其他)、自然的或其他的PT變異體、重組PT、PT片段或其他形式的PT(見，例如，美國專利號6,399,076；6,168,928；6,018,022；5,977,304；5,965,385；5,856,122；5,877,298；5,433,945；5,358,868；5,332,583；5,244,657；5,221,618；5085,862；4,997,915)。在大多數(shù)情況下，化學(xué)減毒在PT純化完成后進行。任何形式的PT均適用于實施本發(fā)明，只要這里描述的試劑能夠與該特殊形式的PT結(jié)合。在本申請中，所有引用的參考文獻、專利和專利申請均通過引用結(jié)合于本文中。
本發(fā)明也涉及到用重組技術(shù)來確認PT結(jié)合肽，本發(fā)明提供的方法優(yōu)于本領(lǐng)域已知方法。另外，這里還提供用于純化PT的新肽。在一個實施方案中，通過共價連接將一個連接在肽受體(peptide acceptor)上的核酸逆轉(zhuǎn)錄引物連接到RNA上，翻譯該RNA產(chǎn)生一個蛋白產(chǎn)物與引物共價連接的肽產(chǎn)物，逆轉(zhuǎn)錄該RNA形成DNA-蛋白質(zhì)融合體，測試該融合體產(chǎn)物來確定那些含有PT結(jié)合功能的肽，然后通過測序來確認肽的序列。在某些實施方案中，RNA部分可以通過RNA降解化合物如Rnase H從復(fù)合物中去除。光交聯(lián)試劑和肽受體也適用于實施本發(fā)明。該系統(tǒng)和相關(guān)的試劑在其他地方，如美國專利號6,416,950(Lohse，等)；6,429,300(Kurz，等)；6,436,665(Kuimelis，等)；6,602,685(Lohse，等和6,623,926(Lohse，等)中已有描述。
在實施本發(fā)明時，試劑如核酸、肽、融合體、配體、親和復(fù)合物或類似物可以非彌散性地結(jié)合或附著在固體支持體上，為了達成非彌散性結(jié)合或附著，試劑通過化學(xué)或物理的方法結(jié)合到固體支持體上，使試劑在有液體存在時不會從試劑的高濃度區(qū)域移動到試劑的低濃度區(qū)域。固體支持體為任何柱子(灌裝或未灌裝的層析填料或柱物質(zhì))、微珠、試管、微滴定盤、固體顆粒(瓊脂糖(agarose)或瓊脂糖(sepharose))、微芯片(即，硅、硅玻璃或金芯片)、膜(即，脂質(zhì)體膜或囊膜)或其他可以供試劑直接或間接(例如，通過其他結(jié)合配偶中間體，如抗體、蛋白A、蛋白G、鏈霉親和素、生物素)結(jié)合或附著的介質(zhì)。
在優(yōu)選的實施方案中，試劑是有能力與PT結(jié)合的物質(zhì)或化合物。更優(yōu)選的是，試劑是能夠可逆性地與PT結(jié)合的物質(zhì)或化合物，甚至更優(yōu)選的是試劑為能夠在含有除PT外還有其他成分的液體中至少與PT結(jié)合，甚至可逆性結(jié)合的肽。與PT可逆性結(jié)合的試劑為在一種條件下(吸附)結(jié)合PT，在另一種條件下(解吸)釋放PT。例如，當暴露于中性pH的條件下時試劑可與PT結(jié)合，而暴露于酸性或堿性pH的條件下時將PT釋放。這樣，試劑與PT的結(jié)合能力(即，平衡解離常數(shù)或Kd)可以通過改變試劑與PT接觸時的條件來調(diào)節(jié)。其他條件包括溫度、離子強度(即，離子鹽濃度，如氯化鈉或氯化鎂)、溶劑濃度、競爭試劑/自由配體/類似物的存在與否、極性也在本領(lǐng)域所知的可改變的條件之中。
在某些實施方案中，親和基質(zhì)(即結(jié)合在固體支持體上的PT結(jié)合肽)用于從生物或其他液體的復(fù)雜混合物中分離希望得到的成分(即PT)。在某些情況下，可能會希望從復(fù)雜的生物液體如細菌裂解液或其他PT不構(gòu)成主要成分的液體組合物(如通過SDS-PAGE確定)中純化出PT。在其他情況下，可能會從已經(jīng)過部分純化的、其主要成分主要為PT的組合物(PT含量大于或等于50％的組合物)中分離PT，例如通過SDS-PAGE確定的PT構(gòu)成了組合物中總蛋白的50％或更多的組合物在大多數(shù)情況下被認為是部分純化的。
為了純化PT，將含有PT的組合物與PT結(jié)合試劑結(jié)合，優(yōu)選與結(jié)合在固體支持體上的可逆性的PT結(jié)合試劑結(jié)合，經(jīng)過足夠時間使PT與PT結(jié)合試劑相互結(jié)合形成復(fù)合物，洗去非PT成分，改變一種或多種條件(即pH)使PT與PT結(jié)合試劑的Kd增高，PT即從復(fù)合物中釋放出來，收集釋放出的PT，制備待用。這樣的分離可稱為親和純化，這樣的純化產(chǎn)品被稱為經(jīng)親和純化的產(chǎn)品。
被本領(lǐng)域的技術(shù)人員普遍認為的選擇性較親和純化技術(shù)差的色譜技術(shù)也可用于本發(fā)明，正如本領(lǐng)域所知，這樣的技術(shù)可以包括，例如分子排阻色譜、離子交換色譜、反相色譜和疏水相互作用色譜。任何這些技術(shù)(包括親和純化)可以使用合適的固體支持體在低壓色譜(LPC)、高壓液相色譜(HPLC)和快速蛋白液相色譜系統(tǒng)進行。用于實施這些技術(shù)的合適的固體支持體和設(shè)備在本領(lǐng)域廣泛可得。在實施本發(fā)明時，親和色譜和更一般的技術(shù)可以聯(lián)合使用，以滿足要么部分純化起始物質(zhì)(即復(fù)雜生物液體如細菌裂解物)、純化物質(zhì)，要么進一步純化經(jīng)親和和其他純化方法純化后的物質(zhì)(即親和純化的PT)的需要。
能夠與PT結(jié)合的肽已被確定并在這里進行描述。某些肽被發(fā)現(xiàn)能夠與PT高強度結(jié)合。這些優(yōu)選的肽包括RSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDA(pp26-5)；STMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSIDA(pp26-6)；RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA(pp26-9)；RSWRDTRKLHMRHYFPLAIDSYWDHTLRDA(pp26-15)；SGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYT8ELYATCG(G-9)；SGCVKKDELCELAVDECCEPLECFQMGHGFKRCG(G-10)；SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS(G-15)；SGCVKKDELCELAIDECCEPLECTKGDLGFRKCG(G-19).
這些肽中，特別優(yōu)選的有RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA(PP26-9)；SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS(G-15)進一步考慮的是相關(guān)的肽，如至少具有肽的一種特征或活性(即活性或抗原性)的、例如片段、定向同源變異體、同源體和衍生物。片段包含氨基端(有或沒有信號序列)和/或羧基端序列有截斷的肽。片段也可以包括變異體、定向進化同源體、同源體和其他與親代肽相比含有一個或多個氨基酸添加或取代或內(nèi)部刪除的變異體。在優(yōu)選實施方案中，包括一個氨基酸、兩個氨基酸、五個氨基酸、10個氨基酸、20個氨基酸、30個氨基酸、40個氨基酸、50個氨基酸或更多氨基酸的截斷和/或刪除。變異體即是與親代序列相比含有一個或多個序列的取代、刪除和/或添加。變異體可以是自然發(fā)生的，也可以是人為構(gòu)建的。這樣的變異體可以用相應(yīng)的核酸分子來制備。在優(yōu)選方案中，變異體有1到3、或1到5、或1到10、或1到15、或1到20、或1到25、或1到30、或1到40、或1到50或多于50個的氨基酸被取代、插入、添加和/或刪除。
取代可以是保守的、或非保守的、或它們的任何組合。對多肽序列進行保守氨基酸修飾(對編碼核苷酸的對應(yīng)修飾)可以產(chǎn)生與親代多肽功能和化學(xué)性狀相似的多肽。例如，“保守氨基酸取代”可以涉及到用非天然氨基酸取代天然氨基酸殘基，而使該位置上的氨基酸在大小、極性、電荷、疏水性或親水性方面只受到很小的影響或完全沒有影響，尤其是不會降低其免疫原性。合適的保守氨基酸取代見表1。
表1
當PT這樣的成分與其有共同來源(即細菌裂解物)的至少約50％的蛋白、脂類、糖類或其他物質(zhì)相分離時，可以稱為被純化了，優(yōu)選的是通過SDS-PAGE電泳確定，該成分從至少約95-100％、90-95％、80-90％、70-80％、60-70％或50-60％的組合物總蛋白含量中分離出來。在某些方案中，一種純化了的成分是單獨或與其他因子聯(lián)合用于宿主后在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)出免疫反應(yīng)的成分。免疫反應(yīng)可以包括產(chǎn)生與PT或百日咳桿菌的至少一個表位結(jié)合的抗體，和/或產(chǎn)生針對表達PT的細胞的細胞免疫反應(yīng)。反應(yīng)可以是對現(xiàn)有免疫反應(yīng)的強化，例如，通過增加抗體的產(chǎn)量、產(chǎn)生對抗原有更高親和性的抗體或增強的細胞反應(yīng)(即增強的T細胞)，其他免疫反應(yīng)測定法為本領(lǐng)域所知，可適用于確定是否有免疫反應(yīng)發(fā)生。
用這里描述的方法分離得到的PT可用于制備藥用組合物。優(yōu)選的PT藥用組合物包括，例如，PT的液體制劑，如混懸液、糖漿或酏劑。優(yōu)選的注射制劑包括，例如，適用于胃腸外、皮下、皮內(nèi)、肌肉或靜脈給藥的如肽無菌混懸液或乳液。例如，PT可以與合適的載體、稀釋劑或賦形劑如無菌水、生理鹽水、葡萄糖或類似物混合，制備成組合物。組合物也可以以凍干粉的形式提供，例如用等滲液體、生理鹽水緩沖液重建后使用。這樣的組合物也可以被用來制備疫苗，正如，例如在美國專利5,877,298和6,399,076(Vose等)和國際申請?zhí)朠CT/CA96/00278中描述的那樣。用這里提到的方法制備的PT也可以與本領(lǐng)域所知的其他病原微生物中的如棒狀桿菌(即白喉)、梭桿菌(即破傷風)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(即IPV、OPV)、肝炎病毒、奈瑟氏菌(即腦膜炎)、鏈球菌、噬血桿菌或其他百日咳抗原(即絲狀血凝素、百日咳外膜蛋白和凝集素)聯(lián)合使用。
通過以下給出的用于闡明的實施例可以對本發(fā)明和它的優(yōu)點有一個更好的理解。
實施例材料和方法A.百日咳毒素(PT)PT為分子量109kD的雜多聚蛋白(由6個亞單位S1、S2、S3、2x、S4、S5組成)。一種高純度(＞99.99％)的硫酸銨沉淀物制劑被使用。識別天然六聚復(fù)合體的PT特異性的配體(脫唾液酸胎球蛋白)也用于實驗，脫唾液酸胎球蛋白有溶液和固定化于瓊脂糖凝膠上的兩種形式。
B.匙羹藤抑甜味肽文庫篩選匙羹藤抑甜味肽是來自蘿藦科藤(Asclepiad vine)匙羹藤(Gymneasylvestre)的一種35個氨基酸殘基的多肽。由于能夠選擇性地抑制大鼠對甜味的神經(jīng)反應(yīng)，它被用作研究甜味傳導(dǎo)的藥理學(xué)工具。它對人體沒有明顯的影響。推測匙羹藤抑甜味肽的味覺抑制效應(yīng)可能是直接通過與甜味受體結(jié)合引起，或者可能是與甜味傳導(dǎo)系統(tǒng)下游靶相互作用所致(1)。
匙羹藤抑甜味肽屬于“Knottins”家族，為一組通常在長度上小于40個氨基酸的結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白。Knottins與靶分子結(jié)合的范圍很雜，包括蛋白、糖和脂類，但它們都含有一個共同支架結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含小三鏈反向平行β片層和二硫鍵結(jié)合框架結(jié)構(gòu)(2、3)。
一個帶有15個隨機氨基酸位置的特異的匙羹藤抑甜味肽文庫被設(shè)計出來，如下所示野生型匙羹藤抑甜味肽qqCVKKDELCIPYYLDCCEPLECKKVNWWDHKCig匙羹藤抑甜味肽核心CVKKDELCXXXXXXCCEPLECXXXXXXXXXC在匙羹藤抑甜味肽核心序列中，X為任何氨基酸。該文庫被證實產(chǎn)生對蛋白靶的高親和力的結(jié)合序列。該匙羹藤抑甜味肽文庫結(jié)合了一系列優(yōu)點，至少有以下原因使其成為了篩選抗PT毒素的最好選擇有限的柔性；彌補了在針對靶的拓撲學(xué)變構(gòu)中的高熵消耗；與線性文庫相比，理論上能以較少的氨基酸產(chǎn)生較強的結(jié)合力；對蛋白酶有抗性；并且對下游應(yīng)用中的氧化還原洗脫條件敏感。構(gòu)建匙羹藤抑甜味肽文庫的過程在圖1中顯示。
1.起始寡核苷酸的PCR三個凝膠純化的寡核苷酸被用于構(gòu)建含有兩個隨機環(huán)狀結(jié)構(gòu)的匙羹藤抑甜味肽文庫。用1μm 5’端His-tag引物5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG CACCAT CAC CAT CAC CAT AGT GGC TCA AGC TCA GGA TCA-3′和1μM 3’端引物5′-TTT TAA ATA GCG GAT GCT ACT AGG CTA GAC CCA GAA CTG CCG CT-3′，在Taq多聚酶的作用下，對1nmole的匙羹藤抑甜味肽模板(≈約6·1014個序列)5′-AGT GGCTCAAGC TCA GGA TCA GGC TGC GTG AAG AAA GAC GAG CTC TGC NNS NNS NNSNNS NNS NNS TGC TGT GAG CCC CTC GAG TGC NNS NNS NNSNNS NNS NNSNNS NNS NNS TGC GGC AGC GGC AGT TCT GGG TCT AGC-3′，進行擴增，經(jīng)過6輪PCR擴增(94℃，1min；65℃，1min；72℃，1min)后，在2％的瓊脂糖凝膠上進行分析，提示代表性的文庫已被建立。
2.體外轉(zhuǎn)錄用Promega的RiboMaX Express體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，37℃孵育45分鐘后，加入DnaseI繼續(xù)孵育15分鐘，然后用酚/氯仿抽提，過量的NTP通過NAP-5凝膠進行過濾去除。用6％的TBU凝膠分析，顯示雙鏈DNA已被成功轉(zhuǎn)錄。
3.用化學(xué)方法連接RNA與嘌呤霉素-寡核苷酸接頭純化的RNA被退火(85℃，1分鐘，以0.3℃/秒的速度冷卻到25℃)連接到1.5倍過量的嘌呤霉素-寡核苷酸接頭PEG2A185’-補骨脂內(nèi)酯-UAG CGG AUG C A18(PEG18-9)2CC嘌呤霉素(斜體顯示的核苷酸代表2’-O-甲基-衍生物，通過紫外光(365nm)在室溫下照射15分鐘完成共價連接。用6％的TBU凝膠對反應(yīng)產(chǎn)物進行分析，顯示連接反應(yīng)已有效進行。
4.體外翻譯用Promega的兔網(wǎng)織紅細胞裂解物在15μCi35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmole)存在的條件下對已連接好的RNA進行翻譯，30℃孵育30分鐘后，加入KCl和MgCl2使其終濃度分別為530mM和150mM，取樣在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠上進行分析，顯示翻譯反應(yīng)成功。
5.寡-dT純化分子(mRNA-蛋白融合體)通過在孵育緩沖液(100mM pH 0，10mM EDTA，1mM and 0.25％Triton X-100)中與寡-dT磁珠(Miltenyi)4℃孵育5分鐘進行分離。用MiniMACS-柱(Miltenyi)對PROfusionTM分子進行過濾分離，用孵育緩沖液洗柱并用水進行洗脫。取樣在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠上進行分析，顯示反應(yīng)成功。
6.逆轉(zhuǎn)錄在供應(yīng)商推薦的條件下，用SuperScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)，在5倍過量的3’引物存在的條件下進行逆轉(zhuǎn)錄制備相應(yīng)的cDNA，取樣在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠上進行分析，顯示反應(yīng)成功。
7.His-tag純化逆轉(zhuǎn)錄后的PROfusionTM分子在HBS緩沖液(20mM HEPES pH7.0，150mM 0.025％Triton X-100，100已剪切的鮭精DNA，1mg/mlBSA))中與Ni-NTA-瓊脂糖混合(50μl/PROfusionTM)(QIAGEN)，在室溫下孵育60分鐘并輕輕搖動。然后過濾Ni-NTA，用HBS/5mM咪唑洗滌，并用HBS/150mM咪唑進行洗脫。取樣在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠上進行分析，顯示純化成功。每次篩選將用20pmole(≈約1·1013序列)的PROfusionTM。
B.用于篩選的線性肽文庫PP26含有26個隨機氨基酸位置的特異性線性肽文庫PP26也用以下構(gòu)建體被設(shè)計出來T7-TMV-MGRGS-HHHHHH-ARS-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-DANAPK-ASAI蛋白部分的序列(50個氨基酸長度)用單一字母氨基酸碼顯示，其中X代表任何氨基酸。非翻譯的文庫部分包括(a)T7用于文庫體外最佳轉(zhuǎn)錄的T7啟動子，(b)TMV用于完成文庫體外翻譯的煙草花葉病毒翻譯起始序列。MGRGS代表結(jié)構(gòu)性柔性接頭，HHHHHH代表用于對PROfusionTM文庫進行有效親和純化的His6-tag，ARS代表第二個結(jié)構(gòu)性柔性接頭，DANAPK代表第三個結(jié)構(gòu)性柔性接頭，ASAI為優(yōu)化了的與嘌呤霉素受體分子有效結(jié)合的接頭。
該文庫被證明產(chǎn)生針對蛋白靶的高親和力結(jié)合子，該PP26文庫具有兩個主要的優(yōu)點使其成為了親和層析試劑篩選的極好選擇高柔性能夠根據(jù)靶的拓撲學(xué)進行變構(gòu)；結(jié)實由于缺乏保守結(jié)構(gòu)，形成的結(jié)合子可經(jīng)受強烈的生物物理條件。
1.起始寡核苷酸的PCR三個凝膠純化的寡核苷酸被用于構(gòu)建含有兩個隨機環(huán)狀結(jié)構(gòu)的匙羹藤抑甜味肽文庫，用1μM 5’端His-tag引物5′-TAA TAC GACTCA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GGA CGTGGC TCA CAT CAT CAT CAT CAT CAT GCT AGA TCT-3′和1μM 3’端引物5′-AA TTA AAT AGC GGA TGC CTT CGG AGC GTT AGC-3′在Taq多聚酶的作用下，對1nmol的PP26模板(≈約6·1014序列)5′-AGC GGA TGC CTT CGG AGC GTT AGC GTC SNN SNN SNN SNNSNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNNSNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN AGA TCT AGC ATGATG ATG ATG A-3′，進行擴增，經(jīng)過6輪PCR擴增(94℃，1min；65℃，1min；72℃，1min)后，在2％的瓊脂凝膠上進行分析。
2.體外轉(zhuǎn)錄用Promega的RiboMax Express體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，37℃孵育45分鐘后，加入DnaseI繼續(xù)孵育15分鐘，然后用酚/氯仿抽提，過量的NTPs通過NAP-5凝膠(Pharmacia)進行過濾去除。通過6％的TBU凝膠分析來確認RNA的轉(zhuǎn)錄。
3.用化學(xué)方法連接RNA與嘌呤霉素-寡核苷酸接頭純化的RNA被退火(85℃，1分鐘，以0.3℃/秒的速度冷卻到25℃)連接到1.5倍過量的嘌呤霉素-寡核苷酸接頭PEG2A185’-補骨脂內(nèi)酯-UAG CGG AUG C A18(PEG18-9)2CC嘌呤霉素(斜體顯示的核苷酸代表2’-氧-甲基-衍生物，通過紫外光(365nm)在室溫下照射15分鐘完成共價連接。在6％的TBU凝膠上對反應(yīng)產(chǎn)物進行分析來確認反應(yīng)。
4.體外翻譯用Promega的兔網(wǎng)織紅細胞裂解物在15μCi35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmole)存在的條件下對已連接好的RNA進行翻譯，30℃孵育30分鐘后，加入KCl和MgCl2使其終濃度分別為530mM和150mM，在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠上進行分析以確認翻譯。
5.寡-dT純化分子(mRNA-蛋白融合體)通過在孵育緩沖液(100mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA，1mMNaCl和0.25％Triton X-100)中與寡-dT磁珠(Miltenyi)4℃孵育5分鐘進行分離。用MiniMACS-柱(Miltenyi)對PROfusionTM分子進行過濾分離，用孵育緩沖液洗柱并用水進行洗脫。取樣通過4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠分析以確認反應(yīng)。
6.逆轉(zhuǎn)錄在供應(yīng)商推薦的條件下，用SuperScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)，在5倍過量的3’引物存在的條件下進行逆轉(zhuǎn)錄制備相應(yīng)的cDNA，取樣在4-20％Tris/glycine-SDS-PAGE凝膠上進行分析以確認轉(zhuǎn)錄。
7.His-tag純化逆轉(zhuǎn)錄后的PROfusionTM分子在HBS緩沖液(20mM HEPES pH7.0，150mM 0.025％Triton X-100，100μg/ml剪切的鮭精DNA，1mg/ml BSA))中與Ni-NTA-瓊脂糖混合(50μl/PROfusionTM)(QIAGEN)，在室溫下孵育60分鐘并輕輕搖動。然后過濾Ni-NTA，用HBS/5mM咪唑洗滌，并用HBS/150mM咪唑進行洗脫。取樣在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠上進行分析以確認反應(yīng)。每次篩選將用20pmole(≈約1·1013序列)的PROfusionTM分子。
C.靶物質(zhì)的制備在PROfusionTM技術(shù)中，含有多至1013不同PROfusionTM(mRNA-蛋白質(zhì)融合體)分子的高度多樣性的文庫被用來篩選針對所需靶(蛋白、糖類或脂類)的高親和力結(jié)合。在這一過程中，靶物質(zhì)通常被固定到固體相，這些固體相最好是在篩選過程中能夠快速有效地操作且背景低的磁珠。
1.測試靶物質(zhì)的核酸酶活性5μg PRP和0.5μg PT的靶物質(zhì)分別在室溫和4℃與0.12pmole的放射性標記的PROfusiongTM文庫分子共孵育1小時和16小時。孵育完畢用4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠確認PROfusionTM的完整性并進行放射自顯影。未發(fā)現(xiàn)PROfusionTM降解，即表明靶物質(zhì)中不含核酸酶。
2.測試靶物質(zhì)的蛋白酶活性5μg PRP和0.5μg PT的靶物質(zhì)分別在室溫和4℃與1μg的純化的GST-蛋白共孵育1小時和16小時。孵育完畢用4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠確認GST-蛋白的完整性并用考馬氏亮藍染色，未發(fā)現(xiàn)GST-蛋白降解，即表明靶物質(zhì)中不含蛋白酶。
D.PT的固定化1.重配制PT500μl由Aventis Pasteur公司送來的沉淀物(2,26mg/ml)在室溫下經(jīng)21.400xg室溫離心45分鐘，棄去上清，將離心后的沉淀物溶于1100μlCTW緩沖液(0.286gNaHCO3、0.170g Na2CO3，50 Tween-80，加入到50ml MilliQ水中)，為了檢查PT制劑的質(zhì)量，在4-12％BisTris-SDS-PAGE凝膠上對系列稀釋的PT制劑(250ng、500ng、1μg、2.5μg、5μg、15μg)用MES緩沖液中進行電泳，至少有4個代表亞單位S1(28kD)、S2(23kD)、S3(22kD)和S4(11.7kD)條帶被清晰地分離出來。PT復(fù)合物中的最小的蛋白S5(9.3KD)未能顯示，也許在本凝膠系統(tǒng)中，該條帶與只比其略大的S4分不開。
2.連接策略幾種不同的方法被用來將蛋白結(jié)合到磁珠上，主要使用兩個策略其一，靶蛋白的一級氨基和巰基通過形成穩(wěn)定的酰胺鍵或硫醚鍵共價連接到環(huán)氧活化的磁珠(Dynal)上，該反應(yīng)在硫酸銨存在下進行以促進反應(yīng)，通常有很高的靶蛋白連接效果，然而，某些蛋白在這樣的條件下會發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致一個非天然和/或失活了的構(gòu)型連接。其二，靶蛋白的一級氨基和巰基通過共價連接到NHS-酯活化的生物素衍生物(Pierce)上，繼而將該生物素標記的蛋白固定到鏈霉親和素磁珠上(Dynal)。
通常，如果對已知靶物質(zhì)來說條件合適，優(yōu)選將靶蛋白共價連接到環(huán)氧活化的磁珠的方法，因為該方法保證磁珠上只有靶物質(zhì)呈現(xiàn)，在生物素/鏈霉親和素連接的磁珠上還帶有鏈霉親和素，可能會在篩選過程中導(dǎo)致抗鏈霉親和素的結(jié)合子的富集，因此，Phylos建立了一種事前清除ProfusionTM文庫的鏈霉親和素結(jié)合子的方法，以獲得針對已知靶物質(zhì)的高質(zhì)量的結(jié)果?？偟膩碚f，共價連接通常能夠快速富集靶物質(zhì)特異性結(jié)合子。在PT這樣的特殊例子中，最合理的是用共價連接的策略，因為已知與硫酸銨孵育對PT蛋白的官能團無影響。
3.環(huán)氧磁珠(Dynal)的連接條件的優(yōu)化在幾個獨立的實驗中對PT的連接條件進行了優(yōu)化(不同的硫酸銨濃度(0.5-2.0M)和不同的磁珠/靶比率被考查，同時對時間和溫度(2分鐘-16小時；8℃至室溫)的依賴也進行了研究)，觀察到的最好結(jié)果為以下反應(yīng)條件終體積300μl，含100μg PT，3.3×108磁珠，在2ml的Eppendorf管中與終濃度為1M的硫酸銨室溫下孵育2分鐘到60分鐘，孵育完畢，將管放置到磁鐵上4分鐘，使磁珠沉降下來，保留上清做繼后的凝膠分析。磁珠用1ml HEPES-緩沖液(20mMHEPES pH 7.0，150mMNaCl，0.025％TritonX100)洗滌一次，取一等份磁珠(5％的磁珠)在4-12％BisTris-SDS-PAGE凝膠上進行分析，以確定蛋白的連接量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使僅反應(yīng)兩分鐘PT也能夠高效地連接到環(huán)氧磁珠上。
4.PT與環(huán)氧磁珠連接的半制備2.6mg環(huán)氧活化的干磁珠(M-270，Dynal)(～1.7×108磁珠)被重懸于1ml磷酸鹽緩沖液(19mM NaH2PO4，81mMNa2HPO4，pH7.4)中，平衡10分鐘，用新鮮的磷酸鹽緩沖液重復(fù)平衡2次。繼而直接用該磁珠與480pmole重配制好的PT(1μg/μl于CTW緩沖液)在1M硫酸銨(終體積157μl)中進行連接反應(yīng)。經(jīng)過室溫15分鐘連續(xù)振搖孵育后，用300μlHBS緩沖液洗滌磁珠3次，最后將磁珠重懸于240μlHEPES緩沖液中，分裝后4℃保存。在SDS-PAGE凝膠上分析所有洗滌流分、連接反應(yīng)上清和用SDS上樣緩沖液從磁珠上洗下來的PT流分以檢查連接反應(yīng)的效率。
5.環(huán)氧活化的磁珠固定的PT與去唾液酸胎球蛋白結(jié)合的分析40μl的PT-衍生化的磁珠與320pmole去唾液酸胎球蛋白在HEPES緩沖液(20mM HEPES pH7.0，150mM NaCl，0.025％Triton-X100)中室溫孵育1小時(最終反應(yīng)體積為200μl)，用200μl HEPES緩沖液洗滌2-7次，最后重懸于30μlHEPES緩沖液。取50％的磁珠在SDS-PAGE凝膠上進行分析以確認反應(yīng)。
對在4℃貯存1周后的PT-衍生化的磁珠進行測試發(fā)現(xiàn)，其對去唾液酸胎球蛋白的結(jié)合力降低，提示長期貯存會影響其效力。因此，PT-衍生化的磁珠必須在每次篩選時新鮮制備并進行質(zhì)量控制，由于該過程相當費時，所以對取代性的生物素化PT固定策略進行了評價。
6.生物素化PT的半制備通過將配制的0.4mg(～3.65nmol)PT(1μg/μl于CTW緩沖液)與25μgEZ-連接-sulfo-NHS-LC-LC-生物素(PIERCE)在終體積為740μl的50mM HEPES、150mM NaCl、0.2％-X100中孵育，經(jīng)過2小時不間斷搖動冰浴后，加入74μl1M Tris/HCl pH7.0終止生物素化反應(yīng)。繼之在4℃用Slide-a-lyzer盒(PIERCE，3500MWCO 0.5-3ml)將該蛋白置于HEPES緩沖液(20mM HEPES pH7.0，150mM NaCl，0.025％Triton-X100)中透析，去除多余的生物素化試劑，從透析盒中取出生物素化的PT，分裝后于-20℃保存。
7.用BIAcore儀對生物素化PT進行質(zhì)量控制通過BIAcore儀(BIA2000)分析生物素化PT與BIAcore鏈霉親和素芯片的相互作用來對生物素化反應(yīng)進行質(zhì)量控制，也可以檢測去唾液酸胎球蛋白與固定有生物素化PT的芯片的結(jié)合(～400RU結(jié)合到固定的PT的信號；～100RU非特異性結(jié)合到對照細胞)。
F.生物素化PT與鏈霉親和素化磁珠和與去唾液酸胎球蛋白結(jié)合的分析1.生物素化PT與鏈霉親和素化的磁珠的結(jié)合20μl鏈霉親和素化磁珠(Dynal)與20pmole生物素化PT在1xHBS緩沖液中(20mM HEPES pH7.0、150mM NaCl、1mg/ml BSA、100μg/ml鮭精DNA、0.025％Triton-X100)室溫孵育1小時，用HEPES緩沖液(20mM HEPES pH7.0、150mMNaCl、0.025％Triton-X100)洗滌3次，并重懸于16μlSDS凝膠上樣緩沖液中，取8μl在SDS-PAGE凝膠上進行分析確認結(jié)合。在一個同等條件的陰性對照實驗中，游離PT(非生物素化)不與鏈霉親和素化的磁珠相互作用。
2.去唾液酸胎球蛋白與固定有生物素化PT的磁珠的結(jié)合20μl鏈霉親和素磁珠(Dynal)與20pmole生物素化PT在1xHBS緩沖液中室溫孵育1小時，用HEPES緩沖液(20mM HEPES pH7.0、150mMNaCl、0.025％Triton-X100)洗滌4次，繼之，固定有生物素化PT的磁珠與40pmole的去唾液酸胎球蛋白在HEPES緩沖液中室溫孵育1小時，用HEPES緩沖液洗滌磁珠4次后將其重懸于16μlSDS凝膠上樣緩沖液中，取8μl在SDS-PAGE凝膠上進行分析確認結(jié)合。將生物素化的PT和去唾液酸胎球蛋白同時而不是分期與鏈霉親和素化磁珠孵育，也可引起去唾液酸胎球蛋白與生物素化PT的結(jié)合。在對照實驗中證實，去唾液酸胎球蛋白不與鏈霉親和素磁珠非特異性相互作用。對生物素化的PT的類似質(zhì)量控制中看到，-20℃貯存1周后其與鏈霉親和素和/或去唾液酸胎球蛋白的結(jié)合力無明顯降低，因此，生物素化PT在繼后的篩選實驗中被用作標準靶物質(zhì)。
實施例2PT選擇性肽的分離匙羹藤抑甜味肽PROfusionTM文庫和固定化到磁珠的PT在嚴格控制的嚴格性條件下相互接觸，在這樣的條件下，主要允許文庫中與PT有較高親和力的變異體與靶結(jié)合。通過大量洗滌稀釋了那些不需要的非特異性結(jié)合的變異體后，將結(jié)合的PROfusionTM分子從磁珠上洗脫下來，進入新一輪的PROfusionTM生成，正如圖2所示。通過一連串的篩選和再擴增以及對嚴格性條件的適應(yīng)，一組與靶物質(zhì)高特異性結(jié)合的分子群被富集(10)，繼之，該群體的DNA部分被克隆進入大腸桿菌質(zhì)粒載體，分離出的單一變異體通過序列測定進行詳細分析。
用匙羹藤抑甜味肽PROfusionTM文庫進行6輪針對固定化PT的篩選，基于以上所述原因，固定到鏈霉親和素磁珠上的生物素化PT被用于這些篩選(表1)。在第4輪篩選中，觀察到匙羹藤抑甜味肽池與鏈霉親和素磁珠的低背景的結(jié)合，這可能提示磁珠和/或鏈霉親和素結(jié)合匙羹藤抑甜味肽變異體開始富集。所以，在接下來的第5輪中，用靶形式的生物素/鏈霉親和素固定化的PT和環(huán)氧活化磁珠結(jié)合的PT分別進行了篩選，在兩者中均看到有著清晰背景的校正了的靶結(jié)合富集(表1)。在第6輪用生物素/鏈霉親和素固定化的PT進行的篩選中清晰地提示PT結(jié)合變異體的富集(表1)，從而證實了這一趨勢。
A.篩選出的匙羹藤抑甜味肽結(jié)合池的克隆用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將從R4、R5、R6輪篩選出的匙羹藤抑甜味肽DNA池克隆進入pCR2.1-TOPO-載體中。匙羹藤抑甜味肽DNA在不同濃度下與pCR2.1-TOPO-載體連接，對6μl的反應(yīng)物，分別使用0.5μl、2μl和4μl的匙羹藤抑甜味肽池DNA，反應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商提供的方法進行。
2μl這些連接產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化入20μl大腸桿菌Top 10F’感受態(tài)細胞(Invitrogen)，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的LB培養(yǎng)皿上，從各轉(zhuǎn)化中挑選150個單個菌落轉(zhuǎn)種到含有50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的主培養(yǎng)皿上，抑制T7依賴的蛋白表達；同時也轉(zhuǎn)種到另一個含有X-Gal和IPTG的平皿上用于藍、白菌落篩選。對于各轉(zhuǎn)化，來自抑制的主平皿上的96個對應(yīng)于藍白菌落測試的白色菌落的菌落被用于接種96孔LB瓊脂板和500μl液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的LB)中，96孔瓊脂板送外進行商業(yè)測序，液體培養(yǎng)物與500μl 40％的甘油混合，在液氮下冷凍后貯存于-80℃。
從各個克隆提取質(zhì)粒DNA，用一個M13引物5’-TGT AAA ACGACG GCC AGT-3’進行自動DNA測序。如圖3-8所示，單一序列的匙羹藤抑甜味肽變異體在第4輪篩選中開始富集，第6輪后單一序列占總序列的90％以上，這清楚地表明該變異體可能是對PT結(jié)合力最強的變異體。除了這一最主要的序列變異體外，許多其他部分具有共同基序的匙羹藤抑甜味肽序列也被富集，這一發(fā)現(xiàn)提示這些其他序列對PT也有結(jié)合力。
B.針對固定化的PT的PP26篩選與針對固定化的PT的6輪匙羹藤抑甜味肽篩選相平行，同時進行了對PP26 PROfusionTM文庫的篩選，固定有生物素化的PT的鏈霉親和素磁珠在篩選中被使用(表2)，在第4輪篩選中，觀察到匙羹藤抑甜味肽池與鏈霉親和素磁珠的低背景的結(jié)合，這可能提示磁珠和/或鏈霉親和素結(jié)合PP26變異體開始富集。所以，在接下來的第5輪中，篩選一方面用生物素/鏈霉親和素固定化的PT作為靶物質(zhì)進行，另一方面用環(huán)氧活化磁珠結(jié)合的PT進行，在兩者中均看到有著清晰背景的校正了的靶結(jié)合富集(表2)。在第6輪用生物素/鏈霉親和素固定化的PT進行的篩選中證實了這一趨勢，清晰地提示PT結(jié)合變異體的富集(表2)。
C.篩選出的PP26結(jié)合子池的克隆用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將從R4、R5、R6輪篩選出的PP26DNA池克隆進入pCR2.1-TOPO-載體中。不同濃度PP26 DNA與pCR2.1-TOPO-載體連接，對6μl的反應(yīng)物，分別使用0.5μl、2μl和4μl的匙羹藤抑甜味肽池DNA，反應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商提供的方法進行。2μl這些連接產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化入20μl大腸桿菌Top 10F’感受態(tài)細胞(Invitrogen)，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的LB培養(yǎng)皿上，從各轉(zhuǎn)化中挑選150個單個菌落轉(zhuǎn)種到含有50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的主培養(yǎng)皿上，抑制T7依賴的蛋白表達，同時將其轉(zhuǎn)種到另一個含有X-Gal和IPTG的平皿上用于藍、白菌落篩選。對于各轉(zhuǎn)化，來自抑制的主平皿上的96個對應(yīng)于藍白菌落測試的白色菌落的菌落被用于接種96孔LB瓊脂板和500μl液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的LB)中，96孔瓊脂板送外進行商業(yè)測序，液體培養(yǎng)物與500μl40％的甘油混合，在液氮下冷凍后貯存于-80℃。
D.各單一結(jié)合變異體的序列測定從各個克隆提取質(zhì)粒DNA，用一個M13引物5’-TGT AAA ACGACG GCC AGT-3’進行自動DNA測序。如9-14所示，在輪番篩選中，兩個主要變異體被富集，它們都具有一個共同的保守序列基序。這一發(fā)現(xiàn)提示普遍認為的該保守氨基酸的側(cè)鏈與某些PT表面區(qū)域建立有相互直接作用的關(guān)系。此外，至少4個其他變異體也被低程度的富集。由于這些變異體不含有以上提到的保守的序列基序，可以得出結(jié)論這些變異體可能與PT表面的不同區(qū)域結(jié)合。
E.篩選出的PT結(jié)合匙羹藤抑甜味肽和PP26變異體的確認由于篩選時用PROfusionTM分子-mRNA-肽融合體，有必要在篩選后的第一步分析測試游離肽對靶的結(jié)合力，在下一步驟中，那些已經(jīng)確認通過肽而不是核酸與靶結(jié)合的變異體在AP加工液體存在的條件下進行特異性測試，通過這一過程，那些最適合AP過程的肽應(yīng)該能被確認。
1.測試游離肽對PT的結(jié)合力單個富集的匙羹藤抑甜味肽和PP26結(jié)合變異體的游離肽的定性結(jié)合試驗用TNT T7偶聯(lián)的Reticolocyte Lysat System(Promega #5540)進行，方法如下，通過克隆PCR將單一候選結(jié)合子DNA從結(jié)合子克隆的甘油菌種中擴增出來，為避免PCR過程中的突變，使用了校正性的多聚酶(Pwo)，PCR產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠上進行分析，根據(jù)供應(yīng)商的說明，在53μl終反應(yīng)體積內(nèi)，5.0μlPCR產(chǎn)物被用作模板通過TNT系統(tǒng)用于偶連的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)。表達出的候選結(jié)合子繼而用Ni-NTA鰲合層析(QIAGEN)進行純化。放射性標記的His-tag純化的候選結(jié)合子(各肽～40-70fmol)與固定于鏈霉親和素磁珠的生物素化的PT在室溫下孵育1小時，磁珠用HBS緩沖液洗滌3次，重懸于水中并進行液體閃爍計數(shù)分析。對照實驗候選結(jié)合子只與鏈霉親和素磁珠(無PT)孵育。PP26結(jié)合匙羹藤抑甜味肽的最佳候選結(jié)合子(表3和表4)被確認，并用于以下的特異性測試。
2.在有加工液體存在的條件下對匙羹藤抑甜味肽和PP26變異體的特異性測試為了進行游離匙羹藤抑甜味肽和PP26肽的半定量結(jié)合和特異性檢測，在有Aventis Pasteur加工液存在的條件下肽首先被生成PROfusionTM形式，再進行純化，然后用S1核酸酶消化成游離肽。為了擴增出足夠量的篩選出的結(jié)合子變異體的DNA(10個匙羹藤抑甜味肽克隆和7個PP26克隆)，用TNT表達的PCR產(chǎn)物作為模板進行PCR擴增(94℃，30秒；60℃30秒；72℃，30秒)，10個循環(huán)后，取樣在2％的瓊脂糖凝膠上進行分析。用RiboMax Express體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將dsDNA(PCR產(chǎn)物)轉(zhuǎn)錄成RNA，37℃孵育45分鐘后，加入DnaseI37℃繼續(xù)孵育15分鐘，用酚/氯仿抽提該混合物，過量的NTPs用NAP-5凝膠過濾(Pharmacia)去除，用6％的TBU凝膠對RNA進行分析。
純化的RNA被退火(85℃，1分鐘，以0.3℃/秒的速度冷卻到25℃)連接到1.5倍過量的嘌呤霉素-寡核苷酸接頭PEG2A185’-補骨脂內(nèi)酯-UAG CGG AUG C A18(PEG18-9)2CC嘌呤霉素(斜體顯示的核苷酸代表2’-氧-甲基-衍生物，通過紫外光(365nm)在室溫下照射15分鐘完成共價連接。在6％的TBU凝膠上對反應(yīng)產(chǎn)物進行分析來確認反應(yīng)。用Promega的兔網(wǎng)織紅細胞裂解物在15μCi35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmole)存在的條件下對已連接好的RNA進行翻譯，30℃孵育30分鐘后，加入KCl和MgCl2使其終濃度分別為530mM和150mM，取樣用4-20％的Tris/甘氨酸-SDS-PAGE進行分析。mRNA-蛋白融合體(PROfusionTM)通過在孵育緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，1mMNaCl，0.25％Triton X-100)中與寡-dT磁珠(Miltenyi)4℃孵育5分鐘進行分離。PROfusionTM分子用MiniMACS-柱(Miltenyi)進行過濾分離，用孵育緩沖液洗柱并用水進行洗脫。取樣在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝膠上進行分析。
為了去除mRNA-蛋白融合體的mRNA部分，根據(jù)供應(yīng)商提供的方法，用S1核酸酶消化經(jīng)寡dT純化的分子(S1核酸酶切除嘌呤霉素接頭的DNA部分)，S1酶消化前后的PROfusionTM分子在4-12％的Bis/Tris SDS-PAGE凝膠上進行分析。鏈霉親和素化磁珠(M280 Dynal)用HBS洗滌，4℃孵育過夜。生物素化PT(900pmole)與900μl鏈霉親和素磁珠(已用HBS緩沖液封閉)在室溫下孵育1小時。固定化PT后，磁珠用生物素(HBS配制的2mM生物素)封閉1分鐘，立即用HBS緩沖液洗滌4次以去除生物素殘留。用同樣的方法封閉對照磁珠(無PT)。
為了分析篩選出來的肽的結(jié)合，設(shè)立了幾個平行反應(yīng)，如陰性對照僅為生物素封閉的鏈霉親和素磁珠；陽性對照為固定有PT的鏈霉親和素磁珠；背景對照為生物素封閉的磁珠與1/4體積的AventisPasteur樣品溶液C(流過1.AF柱)；PT與1/4體積的Aventis Pasteur樣品溶液C的混合物；背景對照與生物素封閉的磁珠與1/4體積的Aventis Pasteur樣品溶液E(培養(yǎng)基)；PT與1/4體積的Aventis Pasteur樣品溶液E的混合物；反應(yīng)3-6用于觀察在Aventis Pasteur提供的樣品存在的條件下，篩選出的肽與PT的特異性結(jié)合能力。結(jié)合反應(yīng)在有蛋白酶抑制劑混合物存在的條件下室溫進行1小時(完全miniTMROCHE)，以避免肽的降解。將磁珠用HBS溶液洗滌后用閃爍計數(shù)進行分析。
正如表3所示，10個受試的匙羹藤抑甜味肽變異體中的3個(#9、10、19)顯示了PT的靶結(jié)合，且不受任何AP加工液體的影響。這些變異體為最有前景的用于AP加工流程的親和層析的候選者。
正如表4所示，7個受試的PP26變異體中的3個(#5、6、9)顯示了對PT的靶結(jié)合，且不被AP加工液減少。這些變異體為最有前景的用于AP加工流程的親和層析的候選者。
表3
匙羹藤抑甜味肽-變異體*的篩選后分析
*試驗1代表游離肽的靶結(jié)合能力(0)，試驗2代表在有AP加工液存在的條件下變異體結(jié)合的特異性(0)。在兩個試驗中均呈陽性的有9、10和19。
表4PP26-變異體*的篩選后分析
*試驗1代表游離肽的靶結(jié)合能力(0)，試驗2代表在有AP加工液存在的條件下變異體結(jié)合的特異性(0)。在兩個試驗中均呈陽性的有5、6和9。
F.通過化學(xué)合成的方法制備肽8個N末端有生物素標記的肽由化學(xué)方法合成，該生物素基團通過一個短的親水接頭(PGE2＝8-氨基-3，6-二氧雜辛酸)隔開。這8個肽中的兩個(PP26-5c和匙羹藤抑甜味肽-9c)還另外合成了C末端帶有生物素化的肽形式(通過一個附加的C末端賴氨酸)。肽根據(jù)Sheppard用Fmoc/But策略自動合成，用HPLC純化后凍干。純化出來的所有肽的質(zhì)量都用質(zhì)譜儀進行確定。合成的各個肽的目標量為5mg純化肽。純化后的合成肽的量和純度在表5中顯示。
表5百日咳毒素結(jié)合肽*的肽合成
*克隆名字內(nèi)的簡寫c表示C末端生物素標記肽，簡寫n表示N末端生物素標記肽。gurmarin表示匙羹藤抑甜味肽。
所有pp26肽溶解于100mM HEPES，pH7.4，200mM NaCl中，終濃度為100μM。所有匙羹藤抑甜味肽溶解于100mM HEPES pH7.4，200mM NaCl、2mM GSH、1mM GSSG中，終濃度為100μM，繼之于氮氣中孵育至少48小時以使其進行結(jié)構(gòu)折疊。
G.通過細菌表達的肽制備被確認為百日咳毒素結(jié)合子的肽被亞克隆進谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)框架內(nèi)用細菌進行表達。GST標記加強了肽的可溶性并且允許用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠來純化。被加入的特異性PreScissionTM蛋白酶識別的基因工程酶切位點使GST-標記物能夠被除去而釋放出肽。PreScissionTM蛋白酶本身是一種GST與14型人鼻病毒(HRV)的融合蛋白，特異性地識別Leu-Phe-Gln*Gly-Pro序列，并在Gln和Gly殘基間進行切割。切割反應(yīng)后，可以用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠從切割反應(yīng)物中去除未被切割的產(chǎn)物和蛋白酶。
H.表達載體的構(gòu)建1.PP26變異體的GST融合體的構(gòu)建作為PCR模板的pCR2.1載體含有被確認的對PT的pp26結(jié)合子的序列，用寡核苷酸#467(5’-CATGCCATGGGACGTGGCTCACATCATC-3’)和#468(5’-磷酸化的GGGTTAAATAGCGGATGCCTTCGGAGCGTTAGCGTC-3’)及PwoDNA多聚酶(Roche)進行PCR，其產(chǎn)物用NcoI(New EnglandBiolobs)進行消化，一個改造過的載體(pGEX6P(Amersham/Pharmacia)含有一個附加的NcoI位點)用NcoI/SmaI(New England Biolobs)進行酶切，PCR產(chǎn)物被直接克隆進該載體的NcoI/SmaI位點。在轉(zhuǎn)化進TOP10(Invitrogen)后，用菌落PCP鑒別陽性克隆，再用測序進行確認。
2.匙羹藤抑甜味肽-變異體與GST融合體的構(gòu)建作為PCR模板的pCR2.1載體含有被確認的PT的匙羹藤抑甜味肽結(jié)合子的序列，用寡核苷酸#464(5’-GGAGATCTCATATGCACCATCACCATCACCATAGTGGC-3’)和#465(5’-磷酸化的GGGTTAAATAGCGGATGCTACTAGGC-3’)及PwoDNA多聚酶(Roche)進行PCR，其產(chǎn)物用NdeI(New EnglandBiolobs)進行消化，一個改造過的載體(pGEX6P(Amersham/Pharmacia)含有一個附加的NcoI位點)用NdeI/SmaI(New England Biolobs)進行酶切，PCR產(chǎn)物被直接克隆進該載體的NcoI/SmaI位點。在轉(zhuǎn)化TOP10(Invitrogen)后，在轉(zhuǎn)化TOP10(Invitrogen)后，用菌落PCR鑒別陽性克隆，再用測序進行確認(表6)。
表6用于細菌表達的載體
3.GST-pp26融合體的表達和純化細菌株Rosetta(DE3)pLysS(Novagen)用質(zhì)粒DNA(見表)轉(zhuǎn)化，該pp26變異體的轉(zhuǎn)化子在37℃ 250rpm生長至OD600約等于0.5時，加入1mM IPTG進行4小時誘導(dǎo)。對于匙羹藤抑甜味肽-GST融合體，誘導(dǎo)條件為0.33mM IPTG 2.5小時。收獲細菌后，細胞被重懸于含有1mM 2-巰基乙醇、蛋白酶抑制劑和1mM溶菌酶的PBS-KMT(10mM磷酸鈉，pH7.5、130mM NaCl、3mM KCl、1mM MgCl2、0.1％Tween-20)中，室溫孵育30分鐘后用超聲法破碎細菌。離心后將可溶性上清轉(zhuǎn)入GSH瓊脂糖凝膠柱上進行純化，用10倍柱體積的20mM的Hepes，pH7.5，15mM NaCl洗柱，GST融合蛋白用20mM GSH洗脫，并在SDS凝膠上分析以確定表達。
4.PreScissionTM蛋白酶切除GST-tag而生成肽PreScissionTM蛋白酶從GST-肽融合體上切割肽的例子如下，GST-tag通過與PreScissionTM蛋白酶孵育(Amersham Pharmacia)切除2.5mg融合蛋白與160U PreScissionTM孵育，在封閉的含有結(jié)合的GST融合蛋白的GSTrap FF柱5℃消化16小時。經(jīng)過過夜孵育后，第二個GSTrap FF柱被連接上以去除GST-標記的蛋白酶PreScissionTM。以0.2ml的流速上樣，流出液以小分裝量進行樣品收集后在SDS凝膠上電泳，肽含量通過測定OD280計算(約700μg)。
實施例3
PT的親和層析A.在變性凝膠上分析發(fā)酵上清兩種加工液被考慮用做親和層析過程的起始物樣品A濃縮的培養(yǎng)過濾物，含10-50μg/ml(～0.09-0.45μM)粗PT，發(fā)酵上清樣品B含9-45μg/ml(～0.08-0.4μM)粗PT的吸附層析上清為了了解這些加工液的復(fù)雜成分，兩種樣品均用變性聚丙烯酰胺凝膠進行了電泳，樣品A中的主要高分子量成分通過吸附層析后被去除(樣品B)。
B.將合成的生物素化核心肽固定化到鏈霉親和素瓊脂糖上并證明與純化后的PT結(jié)合1.肽固定到鏈霉親和素瓊脂糖凝膠為了使生物素化肽與鏈霉親和素瓊脂糖凝膠(Amersham HighPerFormance 71-5004-40)結(jié)合，200μl 50％的經(jīng)過洗滌的鏈霉親和素瓊脂糖凝膠勻漿與1nmole的肽(100μM肽溶液的10μl)在1ml HEPES緩沖液中(20mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，0.025％TritonX-100)4℃孵育，在該種使用條件下，高結(jié)合力的鏈霉親和素瓊脂糖凝膠應(yīng)該能使100％的生物素化肽(10pmole 肽/μl包裝的瓊脂糖凝膠)固定化。
2.純化的PT結(jié)合到固定化的肽200μl結(jié)合有肽的瓊脂糖凝膠(10％ige勻漿，含約～200pmol固定化肽)被轉(zhuǎn)移到Mobicol柱(MoBitec 10μM濾器)，2000rpm離心1分鐘去除上清，用HEPES緩沖液洗滌4次后，瓊脂糖凝膠被重懸于含有100pmol的純化了的百日咳毒素的200μl HEPES緩沖液中，在轉(zhuǎn)輪上室溫孵育1小時。未結(jié)合的組分通過離心分離(結(jié)合后的上清，用于凝膠分析)，繼之，肽-鏈霉親和素瓊脂糖凝膠用冷HEPES緩沖液洗滌3次(各200μl)，重懸于20μl上樣緩沖液中(30mM Tris，pH6.8，1％SDS，1％-β-巰基乙醇，12.5％甘油，0.005％溴酚藍)洗脫結(jié)合的PT，經(jīng)過95℃5分鐘孵育，離心收集上樣緩沖液，繼而用于凝膠分析(圖15)。作為對照，不帶肽的鏈霉親和素瓊脂糖凝膠在同等條件下與PT結(jié)合，在本使用條件下，百日咳毒素肽結(jié)合子克隆pp26 5n、5c、9n、15n和匙羹藤抑甜味肽克隆10n、19n、15n、9n清晰地顯示出與純化的PT結(jié)合，所有陽性候選結(jié)合子都能與完整的六聚體PT結(jié)合。
C.將合成的生物素核心肽固定到鏈酶親和素瓊脂糖凝膠并證實其與發(fā)酵上清中的PT結(jié)合肽固定到鏈酶親和素瓊脂糖凝膠并結(jié)合到發(fā)酵上清中的PT的分析用0章中描述的方法進行，但不同的是肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠與200μl樣品A(發(fā)酵液上清)或與200μl樣品B(吸附層析上清柱，見0章)孵育，繼之用HEPES緩沖液室溫洗滌4次。結(jié)合分析的結(jié)果見圖16。在該使用條件下，百日咳毒素pp26結(jié)合子克隆9n、15n和匙羹藤抑甜味肽克隆9n、15n能夠非常有效地與發(fā)酵上清樣品A和樣品B中的完整PT六聚體結(jié)合，注意在該使用條件下，pp26結(jié)合子克隆5和匙羹藤抑甜味肽結(jié)合子克隆10和19可能與PT的結(jié)合力較低，雖然在該使用條件下，未見PT與樣品A和樣品B中的這些肽結(jié)合，這些結(jié)合子可能仍然可以用作親和層析柱的配體(柱子通過再結(jié)合效應(yīng)允許保留PT，這樣可以將Koff值問題降到最低)。
D.固定化肽的熱動力數(shù)據(jù)為了估計肽的結(jié)合力，20pmol的瓊脂糖固定的肽與過量的100pmolPT在200μl HEPES緩沖液(相當于500nM PT)中孵育。經(jīng)洗滌后，肽-鏈霉親和素瓊脂糖凝膠結(jié)合PT組分通過凝膠進行定量，這可以直接計算在該使用條件下(推測PT/肽結(jié)合比率為1∶1)的結(jié)合活性肽的組分。經(jīng)推測，500nM PT的濃度已足以達到與所有肽的Bmax，分析結(jié)果在表7中顯示。這里顯示的數(shù)值是對這些肽的預(yù)期結(jié)合能力的估計值。對最合適的結(jié)合子的結(jié)合能力(Bmax)和解離常數(shù)(KD)的確切評估也可以進行。
表7在該使用條件下的結(jié)合活性肽的組分一覽
1表示計算困難，因為信號接近能檢測到的低限。
E.純化的百日咳毒素六聚體在已知緩沖液條件下(pH，鹽濃度、去污劑)的穩(wěn)定性分析，用可接受的質(zhì)量等級的原材料對照衛(wèi)生當局的要求進行在一個廣泛的pH和鹽條件的范圍內(nèi)，用BIAcore2000儀檢測百日咳毒素六聚體的穩(wěn)定性。為了這一目的，生物素化PT的～2000RU被上樣到鏈霉親和素芯片上，繼之，不同的緩沖液以30μl/分鐘的流速加入固定有PT的芯片2分鐘，各緩沖液注射完畢后，芯片用HBS/EP電泳緩沖液(0.01MHEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨酯20(v/v)進行平衡，流速30μl/分鐘至少2分鐘)。緩沖液注入前和后測到的RU信號的變化與芯片上的PT六聚體的降低相關(guān)。這種降低被解釋為在該緩沖液條件下PT六聚體的穩(wěn)定性的喪失。
分析的PH范圍為pH2-10.5，用以下緩沖液進行10mM甘氨酸緩沖液(BIAcore，pH2、2.5、3)，10mM醋酸緩鹽沖液(BIAcore，pH4、4.5、5、5.5)，和100mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6、10.5)。產(chǎn)生的BIAcore傳感圖顯示了pH對PT六聚體穩(wěn)定性的影響，BIAcore分析的結(jié)果總結(jié)于表8中。在該使用條件下，百日咳毒素六聚體在pH2.5到10.5的寬泛范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。
表8在不同pH條件下百日咳六聚體的穩(wěn)定性
通過對比實驗，用BIAcore 2000儀分別對pH 5.0(10mM醋酸鹽緩沖液)和pH 8.5(50mM Tris/HCl)條件下不同濃度的NaCl、KCl和MgCl2對PT六聚體的穩(wěn)定性的影響進行了研究。在該使用條件下鹽濃度對PT六聚體的影響在表9中顯示。在含高達2.5M NaCl或高達2M KCl的緩沖液(pH5和8.5)中，六聚體是穩(wěn)定的。對MgCl2來說，PT六聚體在含高達2M MgCl2的緩沖液中是穩(wěn)定的。
表9在不同鹽條件下百日咳毒素六聚體的穩(wěn)定性
F.從發(fā)酵上清中特異性親和純化PT的洗滌和洗脫條件(pH、鹽濃度、去污劑)的建立在確定百日咳六聚體在什么條件下穩(wěn)定后，下一步即是研究百日咳毒素結(jié)合到固定化的肽pp26克隆9和15和匙羹藤抑甜味肽克隆9和15的洗滌和洗脫條件1.用BIAcore2000儀評價PT/肽穩(wěn)定性在已知不會影響PT六聚體穩(wěn)定性的不同的pH和鹽條件下，用BIAcore 2000儀測定PT/肽復(fù)合物穩(wěn)定性。500-1000RU的合成肽被固定到鏈霉親和素芯片上，為了使PT結(jié)合到固定的肽上，20nM在HEPES中的純化PT在1分鐘內(nèi)注入。用HBS/Ep電泳緩沖液(0.01MHEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％聚山梨酯20(v/v))平衡后，PT/肽復(fù)合物通過注入以下液體洗滌。
(a)100mM碳酸鹽緩沖液pH 10.5和9.5(b)10mM醋酸鹽緩沖液pH 5.5，5.0，4.5和4.0(c)10mM甘氨酸緩沖液pH 3.0和2.5(d)含0.5、1.0、1.5、2.0M NaCl的10mM醋酸鹽緩沖液pH 6.0，(e)含0.5、1.0、1.5、2.0M NaCl的50mMTris/HCl緩沖液，pH8.5，(f)含0.5、1.0、1.5、2.0M KCl的10mM醋酸鹽緩沖液pH 6.0，
(g)含0.5、1.0、1.5、2.0M KCl的50mM Tris/HCl緩沖液，pH8.5，(h)含0.5、1.0、1.5、2.0M NaCl的10mM醋酸鹽緩沖液，pH 6.0，(i)含0.5、1.0、1.5、2.0M NaCl的50mM Tris/HCl緩沖液，pH8.5.
在各種緩沖液注入完畢后，用BBS/Ep電泳緩沖液平衡芯片，在該使用緩沖液條件下(注射前后測定RU信號的不同)芯片上PT六聚體的喪失反應(yīng)出PT/肽復(fù)合物的穩(wěn)定性。所有PT/肽復(fù)合物的pH穩(wěn)定范圍和鹽穩(wěn)定范圍總結(jié)于表10中。所有PT/肽復(fù)合物在100mM碳酸鹽pH10.5和10mM甘氨酸pH2.5的條件下完全不穩(wěn)定。對于匙羹藤抑甜味肽9，含有2.5M NaCl或至少0.5M MgCl2的緩沖液會干擾PT/肽復(fù)合物的穩(wěn)定性。PT與匙羹藤抑甜味肽15的復(fù)合物在至少1.5MMgCl2的50mM Tris/HCl緩沖液(pH8.5)存在下尤其不穩(wěn)定。
表10不同pH和鹽條件對PT/肽復(fù)合物的影響效應(yīng)
2.評估純化肽鏈霉親和素瓊脂糖上的PT的洗滌條件使用的洗滌條件盡可能與已建立的用于純化去唾液酸胎球蛋白的百日咳毒素的條件近似(用50mM Tris/HCl pH7.5洗滌，加或不加1M NaCl)，對肽pp26克隆9和15及匙羹藤抑甜味肽克隆9和15的百日咳毒素的純化方法進行了優(yōu)化，200pmol的各種肽固定于20μl的瓊脂糖凝膠與100μl的50mM Tris/HCl pH7.5和100μl的樣品A或樣品B孵育，使其與PT結(jié)合，繼而用以下3種不同的洗滌條件對結(jié)合了PT的瓊脂糖肽組分進行洗滌(a)200μl 50mM Tris/HCl pH7.5洗滌3次(b)200μl 50mM醋酸鹽 pH6.0洗滌3次(c)200μl 50mM醋酸鹽 pH6.0洗滌6次洗滌后，用20μl上樣緩沖液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巰基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚藍)將殘留在瓊脂糖凝膠上的物質(zhì)洗脫下來，所有洗脫物在12％的Bis-Tris-凝膠(MES電泳緩沖液)電泳并銀染顯色進行分析(圖17)。
用50mM醋酸鹽pH6.0洗滌比用50mM Tris/HCl pH7.5更嚴格，對于減少高分子雜質(zhì)背景更有效。但在這樣的洗滌條件下PT/肽復(fù)合物不太穩(wěn)定，特別是匙羹藤抑甜味肽9用150mM醋酸鹽pH6.0(洗滌6次)時。與50mM Tris/HCl pH7.5相比，用50mM醋酸鹽pH6.0重復(fù)洗滌10至20次后，固定有PT的肽的喪失更加突出(以pp26肽9為例于圖18中顯示)。
3.評估肽鏈霉親和素瓊脂糖上PT的純化的洗脫條件在與六聚體穩(wěn)定性相容的條件下測試從肽瓊脂糖凝膠上洗脫PT。
a.通過MgCl2進行洗脫正如以上BIAcore2000測定所示，所有PT/肽復(fù)合物對2M的MgCl2是敏感的，但PT六聚體的穩(wěn)定性并不受其太大影響。一定濃度的MgCl2對通過固定化的4個合成肽之一結(jié)合于鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上的PT的洗脫效率進行了評估。被固定化到20μl瓊脂糖凝膠上的400pmol各種肽與100μl50mM Tris/HCl pH7.5和100μl樣品A孵育使其與PT結(jié)合。在用50mM Tris/HCl pH7.5(每次200μl)洗滌4次后，結(jié)合了PT的組分用連續(xù)的3次20μl下列溶液洗脫(a)含0.2M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，或(b)含0.5M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，或(c)含1.0M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，或(d)含1.5M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，或(e)含2.0M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，殘留的物質(zhì)隨后用20μl上樣緩沖液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巰基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚藍)洗脫。所有洗脫液在12％的Bis-Tris-Gels(MES電泳緩沖液)電泳并銀染顯色進行分析(圖19)。正如實驗所示，用MgCl2進行洗脫對匙羹藤抑甜味肽比pp26肽更為有效，盡管大量的PT仍然滯留在肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上。
b.通過改變pH進行洗脫BIAcore測定顯示PT可以在對PT六聚體的穩(wěn)定性無嚴重影響的酸性(pH2.5)或堿性(pH10.5洗脫)緩沖條件下從所有肽中洗脫(50mM甘氨酸，pH2.5較100mM碳酸鹽pH10.5緩沖液對PT六聚體更溫和，見xxx)。各種200pmol固定于20μl瓊脂糖凝膠的肽與100μl 50mMTris/HCl pH7.5和100μl樣品A孵育，使其與PT結(jié)合。在用50mMTris/HCl pH7.5(每次200μl)洗滌4次后，連續(xù)3次用40μl 50mM甘氨酸pH2.5或100mM碳酸鹽pH10.5緩沖液從肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上洗脫PT。殘留的物質(zhì)隨后用20μl上樣緩沖液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巰基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚藍)從肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上洗脫。所有洗脫液通過PAGE在12％的Bis-Tris-Gels(MES電泳緩沖液)電泳并銀染顯色進行分析(圖20)。使用50mM甘氨酸pH2.5以及100mM碳酸鹽緩pH10.5緩沖液，幾乎所有的PT都能從肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上洗脫下來。
4.將優(yōu)化后的條件用于小規(guī)模純化方案，確認結(jié)合力
a.在優(yōu)化后的洗滌和洗脫條件下從樣品B中純化PT(4μl柱)優(yōu)化后的洗滌和洗脫條件結(jié)合在一起用于從樣品B中純化肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上的PT。為了降低PT的非特異性結(jié)合，先前就對各種肽的肽與鏈霉親和素瓊脂糖凝膠的比率進行了優(yōu)化，繼之，根據(jù)PT的高收率與預(yù)測的每肽的高(適中)投入之比對樣品B與肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠比率也進行了優(yōu)化，這些條件被用于以下小規(guī)模柱純化。
對于pp26肽9和匙羹藤抑甜味肽15，用16μl鏈霉親和素瓊脂糖凝膠與1600pmol肽孵育將其固定于鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上，對pp26肽15，16μl鏈霉親和素瓊脂糖凝膠與6000pmol肽(pp26/15與鏈霉親和素瓊脂糖凝膠結(jié)合效率較低，可能是因為肽生物素化不完全)孵育，對匙羹藤抑甜味肽9，8000pmol被固定到80μl鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上，繼之，洗過的肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠被均分到4個Mobilcom柱(用10μM濾器)。
各柱(含4μl帶有400pmol的pp26/9和gur/15瓊脂糖凝膠；4μl帶有不定量的結(jié)合肽pp26/15；20μl帶有2000pmol的肽gur/9)與400μl樣品B(加入HCl調(diào)節(jié)pH7.0-7.5)孵育使其與PT結(jié)合。用50mMTris/HCl pH7.5(每次100μl)洗滌5次后，PT從肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠通過連續(xù)洗脫被洗脫下來(pp26/9和gur/15洗脫3次，pp26/15和gur/19洗脫4次)，洗脫液如下(a)1號柱用50mM甘氨酸pH2.5(每次20μl)，或(b)2號柱用100mM碳酸鹽緩沖液pH10.5(每次20μl)，或(c)3號柱用含2M MgCl2的50mMTris，pH10.5(每次20μl)1-3號柱和4號柱的殘留物質(zhì)用上樣緩沖液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巰基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚藍)從肽鏈霉親和素瓊脂糖上洗脫。所有洗脫液通過PAGE在12％的Bis-Tris-Gels(MES電泳緩沖液)電泳并銀染顯色進行分析(圖21、22)。為了計算從肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上純化得到的PT產(chǎn)率，將洗脫液1-3合并后用PAGE凝膠電泳并銀染，然后對比同一凝膠上的已知量的PT來進行估計(圖21B和22B)。根據(jù)凝膠估計值，純化的PT產(chǎn)率在表11中顯示。
表11用pp26肽9或匙羹藤抑甜味肽15作為親和配體小規(guī)模純化樣品B后百日咳毒素的產(chǎn)率計算
根據(jù)PT相關(guān)的資料，預(yù)計的樣品B的PT濃度為9-45μg/ml，相應(yīng)于0.8-0.41pmol/μl。根據(jù)下式計算400μl的樣品B×0.41pmol/μl＝164pmol投入PT
b.用不同肽密度的鏈霉親和素瓊脂糖凝膠進行親和純化確定PT產(chǎn)量在不同濃度的固定有鏈霉親和素瓊脂糖凝膠作為親和配體的肽的條件下對PT與肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠的結(jié)合進行了研究，1μl鏈霉親和素瓊脂糖凝膠與遞增量的pp26/9肽或匙羹藤抑甜味肽/15(100、200、300、400、500、1000pmol)進行孵育以固定化。未結(jié)合的肽組分通過用50mM Tris/HCl pH7.5洗滌(柱上)3次從瓊脂糖凝膠上去除。繼而，各種肽鏈霉親和素基質(zhì)與600μl樣品A孵育以結(jié)合PT。80分鐘后各種基質(zhì)用50mM Tris/HCl pH7.5洗滌4次(每次200μl)，隨后用20μl凝膠上樣緩沖液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巰基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚藍)95℃孵育10分鐘進行洗脫，洗脫液通過PAGE用12％的Bis-Tris-Gels(MES電泳緩沖液)電泳并銀染顯色進行分析(圖23)。結(jié)合到肽鏈霉親和素瓊脂糖凝膠的PT的量通過密度測量進行評估并將其繪制為用于固定到鏈霉親和素瓊脂糖凝膠的肽起始用量的函數(shù)(圖23顯示pp26/9的情況)。當300-400pmol肽用于固定到1μl鏈霉親和素瓊脂糖凝膠時，PT的結(jié)合達到最大。肽量繼續(xù)增加，PT的結(jié)合不隨之增高，這可能反應(yīng)了PT的立體阻礙效應(yīng)。
用上樣緩沖液洗脫(95℃加熱10分鐘)后，通過PAGE用12％的Bis-Tris-Gels(MES電泳緩沖液)進行電泳并銀染顯色，評估了400pmol肽用于固定到1μl鏈霉親和素時肽(pp26/9或匙羹藤抑甜味肽/15)的有效結(jié)合組分，洗脫的肽量直接與同一凝膠上的已知量的純化的PT進行比較來估計(數(shù)據(jù)未顯示)pp29/9100-150pmol；匙羹藤抑甜味肽/1550pmol。
c.用不同量的樣品B在恒定濃度的肽瓊脂糖凝膠進行親和純化時確定PT產(chǎn)率用400pmol pp26/9或匙羹藤抑甜味肽/15與1μl鏈霉親和素瓊脂糖凝膠室溫孵育1小時以使肽固定，用200μl50mM Tris/HCl pH7.5洗滌肽瓊脂糖凝膠3次，繼之與不同量的樣品B(50、66、100、200、400、600μl，通過加入HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5)室溫孵育1小時，用100μl50mM Tris/HCl pH7.5洗滌親和基質(zhì)4次，然后用100mM碳酸鹽緩沖液pH10.5連續(xù)洗脫4次(每次20μl)。5μl合并的洗脫液(共80μl)通過PAGE用12％的Bis-Tris-Gels(MES電泳緩沖液)電泳并銀染顯色，洗脫的PT量通過與確定量的同一凝膠上的作為分子量標準的純化后的PT進行直接比較來計算(圖24，表12)。
表12
為了對比肽鏈酶親和素瓊脂糖凝膠與去唾液酸胎球蛋白瓊脂糖凝膠的純化效率，在可比條件下用去唾液酸胎球蛋白瓊脂糖凝膠進行了平行的滴定實驗(每次反應(yīng)時同樣量的親和配體固定到瓊脂糖凝膠，相當于約100pmol親和配體有效地結(jié)合到瓊脂糖凝膠上)。該實驗通過6.85μl去唾液酸胎球蛋白瓊脂糖凝膠(批號FA053198密度1.1mg/ml，14.6pmol/μl)與不同量的樣品B(50、66、100、173.3、200、400μl，用HCl將pH調(diào)節(jié)到7.0-7.5)室溫孵育1小時完成。繼之，對去唾液酸胎球蛋白瓊脂糖凝膠進行洗滌，將結(jié)合的PT洗脫，并如以上所描述的那樣進行分析。在所用純化條件下，肽鏈酶親和素瓊脂糖凝膠的結(jié)合效率明顯高于去唾液酸胎球蛋白瓊脂糖凝膠。
d.再利用的肽瓊脂糖凝膠用于PT的多次結(jié)合和洗脫為了研究載有肽的瓊脂糖凝膠(pp26/9和匙羹藤抑甜味肽/15)多次反復(fù)用于PT的結(jié)合和洗脫的再利用情況，將該瓊脂糖凝膠用于PT的結(jié)合、洗脫和再生的重復(fù)循環(huán)中(總共4次)。將600pmol pp26/9或匙羹藤抑甜味肽/15與2μl鏈酶親和素瓊脂糖凝膠室溫孵育過夜進行固定，繼而用HEPES緩沖液洗滌3次。為了結(jié)合PT，各肽鏈酶親和素瓊脂糖凝膠與400μl樣品B(通過加入HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5)室溫孵育1小時，然后用50mM Tris/HCl pH7.5洗滌4次(每次200μl)，PT用100mM碳酸鹽緩沖液連續(xù)4次洗脫(每次20μl)。繼之，該柱基質(zhì)用10mM HCl(1×20μl，2×100μl)洗滌3次再生，再用200μl 50mMTris/HCl pH7.5洗滌2次進行中和。這種結(jié)合、洗脫和再生過程在同一肽鏈酶親和素瓊脂糖凝膠上再進行3次。4μl合并的洗脫液(共80μl)和7μl來自各結(jié)合/洗脫/再生循環(huán)的首次再生緩沖液通過PAGE在12％的Bis-Tris-Gels(MES電泳緩沖液)上進行電泳并銀染顯色，提示肽鏈酶親和素瓊脂糖凝膠可以再利用(圖25)。
5.擴大規(guī)模的FPLC純化PT優(yōu)化后的PT結(jié)合和洗脫條件用于擴大規(guī)模FPLC純化(0.5ml柱)，如以下所示A)生物素化肽固定到鏈酶親和素瓊脂糖凝膠上200nmol肽pp26/9與含于10ml HEPES緩沖液中的1ml 50％的鏈酶親和素瓊脂糖凝膠在搖輪上室溫孵育1小時30分鐘，孵育后瓊脂糖凝膠用50mMTris/HCl pH7.5洗滌3次。
B)結(jié)合PT(從樣品B中)估計有效固定于500μl瓊脂糖凝膠上的肽量為50nmol，該肽瓊脂糖凝膠與25ml樣品B在head over tail搖床上室溫孵育1小時30分鐘(推測PT濃度為約0.5pmol，相當于25ml中有12.5nmol，相當于固定的肽與PT量的比率為4∶1)。
C)FPLC柱孵育后，瓊脂糖凝膠被轉(zhuǎn)移到柱中(Pharmacia HR5/5)，在裝柱過程中，瓊脂糖凝膠用50mM Tris/HCl pH7.5(2-3ml)洗滌，繼之將柱子連接到液流通道上用20倍柱體積(10ml)的50mM Tris/HClpH7.5洗滌。固定化的PT用11ml 100mM碳酸鹽緩沖液pH10.5洗脫，收集500μl的洗脫組分(Pharmacia Fraction Collector FRAC-100)，通過紫外280nm的吸收值來評估洗脫圖譜。洗脫完成后，柱子用1.5ml50mM Tris/HCl pH7.5洗滌，然后用2.5ml 10mM HCl進行再生處理并用10ml 50mM Tris/HCl pH7.5進行中和。
D)分析洗脫組分并計算產(chǎn)率洗脫組分用PAGE凝膠(2％的Bis-Tris-Gels，MES電泳緩沖液)進行分析并銀染顯色(圖26)，PT的濃度根據(jù)測定洗脫組分在280nm時的吸收值并與用純化PT繪制的校正曲線進行對比來確定(見圖26中的表)。
PT的量根據(jù)與在同一凝膠上的已知量的純化的PT的分子量標準進行直接比較而另外計算。通過凝膠估計得到的結(jié)果是PT產(chǎn)率為8100pmol。這一結(jié)果與用A280得到的濃度結(jié)果有很好的相關(guān)性。假如推測25ml樣品B含有1125μgPT，在這些條件下，69-72％的PT被洗脫下來。這一結(jié)果在用再生的相同的肽瓊脂糖凝膠結(jié)合25ml樣品中的PT的FPLC純化時得到了證實，在這個實驗中，803μgPT被純化出來(A280)(表13)。
表13根據(jù)A280確定洗脫組分中(FPLC批次#2)的PT濃度
表14PT純化結(jié)果總結(jié)
6.評估pp26肽9/百日咳毒素復(fù)合物形成的平衡和速率常數(shù)pp26K9/PT復(fù)合物形成的平衡常數(shù)和速率常數(shù)通過BIAcore2000儀在室溫下用HBS/EP電泳緩沖液(0.01HEPES pH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005％(v/v)聚山梨酯20)來評估。不同濃度的pp26-K9(濃度在2.5nM到100nM之間)與固定到CM5芯片上的PT結(jié)合(通過胺連接法固定6000RU)，在30μl/分鐘的流速條件下進行分析。結(jié)合于肽上的PT的定量洗脫用3mM HCl，pH2.5來獲得。推論的平衡和速率常數(shù)用BIA評估軟件來進行分析，結(jié)果顯示如下解離平衡常數(shù)KD→7.5×10-9M締合平衡常數(shù)KA→1.3×10-8M-1締合速率常數(shù)Kon→1.3×105M1×s-1解離速率常數(shù)Koff→10-3s-1本發(fā)明是以優(yōu)選方案的角度來進行描述的，可以理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員可能對其進行改變或修改。因此，所附的權(quán)利要求有意覆蓋所有在本發(fā)明要求保護的范圍內(nèi)的這些等價的改變。
權(quán)利要求
1.一種有能力結(jié)合百日咳毒素的肽，所述肽選自RSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDA(pp26-5)；RSTMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSIDA(pp26-6)；RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA(pp26-9)；RSWRDTRKLHMRHYFPLAIDSYWDHTLRDA(pp26-15)；SGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCG(G-9)；SGCVKKDELCELAVDECCEPLECFQMGHGFKRCG(G-10)；SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS(G-15)；和SGCVKKDELCELAIDECCEPLECTKGDLGFRKCG(G-19).。
2.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽是RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA(pp26-9)；或SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS(G-15)
3.一種產(chǎn)生DNA-肽融合體的方法，所述方法包括(a)將核酸逆轉(zhuǎn)錄引物共價結(jié)合到編碼肽的RNA上，所述逆轉(zhuǎn)錄引物與肽受體結(jié)合；(b)翻譯所述RNA產(chǎn)生肽，該肽與逆轉(zhuǎn)錄引物共價結(jié)合；(c)逆轉(zhuǎn)錄所述RNA形成DNA-肽融合體；其中所述肽對百日咳毒素有結(jié)合親和力。
4.一種產(chǎn)生DNA-肽融合體的方法，所述方法包括(a)產(chǎn)生RNA-肽融合體；(b)將核酸逆轉(zhuǎn)錄引物與所述融合體雜交；(c)將所述引物共價結(jié)合到所述融合體上；(d)逆轉(zhuǎn)錄所述RNA-肽融合體中的RNA形成DNA-肽融合體；其中所述肽對百日咳毒素有結(jié)合親和力。
5.一種產(chǎn)生DNA-肽融合體的方法，所述方法包括以下步驟的組合(a)提供共價結(jié)合到肽受體上的RNA分子；(b)將核酸逆轉(zhuǎn)錄引物共價結(jié)合到步驟(a)中的分子上；(c)翻譯所述RNA分子生成肽，并(d)逆轉(zhuǎn)錄所述RNA分子形成DNA-肽融合體；其中所述肽對百日咳毒素有結(jié)合親和力。
6.一種DNA-肽融合體，所述融合體用權(quán)利要求3、4或5中的方法制備。
7.一種對百日咳毒素具有親和力的肽，所述肽用權(quán)利要求3、4或5的方法鑒別。
8.權(quán)利要求1、2或7中任一項的肽，其中所述肽被生物素化。
9.一種純化百日咳毒素的方法，所述方法包括用結(jié)合到固體支持體上的權(quán)利要求1、2或7中至少一項的肽與含有百日咳毒素的生物溶液接觸而形成百日咳毒素-肽復(fù)合物并將該復(fù)合物從生物溶液中的其他成分中分離出來。
10.權(quán)利要求9的方法，其中百日咳毒素從復(fù)合物中釋放出來并被分離。
11.權(quán)利要求10的方法，其中通過改變復(fù)合物周圍環(huán)境的pH值而將百日咳毒素從該復(fù)合物中釋放出來。
12.權(quán)利要求11的方法，其中復(fù)合物被暴露于具有酸性pH的溶液中。
13.權(quán)利要求11的方法，其中復(fù)合物被暴露于具有堿性pH的溶液中。
14.權(quán)利要求10的方法，其中通過改變復(fù)合物周圍環(huán)境的離子強度而將百日咳毒素從該復(fù)合物中釋放出來。
15.權(quán)利要求14的方法，其中通過將復(fù)合物暴露于具有高濃度的一種或多種離子鹽的溶液而改變離子強度。
16.權(quán)利要求15的方法，其中離子鹽為氯化鈉或氯化鎂中的至少一種。
17.權(quán)利要求16的方法，其中離子鹽為氯化鎂。
18.權(quán)利要求9-17中任一項的方法，其中所述固體支持體為微珠。
19.權(quán)利要求9-17中任一項的方法，其中所述固體支持體包含瓊脂糖凝膠。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述固體支持體由鏈霉親和素瓊脂糖凝膠構(gòu)成。
21.權(quán)利要求20的方法，其中肽被生物素化，并且肽通過肽上的生物素部分與鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上的鏈霉親和素部分相互作用而結(jié)合到所述固體支持體上。
22.一種分離DNA-肽融合體的方法，其中肽對百日咳毒素有結(jié)合親和力，所述方法包括以下步驟的組合(a)將核酸逆轉(zhuǎn)錄引物共價結(jié)合到編碼肽的RNA上，所述逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合到肽受體上；(b)翻譯RNA生成肽，該肽共價結(jié)合于逆轉(zhuǎn)錄引物，并且(c)逆轉(zhuǎn)錄RNA形成DNA-肽融合體；(d)將該DNA-肽融合體與結(jié)合到固體支持體上的百日咳毒素接觸形成DNA-肽融合體-百日咳毒素復(fù)合物；(e)將該復(fù)合物從那些未與百日咳毒素形成復(fù)合物的DNA-肽融合體中分離出來；并且(f)從DNA-肽融合體-百日咳毒素復(fù)合物中分離DNA-肽融合體。
23.一種鑒別具有百日咳毒素結(jié)合親和力的肽的方法，該方法包括實施權(quán)利要求22的方法，并且進一步確定該DNA-肽融合體的肽部分的氨基酸序列。
24.一種鑒別編碼具有百日咳毒素結(jié)合親和力的肽的DNA的序列的方法，該方法包括實施權(quán)利要求22的方法，并且進一步確定該DNA-肽融合體的DNA部分的核苷酸序列。
25.一種免疫組合物，含有通過權(quán)利要求10的方法分離的百日咳毒素。
26.一種具有與百日咳毒素結(jié)合能力的肽，該肽的氨基酸序列顯示于圖3-14任一幅中。
27.權(quán)利要求3-5或9-24中任一項的方法，其中百日咳毒素結(jié)合肽的氨基酸序列包括衍生自匙羹藤抑甜味肽或PP26的氨基酸序列。
28.權(quán)利要求3-5或9-24中任一項的方法，其中編碼百日咳毒素結(jié)合肽的核苷酸序列包括衍生自匙羹藤抑甜味肽或PP26的核苷酸序列。
29.一種具有與百日咳毒素結(jié)合能力的肽，包含氨基酸序列LGHGLGYAY。
30.權(quán)利要求29的肽，進一步包含氨基酸序列ELAVD、ELAID或ARWDLV。
31.一種具有與百日咳毒素結(jié)合能力的肽，包含氨基酸序列TTASKS或KWTNEHFGT中的至少一種。
32.權(quán)利要求31的肽，包含氨基酸序列TTASKS和KWTNEHFGT。
33.一種具有百日咳毒素結(jié)合能力的肽，包含選自以下的氨基酸序列NVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDD，VGTTIRIAQDTEHYRNVYHKLSQYSR，WTSMQGETLWRTDRLATTKTSMSHPP，LSALRRTERTWNTIHQGHHLEWYPPA，LSRLARTERTWDRIHQGHHLEWHPPA，TMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSI，LSALMRTERTWNTIHQGHHLEWYPPA，CLATRNGFVMNTDRGTYVKRPTVLQ，CLATRNGFVQMNTDRGTYVKRPTVLQ
35.一種具有百日咳毒素結(jié)合能力的肽，包含氨基酸序列XXAXRXXXXXXNTXXXXXXXXXT或XXAXRXXXXXXNTXXXXXXXXXY，其中X為任何氨基酸。
36.一種具有百日咳毒素結(jié)合能力的肽，包含VXXXXXXXXDTXXXXRXXXXXLS的氨基酸序列，其中X為任何氨基酸。
37.權(quán)利要求29-36中任一項的肽，其中至少一個氨基酸被保守性替代。
38.權(quán)利要求29-37中任一項的肽，其中肽被生物素化。
39.一種純化百日咳毒素的方法，該方法包括用結(jié)合到固體支持體上的權(quán)利要求29-38中至少一項的肽與含有百日咳毒素的生物溶液接觸而形成百日咳毒素-肽復(fù)合物，并且將該復(fù)合物從生物溶液中的其他成分中分離出來。
40.權(quán)利要求39的方法，其中百日咳毒素從復(fù)合物中釋放出來并分離。
41.權(quán)利要求40的方法，其中通過改變復(fù)合物周圍環(huán)境的pH值而將百日咳毒素從復(fù)合物中釋放出來。
42.權(quán)利要求41的方法，其中復(fù)合物被暴露于具有酸性pH的溶液中。
43.權(quán)利要求41的方法，其中復(fù)合物被暴露于具有堿性pH的溶液中。
44.權(quán)利要求40的方法，其中通過改變復(fù)合物周圍環(huán)境的離子強度而將百日咳毒素從復(fù)合物中釋放出來。
45.權(quán)利要求44的方法，其中通過將復(fù)合物暴露于具有高濃度的一種或多種離子鹽的溶液中來改變離子強度。
46.權(quán)利要求45的方法，其中離子鹽是氯化鈉或氯化鎂中的至少一種。
47.權(quán)利要求46的方法，其中離子鹽是氯化鎂。
48.權(quán)利要求39-47中任一項的方法，其中所述固體支持體是微珠。
49.權(quán)利要求39-47中任一項的方法，其中所述固體支持體包含瓊脂糖凝膠。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述固體支持體由鏈霉親和素瓊脂糖凝膠構(gòu)成。
51.權(quán)利要求50的方法，其中肽被生物素化，并且肽通過肽上的生物素部分與鏈霉親和素瓊脂糖凝膠上的鏈霉親和素部分相互作用而結(jié)合到固體支持體上。
全文摘要
本發(fā)明涉及純化百日咳毒素(PT)的試劑和方法。
文檔編號G01N33/547GK1906307SQ200480040557
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者A·容布盧特, E·施奈德, P·瓦納 申請人:圣諾菲·帕斯圖爾公司