專利名稱：致癱瘓水生有殼類動物毒素的分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛤蚌毒素結(jié)合多肽，親蛤蚌毒素蛋白(saxiphilin)的分離和純化，以及應(yīng)用純化的親蛤蚌毒素蛋白用來檢測、富集、純化和提取蛤蚌毒素的方法、分析和裝置。特別是本發(fā)明涉及一種經(jīng)濟(jì)、耐用(robust)、高通量的分析方法，其不需要放射性標(biāo)記的試劑，適合現(xiàn)場使用。
背景技術(shù)：
致癱瘓的水生有殼類動物中毒由攝取含來自腰鞭毛蟲的毒素的魚，水生有殼類動物或軟體動物引起，由于導(dǎo)致嚴(yán)重的人類疾病，通常導(dǎo)致死亡，目前成為一個(gè)世界范圍問題。中毒由致癱瘓水生有殼類動物毒素(PSTs)引起，其屬于原型分子蛤蚌毒素(STX)相關(guān)毒素家族。并且，有毒淡水海藻的繁盛能以相同神經(jīng)毒素污染供水，可以引起致癱瘓的水生有殼類動物中毒。這種毒素污染的水會給人，牲畜以及野生動物造成可怕的后果。
PSTs的一般結(jié)構(gòu)如下



毒素家族可分成3大類蛤蚌毒素(saxitoxins)，高強(qiáng)活性神經(jīng)毒素，并且沒有被硫酸酯化；gonyautoxin(GTXs)，為單硫酸酯化；以及N-磺基氨基甲酰-11-硫酸氫鹽(hydrosulphate)C-毒素，其毒性小于STXs或GTXs。
PSTs毒性源自其與電壓依賴性鈉通道的結(jié)合，其阻斷鈉離子的內(nèi)流，因此阻斷神經(jīng)肌肉的傳輸。這導(dǎo)致呼吸麻痹，目前沒有有效的治療措施。在一些爆發(fā)的致癱瘓的水生有殼類動物中毒事件中，40％以上的受害者已經(jīng)死亡。PSTs與河豚毒素具有完全不同的結(jié)構(gòu)，但卻結(jié)合到鈉通道的相同位點(diǎn)(Hall等，1990)。在一些場合下，河豚毒素可與PSTs一起發(fā)生作用，因此任何用于檢測PSTs的分析必須能夠?qū)⑵渑c河豚毒區(qū)分開。
腰鞭毛蟲，是PSTs的源頭，周期性地形成海藻繁盛，也就是聞名的赤潮(Anderson，1994)。軟體動物，魚，以及水生有殼類動物，包括有商業(yè)意義或使用水產(chǎn)技術(shù)養(yǎng)殖的物種，可能會吞食腰鞭毛蟲從而聚集毒素。不可能檢測對每一只海產(chǎn)動物進(jìn)行檢測判斷是否包含毒素，因此就存在人類由于不注意而食用包含毒素的動物的風(fēng)險(xiǎn)。因此就需要監(jiān)控人類消費(fèi)的物種中存在的PSTs，以避免中毒的危險(xiǎn)以及預(yù)防社會及經(jīng)濟(jì)損失。
目前已經(jīng)知道有超過20種蛤蚌毒素的天然類似物，以及它們對哺乳動物的毒性。一些天然存在的PSTs列在表1中。
表1一些天然存在的PSTs

海藻繁盛的發(fā)生在全球出現(xiàn)上升的態(tài)勢，可能是沿海水超營養(yǎng)作用增加及全球變暖的結(jié)果，結(jié)果導(dǎo)致致癱瘓的水生有殼類動物中毒或水生有殼類動物或帶PSTs其他生物污染的發(fā)生率也上升。例如，單在2000年，在馬來西亞的沙巴就有四人中毒，甲殼類漁業(yè)停業(yè)四個(gè)月。在菲律賓的馬尼拉灣，甲殼類漁業(yè)停業(yè)數(shù)月；在華盛頓州，9人中毒并且5人需要住院治療，在2000年Cape Cod和南緬因州的甲殼類漁業(yè)也遭停業(yè)數(shù)月，這兩起事件都發(fā)生在美國；2000年5月，新西蘭North Island的西海岸的所有甲殼類漁業(yè)由于海藻繁盛，都遭停止，其逼近綠色環(huán)繞的(greenlipped)蚌類產(chǎn)區(qū)，每年產(chǎn)生價(jià)值8千4百萬新元的蚌類；在蘇格蘭在2000年6月甲殼類漁業(yè)被禁止；并且海藻繁盛導(dǎo)致在南非和中國發(fā)生不少致癱瘓的水生有殼類動物中毒事件；加拿大2000年7月檢測到的污染結(jié)果，是將3000條養(yǎng)殖的大麻哈魚(salmon)消滅。特別是，在美國，在過去的10年內(nèi)發(fā)生了約150起水生有殼類動物污染事件，導(dǎo)致甲殼類漁業(yè)最長達(dá)12個(gè)月的停頓；在蘇格蘭的一些地方，停業(yè)達(dá)3年之久；1994在摩洛哥，導(dǎo)致4人死亡，74人住院接受治療；在菲律賓自1983年已有約1600人中毒，而在1983年之前，幾乎沒有此類事件的發(fā)生；1997年在印度爆發(fā)了一次，導(dǎo)致7人死亡，500人住院接受治療，禁止甲殼類漁業(yè)導(dǎo)致1000戶家庭失去工作。
不幸地，盡管急需簡單、耐用及可靠的方法來檢測人類食用的海洋生物的中污染，現(xiàn)有方法卻不能令人滿意。急需常規(guī)的水生有殼類動物檢測方法以保證有毒產(chǎn)品不進(jìn)入市場(VanEgmond和Dekker，1995)。目前，唯一獲得官方認(rèn)可的方法是小鼠致死生物分析方法，由官方分析化學(xué)家聯(lián)合會(AOAC)批準(zhǔn)官方分析方法，959.08E部分，1990。這種方法需要對小鼠腹膜內(nèi)注射潛在的毒性生物體例如水生有殼類動物的鹽酸提取物，并且觀察從注射到死亡的時(shí)間(Sommer和Meyer，1937；Hungerford，1995)。小鼠必須來自小鼠群體，定期地參考毒素樣品對其靈敏度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且樣品必須進(jìn)行稀釋以保證死亡在5～7分鐘內(nèi)發(fā)生。該分析方法不人道、昂貴、不普及，由于動物保護(hù)條例也冒著被禁止的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在有些國家如歐盟，荷蘭和德國。更值得關(guān)注的是小鼠生物分析方法的靈敏度只有180μg STX/1(Johnson和Mulberry，1966)。
使用靈敏度較差的方法意味著存在著下列嚴(yán)重危險(xiǎn)可能檢測不出足以引起人中毒的PSTs水平。例如，菲律賓的兒童由于食用水生有殼類動物而死亡，但小鼠致死生物分析表明水生有殼類動物只含40μg STX/100g水生有殼類動物肉，將由于提取溶劑以及水生有殼類動物的稀釋作用考慮在內(nèi)，其約等于約200μg。該毒性水平與小鼠致死生物分析的檢測限相同。
該問題導(dǎo)致人們致力于開發(fā)替代分析方法的嘗試，基于(a)用生物觀察的方法檢測中毒生物的存在，(b)利用如DNA探針的方法進(jìn)行原位檢測，或
(c)用生化，生理或化學(xué)分析檢測海洋生物中的毒素。
一種方法利用阻滯電壓門控(voltage-gated)鈉通道(VGSC)原理來進(jìn)行檢測，后者為興奮細(xì)胞中大跨膜蛋白，當(dāng)其響應(yīng)細(xì)胞電位差的改變而開啟的時(shí)候，導(dǎo)致離子通過中孔(central pore)(參見如Doucette等，1997；Jellett等，1992；Vieytes等，1993)。這些分析都基于放射配體分析方法(Weigele和Barchi，1978)，可以改成微量滴定板形式，以增加樣品通量(Doucette等，1997)。也可以使用強(qiáng)刺激(hyperstimulated)細(xì)胞培養(yǎng)以增加通過鈉通道的離子流量(Jellett等，1992；美國專利5,420,011和5,858,687)。
但是，這些分析方法費(fèi)用昂貴且技術(shù)復(fù)雜，需要放射性標(biāo)記的試劑或細(xì)胞培養(yǎng)。并且對pH波動敏感，因?yàn)樵趐H大于6.7時(shí)，PSTs很容易被從離子通道上替換下來，類似地，也對陽離子濃度敏感，并且，更重要地，由于它們也能檢測河豚毒素，為非特異的方法。這些方法中沒有一種方法適合現(xiàn)場使用?；瘜W(xué)分析方法由于下列事實(shí)而變得復(fù)雜每種毒素在結(jié)構(gòu)上千變?nèi)f化，從強(qiáng)極性到親脂性，從低分子量到大分子量。而且，那些化學(xué)方法需要用已知毒素的標(biāo)準(zhǔn)樣品，且不能用這些方法測量任何一種新的生物活性的PSTs。因此基于抗體檢測或用化學(xué)方法如高效液相色譜，質(zhì)譜，或毛細(xì)管電泳的分析方法不能檢測廣譜的毒素。
一種簡單快速初步純化(clean-up)水生有殼類動物粗提物的方法與長形工作臺(bench)或桌面(desktop)側(cè)流(lateral flow)免疫色譜分析方法(由JellettBiotek銷售)聯(lián)用，可以在10分鐘內(nèi)得到初步的結(jié)果；但是，需要用液相色譜-質(zhì)譜來確證篩選的結(jié)果。初步純化用甲酸銨流動相在適和親脂性毒素分離的5cm固相柱上進(jìn)行，接著用60-90％梯度的四腈(tetranitrile)-2mM甲酸銨(pH3.5)在Tosoh-Haas酰胺40柱上進(jìn)行LCMS分析。初步的結(jié)果由M.A.Quilliam于2000年9月在國際海產(chǎn)生物技術(shù)會議(International MarineBiotechnology Conference，Townsville)上報(bào)告。
我們使用了一種不同的方法，所述方法基于已知為親蛤蚌毒素蛋白的受體蛋白，無論是在氨基酸序列還是功能特性上與VGSC完全無關(guān)，能特異地與STX結(jié)合，但不與河豚毒素結(jié)合(Llewellyn和Moczydlowski，1994)。親蛤蚌毒素蛋白與STX的結(jié)合能力已經(jīng)用于低通量的放射配體結(jié)合分析，用于檢測藍(lán)色綠藻、甲殼類和軟體動物中的PSTs(Carmichael等，1997；Negri和Llewellyn，1998)。該方法利用從親蛤蚌毒素蛋白中替代3H-標(biāo)記的STX。我們已經(jīng)應(yīng)用包含親蛤蚌毒素蛋白的粗制提取物來開發(fā)檢測PSTs的微量滴定板分析方法(Llewellyn等，1998；Llewellyn和Doyle，2000)。盡管這種分析方法提供了高通量、靈敏度和精確性，也具有不受水生有殼類動物提取物中存在的其他化合物干擾的影響或在從水生有殼類動物提取過程中保持毒素穩(wěn)定性所必須酸性pH的影響的優(yōu)點(diǎn)，但該方法仍然具有需要放射性標(biāo)記物的缺點(diǎn)。
分析中使用的親蛤蚌毒素蛋白是通過在含蛋白酶抑制劑混合液(cocktail)的緩沖液中勻漿蜈蚣Ethmostigmus rubripes樣本得到的粗制品。盡管這種制備方法可以提供了良好的靈敏度，在試劑的易得性以及制備的規(guī)定及可重復(fù)性上仍然存在問題。因此仍然需要一種適合快速，耐用的分析技術(shù)，合適現(xiàn)場使用，例如在捕魚船上，或在水產(chǎn)養(yǎng)殖場，并且能夠檢測較寬范圍的STXs。
可以很清楚地理解，盡管這里參考了許多現(xiàn)有的技術(shù)公開，但這些參考并不能形成這樣的事實(shí)，即這些文獻(xiàn)中的任何一種可以形成本領(lǐng)域的共知知識，無論是在澳大利亞或在其他任何國家。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供了一種檢測和/或測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)的方法，包括下列步驟1)提供分離的親蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段；2)將其與樣品接觸；3)測量PSTs與分離的親蛤蚌毒素蛋白的結(jié)合；以及將結(jié)合量與樣品中PSTs的有無或PST濃度相關(guān)聯(lián)。
分離的親蛤蚌毒素蛋白，或其片段，可偶聯(lián)到可檢測的標(biāo)記物或固定到固相支持物上?？蓹z測的標(biāo)記可為任何合適的標(biāo)記，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的那樣，可用任何方便的方法偶聯(lián)到固相載體上。
本發(fā)明另一方面提供了測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)量的方法，包括下列步驟(a)用聚陽離子預(yù)處理微量滴定濾板的濾器；(b)向微孔中加入已知量的標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白，包括用可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的分離的親蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段，以及懷疑包括致癱瘓水生有殼類動物毒素物質(zhì)的系列稀釋液；
(c)將板孵育足夠長時(shí)間，以容許存在的任何致癱瘓水生有殼類動物毒素與標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合；(d)通過孔的濾器吸出每孔中的內(nèi)容物，以除去除標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白和其化合物結(jié)合以外的組分；(e)清洗每孔以及濾器以除去殘留的未結(jié)合的化合物；以及(f)測量濾器截留的標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白量，其中標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合程度與對照樣品對比時(shí)，可以顯示出樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素蛋白量。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離的親蛤蚌毒素蛋白偶聯(lián)到固相載體上。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供分離的親蛤蚌毒素蛋白用可檢測標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了無脊椎動物親蛤蚌毒素蛋白的分離方法，包括下列步驟(a)將產(chǎn)生親蛤蚌毒素蛋白節(jié)肢動物的個(gè)體在含蛋白酶抑制劑的生理緩沖液中進(jìn)行勻漿；(b)將勻漿液進(jìn)行低速離心以除去細(xì)胞碎片；(c)將從步驟(b)得到上清進(jìn)行高速離心；以及(d)從上清用硫酸銨沉淀出親蛤蚌毒素蛋白。
所述方法進(jìn)一步包括下列步驟(e)純化沉淀的親蛤蚌毒素蛋白。
有利地，親蛤蚌毒素蛋白用40-60％硫酸銨沉淀。在進(jìn)行該步驟之前，pH可暫時(shí)地降低到5.0以沉淀一些非親蛤蚌毒素蛋白。
典型地，純化沉淀的親蛤蚌毒素蛋白包括下列步驟(i)在pH5.0-6.5重新溶解沉淀，離心除去非親蛤蚌毒素蛋白分子；(ii)將從(e)得到的上清與親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合到其上的基質(zhì)，如玻璃纖維聚乙烯亞胺(PEI)載體基質(zhì)進(jìn)行接觸；以及(iii)在高鹽條件下從基質(zhì)上洗脫結(jié)合的物質(zhì)。
在步驟(iii)中，親蛤蚌毒素蛋白典型地用溶解在pH5-9的緩沖液中、濃度為600mM至飽和的NaCl或KCl洗脫?？梢允褂枚喾N不同的緩沖液。
任選地，可進(jìn)行進(jìn)一步的純化，例如用(f)在用100ml 25mM乙酸鈉在10mM MES-NaOH，EDTA(pH6.0)中的溶液進(jìn)行平衡的肝磷脂瓊脂糖(凝膠)上層析，用300～800mM乙酸鈉的MES-NaOH，EDTA(pH6.0)溶液進(jìn)行梯度洗脫，以及(g)在用25mM三乙胺pH10.5平衡的PBE 118樹脂上進(jìn)行層析聚焦(chromatofocussing)，并用Polybuffer 96溶液(包含8.9ml Polybuffer96，1.8mlPharmalyte 8-10.5)進(jìn)行洗脫，得到250ml的終體積，pH為8.0。
可以利用大小排阻色譜或在柱上脫鹽，例如AmershamPharmaciaBiotech的PD-10柱實(shí)現(xiàn)Polybuffer去除以及緩沖液變換。
節(jié)肢動物可為任何產(chǎn)生親蛤蚌毒素蛋白的物種。參見例如Llewellyn等，1997。優(yōu)選的節(jié)肢動物為蜈蚣，例如Ethmostigmus rubripes，等腳類的動物(isopod)，例如Oniscus物種，蜘蛛，例如Araneus.c.f.Cavaticus，Xanthid crab，或Clopterygidae家族的昆蟲。
更優(yōu)選節(jié)肢動物為蜈蚣，最優(yōu)選Ethmostigmus rubripes。從該物種分離的親蛤蚌毒素蛋白已經(jīng)被證明可與PST家族所有的結(jié)構(gòu)亞類的PSTs以相似的親和力進(jìn)行結(jié)合。節(jié)肢動物可以方便地通過降低體溫使其麻醉。勻漿可用任何方便的儀器進(jìn)行，如Heidolph組織勻漿器。合適的勻漿緩沖液是20mMHEPES-NaOH，pH7.4，含0.5mM EDTA 1μM亮抑肽酶，1μM抑胃酶肽，0.5μM抑蛋白酶肽，以及1μM苯基甲基磺酰氟。合適地，每克節(jié)肢動物材料使用2ml緩沖液。低速離心可方便在8000g進(jìn)行10分鐘，然后在50,000g高速離心20分鐘。高速離心后的上清液可在液氮中凍存，進(jìn)一步處理前保存在80C。
PEI載體基質(zhì)用常規(guī)方法制備，例如將玻璃纖維用0.3％PEI的水溶液(v/v)孵育至少1小時(shí)，通過真空排干(draining)或抽吸(aspiration)以除去PEI。
分離的親蛤蚌毒素蛋白可用來檢測PSTs，用我們已經(jīng)描述的微量滴定板分析方法(Llewellyn和Doyle 2000；Lewellyn等，1998)，利用用非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該了解合適的標(biāo)記物，其包括熒光和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，膠體金，膠乳微珠，脂質(zhì)體封裝的染料以及酶標(biāo)記，盡管這些標(biāo)記物由于需要發(fā)生酶反應(yīng)導(dǎo)致信號增強(qiáng)是時(shí)間依賴性的，而顯得不太有利。脂質(zhì)體封裝染料可為生物素化或以其他方式標(biāo)記的，以促進(jìn)其在分析中的捕獲。使用這些標(biāo)記每一種的合適檢測方法都是本領(lǐng)域公知的方法。
本發(fā)明分離的親蛤蚌毒素蛋白也有用于制備PSTs純化、富集或提取的親和材料，例如用于懷疑被海藻繁盛污染水的水質(zhì)測試。例如，分離的親蛤蚌毒素蛋白可偶聯(lián)到合適的固相載體上，其可裝填在柱或柱體中。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，固相載體裝填在適合連接到注射器的柱體中。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道合適的偶聯(lián)方法及載體，例如溴化氰活化的基質(zhì)例如瓊脂糖；環(huán)氧活化的基質(zhì)；羧基甲基纖維素酰肼；聚丙烯酰胺酰肼以及環(huán)氧乙烷丙烯酸的珠。PSTs可從親和材料用小體積(例如1-5ml)的酸，脲或濃縮鹽處理而洗脫下來。
對在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的分析，這種初步純化可在懷疑被PSTs污染物質(zhì)的樣品分析之前進(jìn)行。
適合本發(fā)明分析或初步富集方法中使用的物質(zhì)可為組織提取物，例如從脊椎動物例如魚或可能吞食PST污染的物質(zhì)的哺乳動物種類；無脊椎動物例如軟體動物，包括水生有殼類動物或頭足類動物(cephalopods)；肉眼可見的海藻(macroscopic algae)例如海草；微藻類包括藻青菌，腰鞭毛蟲等；或細(xì)菌。也可以測試生物體液例如懷疑PST中毒的病人的血，尿或唾液，或水樣，例如懷疑被污染的飲用水供應(yīng)或來自海藻繁盛區(qū)域的水，其可能包含由繁盛生物釋放的溶解毒素。并且，也可以應(yīng)用包含合成PSTs的樣品。
PSTs可從待測的組織中，使用任何合適的水或醇溶劑進(jìn)行提??；由于蛤蚌毒素在堿性條件下易于降解，優(yōu)選溶劑在酸性pH下。任選地提取在升高的溫度下進(jìn)行。所述方法中使用的特別合適的溶劑是，由Association ofOfficial Analytical Chemists認(rèn)可的，即0.1N HCl。
有多種特異方法可以進(jìn)行本發(fā)明的分析，下面將描述多種優(yōu)選的本發(fā)明技術(shù)方案。
本發(fā)明的一種技術(shù)方案提供了一種測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素量的方法，包括下列步驟(a)用聚陽離子預(yù)處理微量滴定過濾板的濾器；(b)向板孔中加入已知量的可檢測標(biāo)志物標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白，以及一系列懷疑包括致癱瘓水生有殼類動物毒素的物質(zhì)的稀釋液；(c)將板孵育足夠的時(shí)間以容許致癱瘓水生有殼類動物毒素與親蛤蚌毒素蛋白的結(jié)合；(d)通過孔的濾器吸出每孔的內(nèi)容物，以除去除親蛤蚌毒素蛋白和其結(jié)合的化合物以外的組分；
(e)清洗每一個(gè)孔及濾器以除去殘留的未結(jié)合的化合物；以及(f)測量濾器保留的標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白量，其中標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合程度，當(dāng)與對照樣品比較的時(shí)候，就可以表示出樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素量。
優(yōu)選步驟(b)中的樣品包括緩沖液，以保持pH的范圍為6.5～9，并任選地也包括氯化物鹽類，例如氯化鈉或氯化鉀，濃度可達(dá)500mM。典型地孔中的總體積為50～350μl，優(yōu)選100～200μl，更優(yōu)選150μl。在步驟(c)中，孵育在0～30℃進(jìn)行，優(yōu)選在室溫下，至少進(jìn)行30分鐘；孵育優(yōu)選進(jìn)行60～120分鐘，更優(yōu)選90分鐘，但可以持續(xù)到約8小時(shí)。在步驟(e)中，可使用任何合適的溶液進(jìn)行清洗，例如用與步驟(b)相同的pH的緩沖液。單次清洗通常就足夠了；但是，每孔典型地清洗2～3次。
依據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，方案使用150μl的總體積，包含20mMMOPS-NaOH(pH7.4)，200mM NaCl，以及1nM標(biāo)記的STX蜈蚣親蛤蚌毒素蛋白，通過濾器吸出之前在室溫下(～25℃)孵育90分鐘。用180μl冰冷的水對每孔清洗三次。親蛤蚌毒素蛋白的最適宜量可以很方便用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用來測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素量的試劑盒，包括(a)微量滴定板；(b)依據(jù)本發(fā)明用可檢測標(biāo)志物標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白；(c)提取緩沖液，用于從待測試生物體或組織的樣品提取測試物質(zhì)；以及任選地，(d)一種富集裝置(means)，用來富集提取物中的致癱瘓水生有殼類動物毒素或去除去可能干擾分析的污染物。
優(yōu)選的富集方法為柱或柱體，依據(jù)本發(fā)明所述方法包括偶聯(lián)有純化的親蛤蚌毒素蛋白的固相載體材料。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種裝置，用來測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)量，包括固定的親蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段；將樣品與所述固定的親蛤蚌毒素蛋白，或其片段的方法接觸的裝置；用來測量樣品中包含PSTs與所述固定的親蛤蚌毒素蛋白，或其片段結(jié)合的裝置；以及用來關(guān)聯(lián)結(jié)合量與樣品中PSTs有無或PST濃度的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用來測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)量的裝置，包括固定的PST；將樣品與所述固定的PST接觸的裝置；用來測量加到樣品中的親蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段結(jié)合與所述固定的PST結(jié)合的裝置；以及用來關(guān)聯(lián)結(jié)合量與樣品中PSTs有無或PST濃度的方法。
典型地使用無脊椎親蛤蚌毒素蛋白，并且其有利地用上述方法進(jìn)行純化。
所述裝置可為生物傳感器，因此包括將結(jié)合結(jié)果轉(zhuǎn)化成電信號的裝置。
有利地，可以檢測結(jié)合后蛋白的質(zhì)量變化。因此應(yīng)該意識到，由于親蛤蚌毒素蛋白是相對大的蛋白，使用包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段可以實(shí)現(xiàn)提高檢測靈敏度的目的。如果使用片段，應(yīng)該意識到結(jié)合后質(zhì)量的變化將在體系總質(zhì)量中占更大的比例。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供一種用來富集、純化和/或提取致癱瘓水生有殼類動物毒素(PSTs)的方法，包括下列步驟提供固定的親蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)片段；將懷疑包含PST的樣品與所述固定的親蛤蚌毒素蛋白接觸足夠長的時(shí)間，以使PST與固定的親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合；以及任選地，從固定的親蛤蚌毒素蛋白上洗脫結(jié)合的PST。
所述方法也可以用來，作為其他方法中的一種，對水生有殼類動物進(jìn)行解毒以及純化水。
本發(fā)明也提供將分離的親蛤蚌毒素蛋白用于制備親和材料，用來富集、純化和/或提取致癱瘓水生有殼類動物毒素。
本發(fā)明也提供一種親和材料，用于富集、純化和/或提取致癱瘓水生有殼類動物毒素，其包括偶聯(lián)有分離和純化的親蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)片段的固相載體。
有利地固相載體，選自噁唑酮基質(zhì)，溴化氰活化的基質(zhì)；環(huán)氧活化的基質(zhì)；羧基甲基纖維素酰肼；聚丙烯酰胺酰肼以及環(huán)氧乙烷丙烯酸的珠。
為了更好的理解本說明書目的，應(yīng)該清楚地理解術(shù)語″包括″方法指″包括但不限于″。
附圖的簡單說明

圖1為示意性地表示用于檢測PSTs有無的診斷測試條的上視圖及側(cè)視圖。
圖2為示意性地表示另一種診斷測試條；圖3為示意性地表示說明微量滴定板分析PSTs的原理；圖4示意性地顯示表面等離子體共振(SPR)傳感器的競爭性結(jié)合；圖5示意性的表示用于PSTs快速定量的基于親蛤蚌毒素蛋白的表面等離子體共振(SPR)傳感器；圖6表示實(shí)施例3中的結(jié)合實(shí)驗(yàn)的放射性洗脫圖；圖7的條形圖顯示圖6中pH5.0的峰的放射性的特異結(jié)合；以及圖8顯示實(shí)施例3中描述的穩(wěn)定性測試中的洗脫曲線。
發(fā)明詳述本發(fā)明現(xiàn)在將通過只參考下列非限制性的實(shí)施例以及附圖進(jìn)行詳細(xì)描述。
實(shí)施1親蛤蚌毒素蛋白的純化親蛤蚌毒素蛋白粗品通過對蜈蚣Ethmostigmus rubripes樣本在10mMTris-HCl，0.2mM EDTA(pH7.4)(2×10秒脈沖(bursts)，用Waringblender的最大設(shè)置；3ml緩沖液1g蜈蚣)包含蛋白酶抑制劑的混合液(5mM EDTA，1μM胃酶抑制劑，1μM抑蛋白酶肽，100μM苯基甲基磺?；?中勻漿而得到。勻漿液在24,000g離心20分鐘后，碎片進(jìn)行如上所述的再勻漿、離心。合并兩次上清，并將其通過0.2μm醋酸纖維素濾器(Nalgene)。親蛤蚌毒素蛋白然后用40～60％硫酸銨從上清中沉淀出來，接著通過重新溶解在pH5.0-6.5的緩沖溶液中及離心得到包含親蛤蚌毒素蛋白的上清，從所述沉淀中除去非親蛤蚌毒素蛋白分子。
上清用玻璃纖維聚乙烯亞胺(PEI)載體基質(zhì)處理，后者通過將玻璃纖維用0.3％PEI的水溶液(v/v)孵育至少1小時(shí)以及在真空下除去PEI通過排水或抽吸進(jìn)行制備得到。親蛤蚌毒素蛋白用高鹽從基質(zhì)上洗脫下來，親蛤蚌毒素蛋白典型地用NaCl或KCl在從600mM到飽和濃度下，在pH5-9進(jìn)行洗脫。
進(jìn)一步純化通過在用100ml 25mM醋酸鈉(10mM MES-NaOH，EDTA(pH6.0)中)平衡的肝磷脂-瓊脂糖(凝膠)進(jìn)行色譜而實(shí)現(xiàn)，用300～800mM醋酸鈉的MES-NaOH，EDTA(pH6.0)溶液梯度洗脫親蛤蚌毒素蛋白。所述蛋白然后在PBE 118樹脂上進(jìn)行層析聚焦，用pH10.5的25mM三乙胺平衡，并且用包含8.9ml Polybuffer 96，1.8ml Pharmalyte 8-10.5的Polybuffer96溶液進(jìn)行洗脫，得到終體積為250ml，pH為8.0。用大小排阻色譜或脫鹽柱，例如Amersham PharmaciaBiotech的PD-10柱實(shí)現(xiàn)Polybuffer的去除以及緩沖液交換。
實(shí)施例2純化的親蛤蚌毒素蛋白在分析中的應(yīng)用a)診斷測試條本發(fā)明使用純化的親蛤蚌毒素蛋白來定性檢測PSTs的診斷試劑盒是測試條的形式。試劑盒使用固相基質(zhì)，或″芯(wick)″，反應(yīng)在其上發(fā)生。試劑盒在該固相基質(zhì)的一端有蛤蚌毒素帶，使用已知的″印刷″方法。該過程固定蛤蚌毒素，″印刷″蛤蚌毒素作為流過修飾的親蛤蚌毒素蛋白(下文將描述)錨定劑。如果修飾的親蛤蚌毒素蛋白已經(jīng)結(jié)合測試樣品中的PST，那么它就不能結(jié)合與″印刷″的蛤蚌毒素結(jié)合，將繼續(xù)流動，就沒有色斑的形成。如果受試樣品中沒有PSTs，則修飾的親蛤蚌毒素蛋白將結(jié)合到″印刷″的蛤蚌毒素帶上，形成有色斑點(diǎn)。為了使錨定的親蛤蚌毒素蛋白產(chǎn)生有色斑點(diǎn)，親蛤蚌毒素蛋白偶聯(lián)到膠體金或有色的膠乳微珠上。原理是膠體金，一種強(qiáng)成色試劑，當(dāng)偶聯(lián)的親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合到固定在膜上的STX時(shí)候，聚集成人眼可觀察的明顯斑點(diǎn)。當(dāng)其流過蛤蚌毒素的印刷帶時(shí)，將停滯并聚集，或繼續(xù)前進(jìn)，并不形成人眼可視的斑點(diǎn)。該過程示意性地在圖1中來進(jìn)行了說明。因此這種分析形式對樣品中PSTs的存在提供了定性的″是/否″分析。測試條提供了陽性對照。
另一個(gè)替代的方法是使用脂質(zhì)體封裝的染料。脂質(zhì)體提供了即時(shí)的增強(qiáng)，并且具有相當(dāng)大的自動分析的可能性。
實(shí)驗(yàn)體系是競爭性受體分析，并由包含包裹染料的蛤蚌毒素/生物素標(biāo)記的脂質(zhì)體的芯試劑以及塑料支撐的硝化纖維素條組成，其以向上的順序具有固定的親蛤蚌毒素蛋白競爭區(qū)以及脂質(zhì)體抗生物素蛋白捕獲區(qū)(圖2)。芯試劑以及包含未知量PSTs樣品的混合物通過毛細(xì)管作用沿測試條遷移。在親蛤蚌毒素蛋白區(qū)，發(fā)生與PSTs受體的競爭性結(jié)合。未結(jié)合的脂質(zhì)體，與樣品中蛤蚌毒素量成正比，被運(yùn)載到脂質(zhì)體捕獲區(qū)，在該區(qū)其被富集。親蛤蚌毒素蛋白區(qū)以及抗生物素蛋白區(qū)的顏色強(qiáng)度可通過視覺上或掃描密度測定儀(scanning densitometry)進(jìn)行估計(jì)。
固定的親蛤蚌毒素蛋白量必須盡可能的低以增加檢測PST的靈敏度，但也應(yīng)足夠的濃度，以便于脂質(zhì)體的視覺檢測。
典型的遷移分析需要大約100μL的樣品溶液，在少于10分鐘內(nèi)應(yīng)該能達(dá)到ppb的檢測水平，相應(yīng)于PSTs在低ng范圍內(nèi)的檢測限。脂質(zhì)體為高度穩(wěn)定的分子，可以在+4C保存至少1年的時(shí)間，在室溫可以保存數(shù)月。所述分析很方便用于現(xiàn)場檢測，不需要任何特殊的儀器或技能。該試劑盒可包括單個(gè)測試條使用的特殊容器(holder)，其中有便于加入樣品以及光學(xué)讀數(shù)的開口。這種低成本的親蛤蚌毒素蛋白遷移傳感器有利于方便及快速篩選環(huán)境樣品并構(gòu)成PSTs風(fēng)險(xiǎn)評估無可比擬的及可靠的工具。
(b)微量滴定板分析建立微量滴定板形式的分析方法可以使其滿足更復(fù)雜的應(yīng)用，并能得到定量結(jié)果。一種優(yōu)選的形式是結(jié)合抑制分析。將蛤蚌毒素包被到96孔微量滴定板上。測試樣品與標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白混合，并加到96孔板中。無毒素樣品不能阻止標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白與96孔板包被孔表面的蛤蚌毒素的結(jié)合，形成有色區(qū)域。包含毒素的樣品抑制有色形成，抑制程度與存在的毒素量成比例。然后用分光光度讀板器進(jìn)行讀數(shù)并對毒素進(jìn)行定量。
進(jìn)一步可能的PSTs定量技術(shù)包括高效液相色譜，偶聯(lián)有柱后(post-column)氧化體系及熒光檢測器。該方法復(fù)雜且需要昂貴的PSTs標(biāo)準(zhǔn)品。但是，通過表面等離子體共振(SPR)方法的靈敏檢測，合并高特異基于親蛤蚌毒素蛋白的鑒定，克服了色譜技術(shù)相關(guān)的缺點(diǎn)。
所述裝置需要PST，例如蛤蚌毒素偶聯(lián)到活化的金表面，在分析的過程中與液體樣品接觸。SPR傳感器檢測由在金屬液體界面折射率變化引起的激光反射變化。因此，當(dāng)蛤蚌毒素偶聯(lián)到傳感器的活化金表面的時(shí)候，由親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合誘導(dǎo)折射率發(fā)生改變(圖4)。在這種PSTs為樣品的情況下，在游離PSTs和結(jié)合的蛤蚌毒素之間發(fā)生競爭，產(chǎn)生的信號下降值可以定量。
這種流動-注射(flow-injection)受體分析由下列步驟組成i)試劑泵送及樣品注射系統(tǒng)，ii)混合池(mixing cell)，在這里發(fā)生競爭性受體分析以及iii)SPR傳感器，包括流動池及光學(xué)裝置裝置(圖5)。該體系可完全自動化，如BiacoreAB制造的BIACORE 2000。
實(shí)施例3親和柱制備通過將親蛤蚌毒素蛋白連接到固相，其與蛤蚌毒素的結(jié)合能力可用來從液體樣品中分離出蛤蚌毒素，所述樣品流過親蛤蚌毒素蛋白連接的固相載體。由于與蜈蚣親蛤蚌毒素蛋白的結(jié)合為pH依賴的，結(jié)合的毒素然后可以洗脫。
親蛤蚌毒素蛋白親和柱的制備分離的親蛤蚌毒素蛋白用來制備親和柱，使用UltralinkTM試劑盒(PierceChemical Company制造)。所述樹脂使用噁唑酮偶聯(lián)化學(xué)，并使用具有介質(zhì)快速沖洗特性的惰性半剛性(semi-rigid)樹脂。
所述方法按下述步驟進(jìn)行1.硫酸銨沉淀的親蛤蚌毒素蛋白重新懸浮于Pierce提供的偶聯(lián)緩沖液(BupH檸檬酸鹽-碳酸鹽緩沖液，pH9)中。
2.重新溶解的親蛤蚌毒素蛋白加到0.15g的3M Emphaze生物載體介質(zhì)AB1(Pierce提供)，后者可使樹脂水合并使可利用的蛋白結(jié)合。樹脂膨脹到1ml。
3.1小時(shí)的輕微混合后，樹脂和親蛤蚌毒素蛋白配制品裝填到微柱中，并且樹脂沉降。
4.然后用用磷酸鹽緩沖液(15mls)洗柱。
5.然后加入4ml終止緩沖液(3M乙醇胺，pH9.0)，在這種緩沖液中輕微混合樹脂2.5小時(shí)。
6.然后用15ml磷酸鹽緩沖液洗柱。
7.用帶孔的圓塞(disk insert)密封樹脂上部。
8.用15ml 1M NaCl洗柱9.用15ml 100mM HEPES-NaOH(pH7.4)洗柱，可以用來測試結(jié)合蛤蚌毒素的能力。
柱結(jié)合蛤蚌毒素能力的測試氚標(biāo)的蛤蚌毒素(Amersham Pharmacia Biotech)用來測量柱結(jié)合蛤蚌毒素的能力。
3等份發(fā)2μl的3H-STX(60nM)計(jì)數(shù)用閃爍計(jì)數(shù)器來測量應(yīng)用到柱的放射性。這些等份樣每分鐘包含2113±42記數(shù)(cpm)。
200μl的3H-STX(＝211，300cpm-參見上述說明)加到柱上，并流進(jìn)樹脂中。3H-STX用商品供應(yīng)的3H-STX(在含2％乙醇0.01M醋酸溶液中)用1mM檸檬酸緩沖液(pH5.0)進(jìn)行150倍的稀釋制備得到。柱然后用5ml 100mM HEPES-NaOH(pH7.4)洗。收集流出的液體。柱然后依次用5ml的下列溶液洗，分別收集每一種洗脫的樣品第二次洗(2ndwash)100mM HEPES-NaOH(pH7.4)第三次洗100mM HEPES-NaOH(pH7.4)100mM HEPES-NaOH(pH6.0)100mM HEPES-NaOH(pH5.0)0.001N HCl0.005N HCl0.01N HCl0.05N HCl0.1N HCl0.5N HCl。
洗脫放射性描述在圖6中。
可以看出，有兩個(gè)放射性主峰。在第一級分中的第一個(gè)洗脫液基本上未結(jié)合柱的物質(zhì)。第二峰用100mM HEPES-NaOH pH5.0洗脫。氚標(biāo)的蛤蚌毒素包含游離氚，因此這兩個(gè)峰通過測量其與兩個(gè)已知的蛤蚌毒素受體，即鈉通道及親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合的能力，來測試其生物活性。
從親蛤蚌毒素蛋白柱洗脫峰生物活性的測量分析條件是鈉通道100mM MOPS-NaOH(pH7.4)，100mM氯化膽堿，100μl的組分1和5(洗以及分別用第一次pH7.4洗，pH5.0洗)，10μl包含鈉通道的大鼠腦囊(vesicles)，終體積為250μl。樣品制備成雙份；也設(shè)置陰性對照，包含過量的非標(biāo)記的河豚毒素，用來進(jìn)行確定任何結(jié)合的3H-STX特異水平。
親蛤蚌毒素蛋白100mM MOPS-NaOH(pH7.4)，100mM氯化鈉，100μl的級分1和5(洗以及分別第一次pH7.4洗，pH5.0洗)，1.5μl表征的蜈蚣親蛤蚌毒素蛋白配制品，終體積為250μl。樣品制備成雙份；也設(shè)置陰性對照，包含過量的未標(biāo)記的蛤蚌毒素，用來確定的任何結(jié)合的3HSTX特定水平。
從圖7中可以看出，只有pH5.0的放射性的柱洗脫峰保留生物活性，即其可與兩個(gè)已知的蛤蚌毒素受體結(jié)合。pH7.4峰不包含任何這種生物活性(除了親蛤蚌毒素蛋白分析中最少量的受體結(jié)合活性)表明放射性為未摻入到蛤蚌毒素中的氚所導(dǎo)致(商品供應(yīng)3H-STX的已知性質(zhì))。
初處理后柱穩(wěn)定評價(jià)用最終的0.5N HCl洗后，柱用20ml的100mM HEPES-NaOH(pH7.4)洗，4℃保存過夜。移出該柱并恢復(fù)到室溫，重復(fù)上述洗脫實(shí)驗(yàn)，得到圖8中的曲線圖。
可以看出，有活性的第二峰遷移到洗脫用HEPES-NaOH(pH7.4)進(jìn)行的第3次沖洗的洗脫，表明親蛤蚌毒素蛋白有降解。這些峰沒有進(jìn)行生物活性測試。
因此可以理解親蛤蚌毒素蛋白可以結(jié)合到固相色譜樹脂上，如Pierce的Emphaze生物載體介質(zhì)AB1。在該柱上蛤蚌毒素可被親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合并與其它物質(zhì)分離(如游離的氚)，然后蛤蚌毒素可用pH5.0的緩沖液從柱上洗脫下來。洗脫的蛤蚌毒素保留生物活性。用酸(如0.5N HCl)處理可能會裂解連接的親蛤蚌毒素蛋白。處理后的樹脂的3H-STX非特異保留作用不明顯。
對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言很明顯的是盡管本發(fā)明為了說明清楚和便于理解，進(jìn)行了詳細(xì)的描述，也可以對上述描述的技術(shù)方案和方法的進(jìn)行一些修改和改變，只要不偏離本說明書中公開的發(fā)明觀點(diǎn)的范圍。
上述引用的參考文獻(xiàn)都列在下頁，引入作為參考文獻(xiàn)。
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權(quán)利要求
1.一種檢測和/或測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)量的方法，包括下列步驟1)提供分離的親蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段；2)將其與樣品接觸；3)測量PSTs與分離的親蛤蚌毒素蛋白的結(jié)合量；以及4)將結(jié)合量與樣品中的PSTs的有無或樣品中PST濃度相關(guān)聯(lián)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其中分離的親蛤蚌毒素蛋白，或其片段，偶聯(lián)到可檢測的標(biāo)記物上以提供標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白。
3.一種如權(quán)利要求2所述的方法，其中預(yù)定量的標(biāo)記親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合固定的PST，樣品中缺失PST時(shí)其結(jié)合達(dá)到預(yù)定的程度，但樣品中存在PST時(shí)達(dá)到較少的程度。
4.一種如權(quán)利要求3所述的方法，其中標(biāo)記物選自熒光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，膠體金，膠乳微珠和酶標(biāo)記物。
5.一種如權(quán)利要求4所述的方法，其中標(biāo)記物選自膠體金和有色膠乳微珠以提供可視信號。
6.一種如權(quán)利要求5所述的方法，其中PST被印刷到測試條上，并通過標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白與其的結(jié)合形成有色的顏色點(diǎn)，產(chǎn)生可視信號。
7.一種如權(quán)利要求2所述的方法，其中標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白包含在以及PST固定在微量滴定板的孔中，用分光光度板讀板器測量形成顏色的程度。
8.一種如權(quán)利要求7所述的方法，其中PST包被到微量滴定板的孔上。
9.一種如權(quán)利要求3或8中所述的方法，其中固定的PST為蛤蚌毒素。
10.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其中分離的親蛤蚌毒素蛋白固定到固體支持物上。
11.一種如權(quán)利要求10所述的方法，其中固體支持物為測試條。
12.一種如權(quán)利要求11所述的方法，其中標(biāo)記的PST結(jié)合到分離的親蛤蚌毒素蛋白，其濃度達(dá)到在樣品中缺少PST時(shí)其結(jié)合達(dá)到預(yù)定的程度，但當(dāng)樣品中存在PST時(shí)結(jié)合的程度較小。
13.一種如權(quán)利要求12所述的方法，其中PST為蛤蚌毒素。
14.一種如權(quán)利要求13所述的方法，其中標(biāo)記為蛤蚌毒素結(jié)合到脂質(zhì)體上的脂質(zhì)體封裝染料。
15.一種如權(quán)利要求14所述的方法，其中脂質(zhì)體上還有與其結(jié)合的生物素。
16.一種如權(quán)利要求15所述的方法，其中樣品首先通過蛤蚌毒素固定區(qū)，然后通過包括抗生物素蛋白的脂質(zhì)體捕獲區(qū)進(jìn)行分析。
17.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其中用分光光度法測量結(jié)合到分離的親蛤蚌毒素蛋白上的PSTs。
18.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過檢測一旦結(jié)合，質(zhì)量或折射率的變化來測量結(jié)合到分離的親蛤蚌毒素蛋白上的PSTs。
19.一種如權(quán)利要求18所述的方法，一種使用表面等離子體共振(SPR)傳感器。
20.一種如權(quán)利要求1～19中任一項(xiàng)所述的方法，其中分離的親蛤蚌毒素蛋白為蜈蚣親蛤蚌毒素蛋白。
21.一種如權(quán)利要求20所述的方法，其中分離的親蛤蚌毒素蛋白來自Ethmostigmus rubripes。
22.一種測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)的方法，包括下列步驟(a)用聚陽離子預(yù)處理微量滴定過濾板的濾器；(b)向板孔中加入已知量的包含親蛤蚌毒素蛋白的標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白，或包含用可檢測標(biāo)志物表記的蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的其片段，以及懷疑包括致癱瘓水生有殼類動物毒素物質(zhì)的系列稀釋液；(c)將板孵育足夠長的時(shí)間以使存在的致癱瘓水生有殼類動物毒素與標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合；(d)通過孔濾器吸出每孔中的內(nèi)溶物，以除去除了標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白及與其結(jié)合的化合物之外的成分；(e)清洗每孔及濾器以除去殘留的未結(jié)合的化合物；以及(f)檢測濾器保留的標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白量，其中標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白的結(jié)合程度當(dāng)與對照樣品相比時(shí)，就可以表明樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素的存在量。
23.一種如權(quán)利要求22所述的方法，其中樣品包括緩沖液，以保持pH在6.5～9的范圍內(nèi)。
24.一種如權(quán)利要求23所述的方法，其中樣品進(jìn)一步包括氯化物鹽，如氯化鈉或氯化鉀，濃度可高達(dá)500mM。
25.一種如權(quán)利要求22～24中任一項(xiàng)所述的方法，其中每孔中的總體積為50～350μl，優(yōu)選100～200μl，更優(yōu)選150μl。
26.一種如權(quán)利要求22～25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟(c)中，在0～30℃下，優(yōu)選在室溫下，孵育30分鐘～8小時(shí)；優(yōu)選進(jìn)行60～120分鐘，更優(yōu)選進(jìn)行90分鐘。
27.一種如權(quán)利要求22～26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟(e)中，清洗用與樣品pH等同的緩沖溶液進(jìn)行。
28.一種如權(quán)利要求22～27中任一項(xiàng)所述的方法，其中分離和純化的親蛤蚌毒素蛋白為蜈蚣親蛤蚌毒素蛋白。
29.一種如權(quán)利要求28所述的方法，其中分離和純化的親蛤蚌毒素蛋白來自Ethmostigmus rubripes。
30.偶聯(lián)到固體載體上的分離的親蛤蚌毒素蛋白。
31.用可檢測的標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記的分離的親蛤蚌毒素蛋白。
32.一種測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)量的試劑盒，包括(a)微量滴定板；(b)標(biāo)記的親蛤蚌毒素蛋白，包括用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的分離的親蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段；(c)提取緩沖液，用來對待測物質(zhì)或生物體或組織進(jìn)行提取；以及任選地(d)一種富集方法，用于富集提取液中的PSTs或除去可能干擾分析的污染物。
33.一種如權(quán)利要求32所述的試劑盒，其中濃縮方法為柱或柱體，包括偶聯(lián)有分離和純化親蛤蚌毒素蛋白的固體支持材料。
34.一種測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)量的裝置，包括固定的親蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段；將樣品與所述固定的親蛤蚌毒素蛋白，或其片段接觸的裝置；測量樣品中包含的PSTs與所述固定親蛤蚌毒素蛋白，或其片段結(jié)合量的裝置；以及將結(jié)合量與樣品中PSTs的有無或PST濃度進(jìn)行關(guān)聯(lián)的方法。
35.一種如權(quán)利要求34所述的裝置，其中固定的親蛤蚌毒素蛋白為蜈蚣親蛤蚌毒素蛋白。
36.一種如權(quán)利要求35所述的裝置，其中固定的親蛤蚌毒素蛋白來自Ethmostigmus rubripes。
37.一種如權(quán)利要求34～36中任一項(xiàng)所述的裝置，包括診斷測試條，其包括固定親蛤蚌毒素蛋白區(qū)。
38.一種如權(quán)利要求37所述的裝置，進(jìn)一步包括抗生物素蛋白區(qū)，其位置比固定的親蛤蚌毒素蛋白區(qū)，更遠(yuǎn)離測試條的樣品導(dǎo)入端。
39.一種診斷測試條，包括毛細(xì)芯，其包括親蛤蚌毒素蛋白固定其上的區(qū)以及遠(yuǎn)離毛細(xì)芯端的結(jié)合抗生物素蛋白的區(qū)。
40.一種試劑盒，包括如權(quán)利要求39定義的診斷測試條，蛤蚌毒素和生物素標(biāo)記的脂質(zhì)體封裝染料以及，任選地，緩沖溶液。
41.一種用來測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)量的生物傳感器，包括固定的親蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)片段；將樣品與所述固定的親蛤蚌毒素蛋白，或其片段接觸的裝置；測量樣品中包含的PSTs與所述固定的親蛤蚌毒素蛋白，或其片段結(jié)合量的裝置；以及將結(jié)合事件轉(zhuǎn)變成電信號并且將結(jié)合量與樣品中PSTs的有無或PSTs的濃度相關(guān)聯(lián)的裝置。
42.一種如權(quán)利要求41所述的生物傳感器，其中將結(jié)合事件轉(zhuǎn)化成電信號的裝置包括可以檢測一旦結(jié)合蛋白質(zhì)量變化的裝置。
43.一種如權(quán)利要求42所述的生物傳感器，其中固定的親蛤蚌毒素蛋白為包含蛤蚌毒素結(jié)合的親蛤蚌毒素蛋白片段，一旦結(jié)合可以最佳地表現(xiàn)出質(zhì)量變化。
44.一種如權(quán)利要求41～43中任一項(xiàng)所述的生物傳感器，其中固定的親蛤蚌毒素蛋白為蜈蚣親蛤蚌毒素蛋白。
45.一種如權(quán)利要求44所述的生物傳感器，其中固定的親蛤蚌毒素蛋白來自Ethmostigmus rubripes。
46.一種用于測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)量的裝置，包括固定的PST；將樣品與所述固定PST接觸的裝置；測量加到樣品中的親蛤蚌毒素蛋白結(jié)合的，或其包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段，與所述固定的PST結(jié)合的裝置；以及用來關(guān)聯(lián)結(jié)合量與PSTs存在或缺失或與樣品中PST濃度的方法。
47.一種如權(quán)利要求所述46的裝置，其中PST為蛤蚌毒素。
48.一種如權(quán)利要求所述47的裝置，其中蛤蚌毒素被印刷到診斷測試條上。
49.一種蛤蚌毒素印刷在其上的診斷測試條。
50.一種用來測量樣品中存在的致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)量的生物傳感器，包括固定的PST；將樣品與所述固定PST接觸的方法；測量加到樣品中親蛤蚌毒素蛋白或包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)片段的方法，與所述固定的PST結(jié)合的裝置；以及將結(jié)合結(jié)果轉(zhuǎn)換成電信號以及結(jié)合量與PSTs存在或缺失或樣品中PST濃度的關(guān)聯(lián)方法。
51.一種如權(quán)利要求41～43中任何一項(xiàng)所述的生物傳感器，其中固定的PST為蛤蚌毒素。
52.一種純化無脊椎動物親蛤蚌毒素蛋白的方法，包括下列步驟(a)在包括蛋白酶抑制劑的生理緩沖液中勻漿產(chǎn)生親蛤蚌毒素蛋白的節(jié)肢動物物種個(gè)體；(b)將勻漿物進(jìn)行低速離心除去細(xì)胞碎片；(c)將從步驟(b)得到的上清進(jìn)行高速離心；(d)用硫酸銨從上清中沉淀出親蛤蚌毒素蛋白。
53.一種如權(quán)利要求52所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟(e)純化沉淀的親蛤蚌毒素蛋白。
54.一種如權(quán)利要求53所述的方法，其中親蛤蚌毒素蛋白用下列方法純化(i)將沉淀物在pH5.0～6.5進(jìn)行再溶解并離心除去非親蛤蚌毒素蛋白分子；(ii)將從(i)得到的上清與結(jié)合親蛤蚌毒素蛋白的基質(zhì)例如玻璃纖維聚乙烯亞胺(PEI)支持基質(zhì)接觸；以及(iii)在高鹽條件下從基質(zhì)上洗脫結(jié)合的物質(zhì)。
55.一種如權(quán)利要求54所述的方法，其中親蛤蚌毒素蛋白用溶解于pH5-9的緩沖液中的、濃度為600mM至飽和的NaCl或KCl洗脫。
56.一種如權(quán)利要求52所述的方法，其中親蛤蚌毒素蛋白用40-60％硫酸銨沉淀。
57.一種如權(quán)利要求52～56中任一項(xiàng)所述的方法，其中節(jié)肢動物為蜈蚣。
58.一種如權(quán)利要求57所述的方法，其中蜈蚣為Ethmostigmus rubripes。
59.用權(quán)利要求52～58中任何一項(xiàng)中所述的方法制備的親蛤蚌毒素蛋白。
60.一種富集，純化和/或提取致癱瘓水生有殼類動物毒素(PSTs)的方法，包括下列步驟提供固定的親蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段；將懷疑包含PST的樣品與所述的固定親蛤蚌毒素蛋白接觸足夠的時(shí)間，使PST結(jié)合到固定的親蛤蚌毒素蛋白上；并且任選地，從固定的親蛤蚌毒素蛋白上洗脫結(jié)合的PST。
61.一種如權(quán)利要求60所述的方法，其中固定的親蛤蚌毒素蛋白為蜈蚣親蛤蚌毒素蛋白。
62.一種如權(quán)利要求61所述的方法，其中固定的親蛤蚌毒素蛋白來自Ethmostigmus rubripes。
63.一種如權(quán)利要求60～62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法用來使水生有殼類動物解毒。
64.一種如權(quán)利要求60～62中任一項(xiàng)所述的方法，其中PSTs提取自飲用水。
65.將分離的親蛤蚌毒素蛋白用于制備親和材料，用來富集、純化和/或提取致癱瘓水生有殼類動物毒素。
66.一種用來富集、純化和/或提取致癱瘓水生有殼類動物毒素的親和材料，包括分離的親蛤蚌毒素蛋白，或其包含偶聯(lián)到固相載體上的蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的其片段。
67.一種如權(quán)利要求66中所述的親和材料，其中固相載體裝填在柱體或柱中。
68.一種如權(quán)利要求66～67中任一項(xiàng)所述的親和材料，其中固相載體選自噁唑酮偶聯(lián)基質(zhì)，溴化氰活化基質(zhì)；環(huán)氧活化基質(zhì)；羧基甲基纖維素酰肼；聚丙烯酰胺酰肼和環(huán)氧乙烷丙烯酸的珠。
全文摘要
一種檢測和/或測量樣品中致癱瘓水生有殼類動物毒素(PST)數(shù)量的方法，包括下述步驟1)提供分離和純化的親蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)的片段；2)將其與樣品接觸；3)測量樣品中PST與所述分離和純化的親蛤蚌毒素蛋白的結(jié)合；并且將結(jié)合量與樣品中的PST的有無或樣品中PST濃度相關(guān)聯(lián)。
文檔編號G01N33/544GK1559007SQ01822580
公開日2004年12月29日 申請日期2001年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月12日
發(fā)明者林登·E·盧埃林, 詹姆斯·N·伯內(nèi)爾, 錫德里克·羅比洛特, N 伯內(nèi)爾, 克 羅比洛特, 林登 E 盧埃林 申請人:澳大利亞海洋科學(xué)研究院, 詹姆斯·庫克大學(xué)