專利名稱：修飾的動(dòng)物促紅細(xì)胞生成素多肽和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)至少一個(gè)非天然編碼的氨基酸修飾的貓、犬和馬促紅細(xì)胞生成素多肽。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)激素(GH)超基因家族(貝贊F. (Bazan, F.)，現(xiàn)代免疫學(xué)(Immunology Today)，11 :350-354(1991)；莫特 H. R. (Mott，H. R.)和坎貝爾 I. D. (Campbell，I. D.)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的當(dāng)前觀點(diǎn)(Current Opinion in Structural Biology) 5 :114-121 (1995)；西文諾曼0. (Silvennoinen, 0.)和艾利J. N. (Ihle，J. N.) (1996)造血細(xì)胞因子受體的信號(hào)傳導(dǎo)(SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS))代表了一組具有類似結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)。盡管這一家族中仍有較多的成員有待鑒別，但一些家族成員包括下述各物 生長(zhǎng)激素、催乳激素、胎盤(pán)催乳素、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，ΕΡ0)、血栓形成素 (thrombopoietin, ΤΡ0)、白細(xì)胞介素 _2 (IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、 IL-IU IL-12(p35亞基)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、白血病抑制因子、 α干擾素、β干擾素、Y干擾素、ω干擾素、τ干擾素、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)Ifi - (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)和心肌營(yíng)養(yǎng)素-1(0虹肚0廿叩1^11-1，01-1)( “GH超基因家族”)。盡管GH超基因家族的成員一般具有有限的氨基酸或DNA序列一致性，但其具有類似的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。共有的結(jié)構(gòu)特征使得易于鑒別出基因家族的新成員。GH超基因家族的一個(gè)成員是貓促紅細(xì)胞生成素(feline erythropoietin，fEPO)。 天然存在的促紅細(xì)胞生成素(EPO)是在哺乳動(dòng)物腎臟和肝中產(chǎn)生的分子量為34千道爾頓 (kDa)的糖蛋白激素。EPO是紅細(xì)胞生成過(guò)程中的關(guān)鍵組分，可誘導(dǎo)祖先紅細(xì)胞增殖和分化。EPO的活性還與包括球蛋白和碳酸酐酶在內(nèi)的多種紅細(xì)胞特異性基因的活化相關(guān)。例如參見(jiàn)邦德倫特(Bondurant)等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol. Cell Biol.) 5 :675-683(1985)； 考雷(Koury)等人，細(xì)胞生理學(xué)雜志(J. Cell. Physiol. ) 126 :259-265 (1986)。促紅細(xì)胞生成素受體(EpoR)是造血/細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子受體家族的成員，這一家族包括數(shù)種其它生長(zhǎng)因子受體，例如白細(xì)胞介素(IL)-3、IL-4和IL-6受體、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)受體以及催乳激素和生長(zhǎng)激素受體。參見(jiàn)貝贊(Bazan)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci USA) 87 :6934-6938 (1990)。細(xì)胞因子受體家族的成員含有4個(gè)保守半胱氨酸殘基和剛好位于跨膜區(qū)外部的色氨酸-絲氨酸-X-色氨酸-絲氨酸基序。這些保守序列被認(rèn)為涉及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。例如參見(jiàn)千葉(Chiba)等人，生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochim. Biophys. Res. Comm) 184 :485-490 (1992)。美國(guó)專利第5，441，868 號(hào)、第 5，547，933 號(hào)、第 5，618，698 號(hào)和第 5，621，080 號(hào)描述了編碼人EPO的DNA序列，以及具有天然存在的EPO的部分或全部一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象和生物特性的分離多肽。
EPO的生物作用是來(lái)源于其與特定細(xì)胞受體的相互作用。人們已經(jīng)充分了解了 EPO與其受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(EPObp)之間的相互作用。高分辨率χ射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)顯示， EPO具有兩個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)，并依序使用分子上的不同位點(diǎn)結(jié)合兩個(gè)受體分子。這兩個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)稱為位點(diǎn)I和位點(diǎn)II。位點(diǎn)I包括螺旋D的羧基末端以及部分螺旋A和A-B環(huán)， 而位點(diǎn)II涵蓋螺旋A的氨基末端區(qū)和一部分螺旋C。EPO與其受體的結(jié)合是依序發(fā)生的， 其中位點(diǎn)I首先結(jié)合。接著，位點(diǎn)Π與第二個(gè)EPO受體接合，引起受體二聚化以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)路徑的活化，從而產(chǎn)生細(xì)胞對(duì)激素的反應(yīng)。重組人EPO可用作治療劑，并且已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療人類個(gè)體。EPO缺乏會(huì)引起貧血，例如，這已經(jīng)通過(guò)外源投予激素成功地進(jìn)行治療。貧血可大致分為兩類再生性和非再生性貧血。再生性貧血傾向于由失血引起，或是由免疫系統(tǒng)引起紅細(xì)胞破壞所致。另一方面，非再生性貧血是骨髓沒(méi)有或無(wú)法對(duì)貧血作出反應(yīng)的病癥。引起貧血的常見(jiàn)原因是慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)，而其它病例中大部分是由感染貓白血病毒(feline leukemia virus, FeLV)所引起。這兩種病癥是導(dǎo)致寵物貓死亡的1號(hào)O^LV)和2號(hào)(CRF)原因。人們已經(jīng)使用hEPO來(lái)治療貓貧血。 不幸的是，當(dāng)使用hEPO治療貓貧血時(shí)，會(huì)出現(xiàn)有關(guān)免疫原性的問(wèn)題，而且用hEPO治療的貓中約25%到33%出現(xiàn)紅細(xì)胞再生障礙性貧血(red cell aplasia，RCA)。曾進(jìn)行了多項(xiàng)研究，包括用重組hEPO治療患有CRF的11只貓和6只狗的研究，盡管重組hEPO在某種程度上顯示出增加紅細(xì)胞(RBC)和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的能力，但11只貓中有5只產(chǎn)生了抗r-hEPO抗體(LD考基爾(LD Cowgill)等人，美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)雜志(J Am Vet Med Assoc.) 1998年2月 15日；212 ) :521-8)。利用沈只測(cè)試貓個(gè)體進(jìn)行了有關(guān)重組貓促紅細(xì)胞生成素(rfEPO) 的安全性和功效的研究，發(fā)現(xiàn)盡管RBC和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)也有所升高，但沈只貓中有8只 (即，超過(guò)30% )產(chǎn)生了抗r-fEP0抗體(JE雷多夫(JE Randolph)等人，美國(guó)獸醫(yī)研究雜志(Am J Vet Res.) 2004年10月；65(10) =1355-66) 在另一項(xiàng)研究中，對(duì)由10只貓構(gòu)成的研究組投予含有貓促紅細(xì)胞生成素cDNA的重組2型腺相關(guān)病毒(rAAW)載體，發(fā)現(xiàn)在所有用載體處理的貓中都檢測(cè)到了 rAAV2抗體，1只貓患上純紅細(xì)胞再生障礙性貧血，而用較低量處理的貓未顯示出作用(MC沃克(MC Walker)等人，美國(guó)獸醫(yī)研究雜志(Am J Vet Res. )2005 年 3 月；66 (3) :450-6)。共價(jià)連接親水性聚合物聚(乙二醇)(縮寫(xiě)為PEG)是一種增加許多生物活性分子 (包括蛋白質(zhì)、肽，尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率；增加血清半衰期；增加治療半衰期；調(diào)節(jié)免疫原性；調(diào)節(jié)生物活性；或延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間的方法。PEG已被廣泛用于醫(yī)藥品或人工移植物以及生物相容性、無(wú)毒和無(wú)免疫原性極為重要的其它應(yīng)用中。為了使PEG的所需特性最大化，與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態(tài)必須足夠高， 以便賦予通常與PEG聚合物連接相關(guān)的有利特征，例如增加的水溶性和循環(huán)半衰期，同時(shí)不會(huì)不利地影響母體分子的生物活性。PEG衍生物常常是通過(guò)反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)(例如賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基、N末端和碳水化合物部分)與生物活性分子鍵聯(lián)。蛋白質(zhì)和其它分子通常具有少數(shù)反應(yīng)性位點(diǎn)可供聚合物連接。通常，最適于經(jīng)由聚合物連接而修飾的位點(diǎn)在受體結(jié)合中起到重要作用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，不加選擇地將聚合物鏈與生物活性分子上的這些反應(yīng)性位點(diǎn)連接，通常會(huì)使經(jīng)聚合物修飾的分子的生物活性顯著降低或甚至完全喪失。R.克拉克(R. Clark)等人，(1996)，牛物化學(xué)雜志(T. Biol. Chem.)，271 21969-21977。為了形成具有足夠聚合物分子量以賦予目標(biāo)分子所需優(yōu)勢(shì)的結(jié)合物，現(xiàn)有技術(shù)方法通常涉及將多個(gè)聚合物臂與分子隨機(jī)連接，由此增加了母體分子生物活性降低乃至完全喪失的風(fēng)險(xiǎn)。形成PEG衍生物與蛋白質(zhì)的連接點(diǎn)的反應(yīng)性位點(diǎn)可由蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)指示。蛋白質(zhì) (包括酶)是由各種α-氨基酸序列構(gòu)成，這些序列的一般結(jié)構(gòu)為H2N--CHR--C00H。一個(gè)氨基酸的α氨基部分(H2N-)與相鄰氨基酸的羧基部分(一C00H)連接形成酰胺鍵，其可表示為一(NH--CHR--CO)n--,其中下標(biāo)“η”可等于數(shù)百或數(shù)千。R表示的片段可含有關(guān)于蛋白質(zhì)生物活性和連接PEG衍生物的反應(yīng)性位點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，在氨基酸賴氨酸的情況下，在ε位以及α位中存在一NH2部分。 ε -NH2在堿性ρΗ條件下自由反應(yīng)。用PEG進(jìn)行蛋白質(zhì)衍生化領(lǐng)域中的很多技術(shù)都是針對(duì)開(kāi)發(fā)用于連接蛋白質(zhì)中存在的賴氨酸殘基的ε-NH2部分的PEG衍生物?！坝糜谙冗M(jìn)聚乙二醇化技術(shù)的聚乙二醇禾口 行生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation) ”，奈克塔分子工程目錄(Nektar Molecular Engineering Catalog)，2003，第 1-17頁(yè)。然而，這些PEG衍生物都具有共有的局限性，即，無(wú)法將其選擇性地安裝于蛋白質(zhì)表面上存在的常見(jiàn)的多種賴氨酸殘基上。在賴氨酸殘基對(duì)于蛋白質(zhì)活性極為重要(例如存在于酶活性位點(diǎn)中)的情況下，或在賴氨酸殘基對(duì)于介導(dǎo)蛋白質(zhì)與其它生物分子的相互作用起作用的情況下，如在受體結(jié)合位點(diǎn)的情況下，這將會(huì)成為顯著的局限性?，F(xiàn)有蛋白質(zhì)聚乙二醇化方法的另一同等重要的難題在于，PEG衍生物可與除所需殘基外的其它殘基發(fā)生不必要的副反應(yīng)。組氨酸含有結(jié)構(gòu)以一N(H)--表示的反應(yīng)性亞氨基部分，而許多與ε -NH2反應(yīng)的衍生物也可與一N(H)--反應(yīng)。類似地，氨基酸半胱氨酸的側(cè)鏈具有游離硫氫基，結(jié)構(gòu)以-SH表示。在一些情況下，針對(duì)賴氨酸ε--ΝΗ2基團(tuán)的PEG衍生物也與半胱氨酸、組氨酸或其它殘基反應(yīng)。這樣可產(chǎn)生經(jīng)PEG衍生化的生物活性分子的復(fù)雜不均勻混合物，并且有破壞目標(biāo)生物活性分子活性的風(fēng)險(xiǎn)。需要開(kāi)發(fā)出這樣的PEG衍生物，其允許在蛋白質(zhì)內(nèi)的單一位點(diǎn)引入化學(xué)官能團(tuán)，隨后使一種或一種以上PEG聚合物能夠在蛋白質(zhì)表面上明確界定且可預(yù)測(cè)的特定位點(diǎn)與生物活性分子選擇性偶合。除賴氨酸殘基外，此項(xiàng)技術(shù)中還曾就開(kāi)發(fā)靶向其它氨基酸側(cè)鏈(包括半胱氨酸、組氨酸和N末端)的活性PEG試劑進(jìn)行了大量嘗試。美國(guó)專利第6，610，281號(hào)。“用于先進(jìn)聚乙二醇化技術(shù)的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation)，，，奈克塔分子工禾呈目錄(Nektar Molecular Engineering Catalog)，2003，第1_17頁(yè)。可以使用定點(diǎn)誘變和此項(xiàng)技術(shù)中已知的其它技術(shù)，將半胱氨酸殘基位點(diǎn)選擇性地引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，并且由此得到的游離硫氫基部分可與具有硫醇反應(yīng)性官能團(tuán)的PEG衍生物反應(yīng)。但這種方法比較麻煩，因?yàn)橐胗坞x硫氫基會(huì)使所得蛋白質(zhì)的表達(dá)、折疊和穩(wěn)定性變得復(fù)雜。因此，需要具有一種將化學(xué)官能團(tuán)引入生物活性分子中的方式，其能使一種或一種以上PEG聚合物與蛋白質(zhì)選擇性偶合，同時(shí)還與硫氫基以及蛋白質(zhì)中常見(jiàn)的其它化學(xué)官能團(tuán)相容(即，不會(huì)與之發(fā)生不必要的副反應(yīng))。從此項(xiàng)技術(shù)的抽樣(sampling)中可以了解到，所開(kāi)發(fā)的用于連接蛋白質(zhì)側(cè)鏈，尤其賴氨酸氨基酸側(cè)鏈上的一NH2部分和半胱氨酸側(cè)鏈上的-SH部分的許多此類衍生物都證實(shí)在合成和使用方面存在問(wèn)題。一些衍生物與蛋白質(zhì)形成不穩(wěn)定鍵，這些鍵將經(jīng)歷水解，并因此分解、降解，或者以其它方式在水性環(huán)境(例如血流)中不穩(wěn)定。一些衍生物可形成較為穩(wěn)定的鍵，但會(huì)在形成鍵之前經(jīng)歷水解，這意味著PEG衍生物上的反應(yīng)性基團(tuán)可能會(huì)在連接蛋白質(zhì)之前就失活。一些衍生物略帶毒性，因此不太適于體內(nèi)使用。一些衍生物反應(yīng)過(guò)慢而無(wú)法實(shí)際使用。一些衍生物會(huì)因連接到負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)活性的位點(diǎn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性喪失。一些衍生物對(duì)其將連接的位點(diǎn)不具特異性，這也會(huì)導(dǎo)致喪失所需活性以及缺乏結(jié)果的可再現(xiàn)性。為了克服用聚(乙二醇)部分修飾蛋白質(zhì)所帶來(lái)的問(wèn)題，人們開(kāi)發(fā)出了更為穩(wěn)定(例如，美國(guó)專利第6，602，498號(hào))或與分子和表面上的硫醇部分選擇性反應(yīng)(例如，美國(guó)專利6，610，觀1)的PEG衍生物。此項(xiàng)技術(shù)中無(wú)疑需要在生理環(huán)境中具化學(xué)惰性，而只有在需要的情況下才選擇性反應(yīng)形成穩(wěn)定化學(xué)鍵的PEG衍生物。近來(lái)，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了蛋白質(zhì)科學(xué)中的一種全新技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)有望克服與蛋白質(zhì)位點(diǎn)特異性修飾相關(guān)的眾多局限。具體點(diǎn)說(shuō)，已將新的組分加入到原核生物大腸桿菌 (Escherichia coli,E. coli)(例如參見(jiàn) L.王(L.Wang)等人，(2001),科學(xué)(Science) 292 498-500)和真核生物釀酒酵母菌(Sacchromyces cerevisia, S. cerevisiae)(例如 J.秦 (J. Chin)等人，—301 :964-7(2003))的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器中，使得所述機(jī)器能夠在體內(nèi)將非基因編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中。已使用這一方法，對(duì)琥珀密碼子TAG作出反應(yīng)，以高保真度將大量具有新穎化學(xué)、物理或生物特性的新氨基酸有效地并入大腸桿菌和酵母中的蛋白質(zhì)中，所述氨基酸包括光親和性標(biāo)記和光敏異構(gòu)化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸。例如參見(jiàn)J. W.秦(J. W. Chin)等人，(2002)，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(Journal of the American Chemical Society) 124 :9026-9027 ;J. W.秦和 P. G.查魯茲(P. G. Schultz)， (2002)，化學(xué)與生物化學(xué)(ChemBioChem)Il :1135-1137 ;J. ff.秦等人，(2002)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PNAS United States of America) 99 :11020-11024 ；禾口 L··王(L. ffang)和P. G.查魯茲(P. G. Schultz)，(2002)，化學(xué)通訊(Chem. Comm.)，1_10。這些研究已證實(shí)，有可能選擇性地以常規(guī)方式引入一些化學(xué)官能團(tuán)，例如炔基和疊氮部分，這些官能團(tuán)不存在于蛋白質(zhì)中，對(duì)20種常見(jiàn)的基因編碼氨基酸中所見(jiàn)的所有官能團(tuán)具化學(xué)惰性，并能用于有效且選擇性反應(yīng)而形成穩(wěn)定共價(jià)鍵。將非基因編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)的能力允許引入可向天然存在的官能團(tuán)(例如賴氨酸的-NH2、半胱氨酸的硫氫基-SH、組氨酸的亞氨基等)提供有價(jià)值的替代選擇的化學(xué)官能團(tuán)。已知某些化學(xué)官能團(tuán)對(duì)20種常見(jiàn)的基因編碼氨基酸中所見(jiàn)的官能團(tuán)呈惰性，但能干凈且有效地反應(yīng)以形成穩(wěn)定鍵。例如此項(xiàng)技術(shù)中已知，疊氮基和乙炔基在催化量銅存在下，可在水性條件中進(jìn)行胡伊斯根(Huisgen) [3+2]環(huán)加成反應(yīng)。例如參見(jiàn)托尼諾(Tornoe) 等人，(2002)有機(jī)化學(xué)(Org. Chem.)67 :3057-3064 和羅斯托瑟夫(Rostovtsev)等人， (2002)德國(guó)應(yīng)用化學(xué)(AnSew. Chem. Int. Ed. )41 :2596_2599。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)將疊氮部分引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，就能夠并入對(duì)蛋白質(zhì)中所見(jiàn)的胺、硫氫基、羧酸、羥基具化學(xué)惰性，但也可與乙炔部分平穩(wěn)且有效地反應(yīng)而形成環(huán)加成產(chǎn)物的官能團(tuán)。重要的是，在不存在乙炔部分的情況下，疊氮基仍保留化學(xué)惰性，而且在其它蛋白質(zhì)側(cè)鏈存在時(shí)在生理?xiàng)l件下不發(fā)生反應(yīng)。本發(fā)明將特別針對(duì)與EPO的活性和制備有關(guān)的問(wèn)題，并且還針對(duì)具有改進(jìn)的生物或藥理學(xué)特性(例如改進(jìn)的治療半衰期)的hEPO多肽的制備。
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供包含非天然編碼氨基酸的fEPO多肽。在一些實(shí)施例中，fEPO多肽與第二 fEPO連接。 在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實(shí)施例中，聚(乙二醇)分子是一種雙官能聚合物。在一些實(shí)施例中，雙官能聚合物與第二多肽連接。在一些實(shí)施例中，所述第二多肽是 fEPO多肽。在一些實(shí)施例中，fEPO多肽包含至少兩個(gè)氨基酸，連接到包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物。在一些實(shí)施例中，至少一個(gè)氨基酸是非天然編碼氨基酸。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下一個(gè)或一個(gè)以上對(duì)應(yīng)于二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域中的任一位置1-7 (N末端)、8力6 (A螺旋)、27巧4 (A螺旋與B螺旋之間的區(qū)域),55-83 (B螺旋),84-89 (B螺旋與C螺旋之間的區(qū)域),90-112 (C螺旋)、113-137 (C螺旋與D螺旋之間的區(qū)域)、138-161 (D螺旋)、162-166 (C末端)、39-41 ( β 折疊1)、133-135 ( β折疊2) ,47-52 (微型B環(huán))、114-121 (微型C環(huán)),34-38 (Α螺旋與反平行β 折疊之間的環(huán))、51-57(Β'螺旋的C末端、B'螺旋與B螺旋之間的環(huán)以及B螺旋的N末端)、82-92(Β螺旋與C螺旋之間的區(qū)域)和120-133(C'螺旋與反平行β折疊2 之間的區(qū)域)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、 101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、 139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、 158、159、160、161、162、163、164、165和166。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158，159、160、161、162、163、164、165 和 166。在一些實(shí)施例中， 將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者1、2、3、4、5、6、17、 21、24、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、 80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、113、116、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、136、162、163、164、165 和 166。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者1、2、3、4、5、6、17、18、 21、24、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、
1180、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、113、116、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、136、162、163、164、165 和 166。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的fEPO多肽在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸21、 24、27、28、30、31、34、36、37、38、40、55、68、72、76、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、
123、124、125、126、127、128、129、130、136和162。在一些實(shí)施例中，在這些或其它位置的非天然存在氨基酸與水溶性分子連接，所述位置包括(但不限于)以下位置21、M、38、83、 85、116和119。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的fEPO多肽在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸18、53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、 163、168、120、125、55和60。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的fEPO多肽在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、 132、137、163、168、120、125、55和60。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的fEPO多肽在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸18、53、58、116、121、89、94、72、77、86、 91、31、36、132、137、163、168、120、125、55和60。在一些實(shí)施例中，在這些或其它位置的非天然存在氨基酸與水溶性分子連接，所述位置包括(但不限于)以下位置53、58、116、121、 89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、163、168、120、125、55 和 60。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的fEPO多肽在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸123、
124、125、126、127、128、1 和130。在一些實(shí)施例中，在這些或其它位置的非天然存在氨基酸與水溶性分子連接，所述位置包括(但不限于)以下位置123、1對(duì)、125、1沈、127、1觀、 129 和 130。在一些實(shí)施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽對(duì)促紅細(xì)胞生成素受體的親和力的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽的穩(wěn)定性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，fEPO多肽包含增加宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的fEPO多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，fEPO多肽包含SEQ ID NO :2中選自由以下(但不限于)各氨基酸組成的群組的氨基酸取代N24、N36、N38、Q58、Q65、N83、Q86、G113、Q115和S126，及其組合。 在一些實(shí)施例中，fEPO多肽包含SEQ ID NO :4中選自由以下(但不限于)各氨基酸組成的群組的氨基酸取代:N24、N36、N38、Q58、Q65、N83、Q86、G113、Q115 和 S126，及其組合。在一些實(shí)施例中，可以用天然存在或非天然存在的氨基酸取代fEPO多肽中的氨基酸，只要至少一個(gè)取代是用非天然編碼氨基酸進(jìn)行即可。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙?；毖趸?、胼基、酰胼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼的氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)
(CH2)nR1COR2 RaHN ^COR4 其中η為0到10 為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2為H、烷基、芳基、
經(jīng)取代烷基和經(jīng)取代芳基；且民為H、氨基酸、多肽，或氨基末端修飾基團(tuán)；且R4為H、氨基酸、多肽，或羧基末端修飾基團(tuán)。 在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含氨氧基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含酰胼基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含胼基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸殘基包含氨基脲基。 在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種貓促紅細(xì)胞生成素(fEPO)多肽，其特征在于，包含非天然編碼氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽與至少一另一fEPO 多肽連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇) 部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子是雙官能聚合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的fEPO多肽，其特征在于，所述雙官能聚合物與第二多肽連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的fEPO多肽，其特征在于，所述第二多肽為非fEPO多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，包含至少兩個(gè)氨基酸連接到包含聚 (乙二醇)部分的水溶性聚合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的fEPO多肽，其特征在于，至少一個(gè)與所述水溶性聚合物連接的氨基酸為非天然編碼氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 2中選自由殘基1-7、27-54、84-89、114-137、162-166組成的群組的位置進(jìn)行取代。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO :2中選自由以下組成的群組的位置進(jìn)行取代殘基1、2、3、4、5、6、8、9、17、21、 24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、45、47、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、65、68、72、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、107、110、111、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、136、154、157、158、159、160、162、163、164、165 和 166。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 2中選自由以下組成的群組的位置進(jìn)行取代殘基2、4、17、21、24、27、28、30、31、32、34、 36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136 和 162，以及其組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQ ID NO 2中選自由以下組成的群組的位置進(jìn)行取代殘基21、對(duì)、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130 和 162，以及其組合。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 2中選自由以下組成的群組的位置進(jìn)行取代殘基21、對(duì)、38、83、85、86、89、116、119、 121、124、125、126、127 和 128，以及其組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 2中選自由以下組成的群組的位置進(jìn)行取代:24、36、38、58、65、83、86、113、115、126和其組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽包含增加所述fEPO多肽對(duì)促紅細(xì)胞生成素受體的親和力的取代、添加或缺失。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽包含增加所述fEPO 多肽的穩(wěn)定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的fEPO多肽，其特征在于，包含在SEQID NO 2中選自由但不限于以下組成的群組的氨基酸取代S9A、F48S、Y49S、A50S、Q59A、A73G、G101A、T106A、 L108A、T132A、R139A、K140A、R143A、S146A、N147A、R150A 和 K154A,以及其組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸對(duì)水溶性聚合物具反應(yīng)性，而所述水溶性聚合物另外對(duì)20種常見(jiàn)氨基酸中的任一種無(wú)反應(yīng)性。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含羰基、 乙?；?、氨氧基、胼基、酰胼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含羰基。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)(CH2)nR1COR2 R3HN COR4其中η為0-10 為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2為H、烷基、 芳基、經(jīng)取代烷基和經(jīng)取代芳基；且民為H、氨基酸、多肽，或氨基末端修飾基團(tuán)； 且R4為H、氨基酸、多肽，或羧基末端修飾基團(tuán)。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含酰胼基。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含胼基。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含氨基脲基。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮基。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)(CH2)nR1X(CH2)mN3 R2H N xx^COR3其中η為0-10 為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基、經(jīng)取代芳基或不存在；X為0、N、S或不存在；m為0-10 ;R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且民為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
29.根據(jù)權(quán)利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含炔基。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)(CH2)nR1X(CH2)mCCH RzHN'^'^CORa其中η為0-10 為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；X為0、N、S或不存在m為 0-10出2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且民為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
31.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子的分子量介于約IkDa與約IOOkDa之間。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子的分子量介于IkDa與50kDa之間。
33.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通過(guò)使包含含羰基氨基酸的 fEPO多肽與包含氨氧基、羥胺基、胼基、酰胼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反應(yīng)而制成。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的fEPO多肽，其特征在于，所述氨氧基、羥胺基、胼基、酰胼基或氨基脲基經(jīng)由酰胺鍵與所述聚(乙二醇)分子連接。
35.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通過(guò)使包含羰基的聚(乙二醇) 分子與包含非天然編碼氨基酸的多肽反應(yīng)而制成，所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基、羥胺基、酰胼基或氨基脲基。
36.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通過(guò)使包含含炔氨基酸的fEPO 多肽與包含疊氮部分的聚(乙二醇)分子反應(yīng)而制成。
37.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通過(guò)使包含含疊氮基氨基酸的 fEPO多肽與包含炔部分的聚(乙二醇)分子反應(yīng)而制成。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的fEPO多肽，其特征在于，所述疊氮基或炔基是經(jīng)由酰胺鍵與所述聚(乙二醇)分子連接。
39.根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子是分支或多臂聚合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分支聚合物各分支的分子量介于5kDa與30kDa之間。
41.根據(jù)權(quán)利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述多肽是促紅細(xì)胞生成素拮抗劑。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO :2中選自由以下組成的群組的位置進(jìn)行取代殘基包括但不限于VII、R14、Y15、D96、 K97、S100、R103、S104、T107、L108 和 R110,以及其組合。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，連接到水溶性聚合物的所述非天然編碼氨基酸是存在于所述fEPO多肽的位點(diǎn)II區(qū)內(nèi)。
46.根據(jù)權(quán)利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，連接到水溶性聚合物的所述非天然編碼氨基酸通過(guò)防止所述fEPO拮抗劑結(jié)合于第二個(gè)fEPO受體，來(lái)防止所述fEPO受體二聚化。
47.根據(jù)權(quán)利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，除亮氨酸外的氨基酸取代SEQID NO 2 中的 L108。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的fEPO多肽，其特征在于，精氨酸取代SEQID NO :2中的 L108。
49.根據(jù)權(quán)利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含糖部分。
50.根據(jù)權(quán)利要求3所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物經(jīng)由糖部分與所述多肽連接。
51.一種分離的核酸，其特征在于，包含在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 24,SEQ ID NO :25、 SEQ ID NO J6或SEQ ID NO :27雜交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一個(gè)選擇密碼子。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的分離的核酸，其特征在于，所述選擇密碼子選自由以下組成的群組琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨(dú)特密碼子、稀有密碼子和四堿基密碼子。
53.一種制備根據(jù)權(quán)利要求4所述的fEPO多肽的方法，其特征在于，所述方法包含使包含非天然編碼氨基酸的分離的fEPO多肽與水溶性聚合物接觸，所述水溶性聚合物包含與所述非天然編碼氨基酸反應(yīng)的部分。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含羰基、 氨氧基、酰胼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含羰基部分，且所述水溶性聚合物包含氨氧基、羥胺部分、酰胼部分或氨基脲部分。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含炔部分，且所述水溶性聚合物包含疊氮部分。
58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮部分，且所述水溶性聚合物包含炔部分。
59.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇部分的平均分子量介于約IkDa與約IOOkDa之間。
60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇部分為分支或多臂聚合物。
61.一種組合物，其特征在于，包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的fEPO多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的組合物，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
63.一種治療所患病癥受fEPO調(diào)節(jié)的患者的方法，其特征在于，包含對(duì)所述患者投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求61所述的醫(yī)藥組合物。
64.一種細(xì)胞，其特征在于，包含根據(jù)權(quán)利要求51所述的核酸。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包含正交tRNA合成酶和正交 tRNAo
66.一種制備包含非天然編碼氨基酸的fEPO多肽的方法，其特征在于，所述方法包含， 在允許表達(dá)所述包含非天然編碼氨基酸的fEPO多肽的條件下，培養(yǎng)包含一個(gè)或一個(gè)以上編碼fEPO多肽且包含選擇密碼子的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的細(xì)胞；以及從所述細(xì)胞中純化所述fEPO多肽。
67.一種增加fEPO的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的方法，其特征在于，所述方法包含用非天然編碼氨基酸取代天然存在fEPO中的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
68.一種 fEPO 多肽，其特征在于，由具有 SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 26 或SEQ ID NO :27中所示序列的多聚核苷酸編碼，在所述fEPO多肽中，至少一個(gè)氨基酸經(jīng)非天然編碼氨基酸取代。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
70.根據(jù)權(quán)利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
71.根據(jù)權(quán)利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 3中選自由以下組成的群組的位置進(jìn)行取代殘基1、2、3、4、5、6、8、9、17、21、24、25、26、 27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、45、47、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、 72、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、107、110、111、113、114、115、 116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、 136、154、157、158、159、160、162、163、164、165 和 166。
72.根據(jù)權(quán)利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含羰基、 氨氧基、酰胼基、胼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
73.根據(jù)權(quán)利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)部分的分子量介于約IkDa與約IOOkDa之間。
74.根據(jù)權(quán)利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)部分的分子量介于5kDa與40kDa之間。
75.根據(jù)權(quán)利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚乙二醇部分為分支或多臂聚合物。
76.一種醫(yī)藥組合物，其特征在于，包含根據(jù)權(quán)利要求68所述的fEPO多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
77.一種非人促紅細(xì)胞生成素多肽，其特征在于，具有選自由SEQ ID NO 30 ；SEQ ID N0:31 ；SEQ ID NO 32和SEQ ID NO :33組成的群組的氨基酸序列，其中所述非人促紅細(xì)胞生成素多肽包含非天然編碼氨基酸取代或添加。
全文摘要
本發(fā)明提供經(jīng)修飾的動(dòng)物促紅細(xì)胞生成素多肽和其用途。
文檔編號(hào)C07K14/505GK102232085SQ200980147248
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者凱爾·阿特金森, 安娜-瑪莉亞·A.·海斯蒲楠, 彼德·C.·康寧, 德林·李, 斯蒂芬妮·周, 法蘭克·宋, 理查·S.·巴奈特, 田鋒, 約瑟夫·謝菲爾, 馬克·斯拉迪塔 申請(qǐng)人:Ambrx公司, 美國(guó)禮來(lái)公司