專利名稱：集成有可變換光源的電泳分離與分析裝置及其使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然發(fā)熒光或與熒光標記物結(jié)合的帶電荷物質(zhì)的凝膠電泳分離與分析裝置。具體而言，本發(fā)明涉及到一種高度集成的可以變換光源波長的多用途電泳分離與分析裝置。
背景技術(shù)：
熒光現(xiàn)象與熒光物質(zhì)[1-4]；當(dāng)某種波長的光線(入射光)照射到某些物質(zhì)的時候，這些物質(zhì)會發(fā)射出不同于入射光波長與強度的光(發(fā)射光)。當(dāng)入射光停止照射時，被照射物質(zhì)所發(fā)射的光線也隨之消失。由被照射物質(zhì)所發(fā)射的光線稱為熒光。能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)稱為熒光物質(zhì)。N.Monardes在1575年首次記錄到熒光現(xiàn)象。他在一種稱為“LignumNephriticum”的木頭切片的水溶液中，觀察到極為可愛的天藍色熒光。在17世紀，Boyle(1626-1691)和Newton(1624-1727)等著名科學(xué)家再次觀察到熒光現(xiàn)象，并且給予更詳細的描述。1852年Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍為長些，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念，并在1864年首次提出熒光作為一種分析手段。1867年，Goppelsrder)進行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁-桑色素配合物的熒光進行鋁的測定。1880年，Liebeman提出了最早的關(guān)于熒光與化學(xué)結(jié)構(gòu)關(guān)系的經(jīng)驗法則，到19世紀末，人們已經(jīng)知道了包括熒光素、曙紅、多環(huán)芳烴等600種以上的熒光化合物。20世紀以來，更對熒光現(xiàn)象進行了更深入的研究。
熒光分析方法的發(fā)展與儀器應(yīng)用的發(fā)展分不開。19世紀以前，熒光的觀察靠肉眼進行，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺光電熒光計。早期的光電熒光計的靈敏度有限，1939年Zworykin和Rajchman發(fā)明光電倍增管以后，在增加靈敏度和容許使用分辨率更高的單色器等方面，是一個非常重要的階段。1943年Dutton和Bailey提出了一種熒光光譜的手工校正步驟，1948年由Studer推出了第一臺自動光譜校正裝置，到1952年才出現(xiàn)商品化的校正光譜儀器。近十幾年來，在其它學(xué)科迅速發(fā)展的影響下，隨著激光、微處理機和電子學(xué)的新成就以及新型熒光材料的發(fā)現(xiàn)于合成，大大促進了諸如同步熒光測定、導(dǎo)數(shù)熒光測定、時間分辨熒光測定、相分辨熒光測定、熒光偏振測定、熒光免疫測定、低溫?zé)晒鉁y定、固體表面熒光測定、熒光反應(yīng)速率法、三維熒光光譜技術(shù)和熒光光纖化學(xué)傳感器等熒光分析方面的某些新方法、新技術(shù)的發(fā)展，并且相應(yīng)地加速了各式各樣新型的熒光分析儀器的問世，使熒光分析法不斷朝著高效、痕量、微觀和自動化的方向發(fā)展，方法的靈敏度、準確度和選擇性日益提高，方法的應(yīng)用范圍大大擴展，遍及于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護、公安情報和科學(xué)研究等各個領(lǐng)域中。如今，熒光分析法已經(jīng)發(fā)展成為一種重要且有效的光譜化學(xué)分析手段。
電泳與電泳原理[5，6]；帶電的顆粒在電場作用下向著其電性相反的電極移動，稱為電泳。荷電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象最早由瑞典Uppsal大學(xué)物理化學(xué)系Svedberg教授觀察到。1937年瑞典科學(xué)家Tiselius設(shè)計世界上第一臺電泳儀-移界電泳法。但由于“移界電泳法”電泳時自由溶液受熱后發(fā)生密度變化產(chǎn)生對流，分辨性不高且加上電泳儀器昂貴，沒能推廣。50年間，改進電泳儀及找尋濾紙、醋酸纖維生素薄膜、淀粉、瓊膠糖等做為支持介質(zhì)，電泳技術(shù)得到推廣應(yīng)用。60年間更找到聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)并發(fā)展了SDS-聚丙烯酰胺電泳、等電點電泳、雙向電泳和印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術(shù)。這些技術(shù)具有設(shè)備簡單、操作方便、分辨率高等優(yōu)點。電泳技術(shù)已成為生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及密切相關(guān)的醫(yī)學(xué)、農(nóng)、林、牧、魚、制藥等領(lǐng)域必備的分析手段。
任何物質(zhì)由于本身的解離作用或表面上吸附其它帶電質(zhì)點，在電場中便會向一定的電極移動。帶電顆?？梢允切〉碾x子，也可以是生物大生子，蛋白質(zhì)、核酸、病毒顆粒、細胞器等。不同的帶電顆粒在同一電場的電泳移動速度不同。一般所帶凈電荷數(shù)越多，顆粒越小，越接近球形，則在電場中移動速度越快，反之則慢。此外，電泳速度還受到電場強度、溶液酸堿度、溶液的離子強度、溫度以及電泳支持物的影響。
電泳分類；電泳種類很多，但基本原理相同。不同的電泳因不同的支持物或凝膠而有各自的特性。按分離原理分成區(qū)帶電泳、移界電泳、等速電泳和聚膠電泳。按有無固體支持物分成自由電泳、支持物電泳。按電泳槽的形式分成垂直的、水平的、柱狀的、毛細管的等不同電泳型態(tài)。
凝膠電泳在所有的電泳介質(zhì)中，使用瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠[5，6]為介質(zhì)的凝膠電泳的最為普遍。
瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的，由半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。瓊脂糖凝膠的孔徑較大、主要用于核酸或蛋白質(zhì)等較大分子的電泳分離與分析，具有下列優(yōu)點(1)液體量大，可達98-99％，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小，對DNA、RNA與蛋白質(zhì)的吸附極微。(2)瓊脂糖作為支持體有均勻，區(qū)帶整齊，分辨率高，重復(fù)性好等優(yōu)點。(3)電泳速度快。(4)透光性好，可以直接用紫外或其他光源作定量測定。(5)區(qū)帶易染色，有利于制備。
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N′甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。聚丙烯酰胺凝膠的孔徑相對較小、主要用于蛋白質(zhì)以及小分子物質(zhì)的電泳分離與分析，具有下列優(yōu)點(1)聚丙烯酰胺凝膠沒有或很少帶有離子的側(cè)基，因而電滲作用小，不易和樣品相互作用。(2)由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì)，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其空隙度可在一個較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的凝膠成分。一般說來，含丙烯酰胺7-7.5％的凝膠，機械性能適用于分離分子量范圍不1萬至100萬物質(zhì)，1萬以下的則采用含丙烯酰胺15-30％的凝膠。(3)在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。(4)凝膠無色透明、透光性極好，易觀察，可用檢測儀直接測定。
凝膠電泳的應(yīng)用已經(jīng)廣泛用于對各種帶電荷物質(zhì)的分析。在實驗中，研究者通過電泳操作可以將所分析的物質(zhì)按分子量大小和所攜帶電荷的差異進行有效分離。對照分子量標準，所分析的分子量可以被準確的估測，并能夠?qū)Χ鄠€樣本同時進行分析，分離與純化。
現(xiàn)有凝膠電泳裝置與技術(shù)比較凝膠電泳常用于對生物大分子如蛋白質(zhì)、DNA和RNA的分析。常規(guī)DNA或RNA的凝膠電泳分析[6]見圖1。由于DNA或RNA本身不能發(fā)熒光，具體操作時需先制作瓊脂糖凝膠板，并在其中加入與DNA或RNA結(jié)合的熒光劑——溴化乙啶。將制好的凝膠板放于電泳槽中，加DNA或RNA樣品后進行電泳。DNA或RNA在電泳過程中與溴化乙啶結(jié)合，但被染色的樣品在可見光下不能顯現(xiàn)。必須在暗室中經(jīng)紫外光(入射光)激發(fā)后顯現(xiàn)黃綠色的熒光帶譜。熒光帶譜可經(jīng)適當(dāng)?shù)臑V光板濾光后用光學(xué)或數(shù)碼相機照相存檔。盡管早已知道溴化乙啶為強致癌劑、紫外線對人體有害，但目前還沒有其他更好的替代方法。在互聯(lián)網(wǎng)搜索引擎搜索“凝膠電泳”一詞，可以查找到許多生產(chǎn)、銷售電泳槽、電泳儀、紫外光燈箱與成像或圖像系統(tǒng)的國內(nèi)外廠家。但幾乎所有的裝置與儀器均是按這種傳統(tǒng)操作方法設(shè)計、生產(chǎn)的。
美國專利6512236公開了一種用可見藍色光顯現(xiàn)熒光材料的技術(shù)[7]，利用該技術(shù)制作的商品光源稱為Dark Reader[8]。國內(nèi)廠家生產(chǎn)的相似裝置稱為藍盾系列可見光凝膠透射儀[9]。該技術(shù)利用藍色濾光片將普通熒光燈的雜色光過濾得到藍色光。藍色光激活采用藍光為入射光的熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)經(jīng)另一片濾光板過濾后成為可為肉眼所觀察或為相機記錄。該裝置代替?zhèn)鹘y(tǒng)的紫外線燈箱用于DNA或RNA電泳分析時可避免使用對人體有害的溴化乙啶和紫外線。但是該專利主要涉及的是藍色可見光燈箱的制作。在電泳時色帶是不可見的，需要將凝膠板轉(zhuǎn)移到藍色燈箱中觀察后才能決定是否繼續(xù)進行電泳或照相記錄。該裝置必須使用藍色與黃棕色兩種濾光板才能夠?qū)π枰运{色光為入射光的熒光物質(zhì)進行觀察與記錄，但不能顯現(xiàn)以除藍色光以外的光線為激發(fā)(入射)光的熒光材料。
對蛋白質(zhì)的凝膠電泳分析通常采用垂直電泳分析裝置(圖2A)。當(dāng)需要檢查熒光蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)本身發(fā)熒光)或用熒光標記的的蛋白質(zhì)或其它探針時，垂直電泳分析裝置本身不能夠顯現(xiàn)這些熒光物質(zhì)，常常需要其它昂貴檢測裝置(圖2B)。因此，需要一種新型的電泳分析裝置用于分析熒光蛋白質(zhì)或基于熒光技術(shù)的免疫分析或分子生物學(xué)分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種可進行實時、連續(xù)監(jiān)測的多用途凝膠電泳分析裝置，該裝置包括透光分析板和放置在該透光分析板兩側(cè)的窄譜或純光譜光源，其中，該光源發(fā)射的光線以與凝膠板水平的角度射入。
在一優(yōu)選實施例中，該裝置還包括電泳電源、電泳分析槽。
在一優(yōu)選的實施例中，使用半導(dǎo)體發(fā)光二極管作為光源，產(chǎn)生光譜純度較高的光線。在另一優(yōu)選實施例中，使用激光管產(chǎn)生窄譜或純光譜光源。用窄譜或純光譜光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)光源可以不使用濾光片。這樣的設(shè)計可以使熒光物質(zhì)的激發(fā)光源的體積大大縮小，使其能夠整合到分析系統(tǒng)中。窄譜或純光譜光源為可以變換的光源。光源波長的選擇可根據(jù)實際使用的熒光染料而定。
在一優(yōu)選實施例中，所述透光分析板由透光材料制成，該透光材料可選自天然或人工合成的透光材料、凝膠或聚合物或透明液體。
在一優(yōu)選實施例中，所述電泳分析槽選自水平分析電泳槽和垂直分析電泳槽。
在一優(yōu)選實施例中，光源安裝在凝膠板兩側(cè)，光線以與凝膠板平行的方向射入，激活其中的熒光物質(zhì)。這樣的設(shè)計有利于光線均勻分布于凝膠板，避免光線直對人眼與攝像裝置，提高檢測靈敏度并使激活的熒光肉眼可見。
在另一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的凝膠電泳分析裝置還包括照相系統(tǒng)。在電泳結(jié)束后即可對電泳結(jié)果進行拍照。
又一方面，本發(fā)明還提供一種實時、連續(xù)監(jiān)測凝膠電泳的方法，該方法包括使用本發(fā)明提供的上述凝膠電泳分析裝置，使用與加入的熒光染料相配合的純光譜，以凝膠板水平的角度射入，該光激活該熒光染料，使樣品顯現(xiàn)出其在凝膠板中的位置，從而可對其進行實時、連續(xù)監(jiān)測。
本發(fā)明方法還包括，在適當(dāng)?shù)臅r候，對滿足要求的凝膠板進行拍照。拍照用的圖像儀可與本發(fā)明的凝膠電泳分析裝置組合成一系統(tǒng)，如本發(fā)明上述凝膠電泳分析系統(tǒng)。圖像儀也可以是單獨的一個部分，視具體情況而定。
在一優(yōu)選實施例中，所述熒光材料選自天然熒光物質(zhì)、用熒光材料標記或與熒光材料結(jié)合的物質(zhì)。
采用本發(fā)明裝置和方法進行DNA、RNA或蛋白質(zhì)的電泳分析具有許多優(yōu)點，包括(1)由于裝置自帶光源，不需暗室。并可以在電泳過程中連續(xù)實時觀察DNA、RNA或蛋白質(zhì)電泳帶譜。(2)由于光源可以變換，因而該系統(tǒng)可以與許多新型DNA和RNA熒光染料配對、在電泳中顯現(xiàn)DNA或RNA，如使用美國Molecular Probes公司生產(chǎn)的SYBR Green I[10]，可以避免使用強致癌的溴化乙啶。(3)采用新型DNA和RNA熒光染料靈敏度較采用溴化乙啶的方法高5-10倍，達十毫微克(10ng)水平。(4)采用可見光光譜為激發(fā)光，可以消除紫外光對人體與樣品的有害影響。(5)較傳統(tǒng)電泳分析方法操作簡便、費用低。
新裝置從各個方面均明顯優(yōu)于現(xiàn)有的DNA與RNA凝膠電泳分析裝置，表1列出更多項目的比較。
表1、傳統(tǒng)電泳裝置[6]與可變換光源電泳裝置的比較

本發(fā)明涉及的電泳分析裝置還很適合用于以下分析；(1)各種熒光蛋白(GFP)及其衍生物的分析。(2)基于熒光標記的抗原與抗體反應(yīng)測定。(3)基于熒光標記的基因雜交反應(yīng)測定。(4)以及DNA/RNA與蛋白質(zhì)的相互反應(yīng)測定。
此外，由于本發(fā)明涉及裝置的光源可以很容易換成其它波長的光源，因而可以用于其它沒有列出的物質(zhì)的電泳分離與純化。


圖1顯示常用的DNA與RNA凝膠電泳分析示意圖。圖1中1表示電泳電源，2表示電泳槽，3表示紫外燈箱，4表示紫外光燈管，5表示數(shù)碼相機或光學(xué)相機，6表示凝膠板，7表示濾光片。A表示在進行電泳和染色，但是看不到色帶。B表示將凝膠板放到紫外燈箱中，在暗室中對其進行觀察，以決定是進一步電泳還是進行照相記錄。C表示進行照相記錄。
圖2顯示常用測定熒光蛋白質(zhì)或與熒光探針結(jié)合蛋白的分析示意圖。圖中A表示垂直電泳裝置，B表示生物熒光測定儀或熒光掃描儀。在A中，1為電泳電源，2為熒光蛋白樣品，3為電泳上槽，4為凝膠板，5為電泳下槽，6為電泳液，7表示蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印，8表示直接用儀器分析熒光蛋白樣品，9表示經(jīng)針對特定蛋白的熒光探針探查后用儀器分析。
圖3顯示了本發(fā)明一個具體的集成有半導(dǎo)體光源、光源可變換的凝膠電泳分析裝置。其中虛線框1表示儀器箱，2表示數(shù)碼相機，3表示光學(xué)塑料蓋，4表示可以變換光源的多用途電泳槽。用此裝置進行試驗時，可用肉眼直接觀察膠上的染色體DNA帶，而且該觀察可連續(xù)進行，入射光光源可以變換，并可進行原位照相記錄。
圖4顯示了自帶光源的電泳裝置的組件與結(jié)構(gòu)示意圖。A示意已經(jīng)裝配好并正在進行電泳的裝置。B顯示揭開帶濾光片的蓋子后的裝置內(nèi)部帶凝膠板的結(jié)構(gòu)。C顯示已經(jīng)取出凝膠板但仍保留光源的結(jié)構(gòu)。D顯示取出凝膠板與光源板后的電泳槽。E為電泳電源。
圖5顯示水平凝膠電泳裝置中光源與凝膠板的結(jié)構(gòu)關(guān)系與入射角度示意圖，其中1表示光源，2表示凝膠板，帶雙線的箭頭表示入射光的入射方向。
圖6顯示帶有可變換光源的垂直凝膠電泳裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。其中1為光源，2為凝膠板，3電泳下槽，4為電泳上槽，5為電泳緩沖液。帶有雙線的箭頭表示入射光源的入射方向。
圖7顯示了美國專利512236中所涉及制作的藍色可見光在DNA分析中的應(yīng)用。圖中顯示，首先需要進行A常規(guī)方法電泳，然后染色，B將染好色的凝膠板轉(zhuǎn)移到該技術(shù)涉及到的藍色光可見光燈箱上，在暗室中對樣品可以進行觀察、分析，以決定是繼續(xù)電泳還是進行C照相記錄。圖中1表示凝膠板染色，2表示熒光燈管，3表示藍色可見光燈箱，4表示濾光片，5表示相機，6表示凝膠板。
圖8顯示本發(fā)明運用帶有可變換光源的凝膠電泳裝置進行DNA分析的實驗結(jié)果圖。該實驗采用8個不同來源的DNA樣品分別經(jīng)核酸酶處理(A)或未經(jīng)酶處理(B)。電泳時間45分鐘，實驗結(jié)果用數(shù)碼照相機拍照記錄。
圖9顯示了自帶光源的電泳裝置用于分離純化DNA片段的示意圖。A為凝膠板與純化板對位后的俯視圖。其中1為電泳分離后的DNA帶，以帶灰色的長方形表示，2與3分別表示凝膠板與分離板，a所示的虛線表示水平中線。B為凝膠板與純化板水平中線的截面圖、示意DNA帶的純化過程。其中，1示意裝配對位的情況；欲回收的DNA帶需與分離板中的開槽對齊，純化孔的下開口有半透膜5封住不讓DNA通過。2示意電洗脫過程，3示意DNA移動至純化孔時停止電轉(zhuǎn)運，4示意回收純化的DNA樣品。由于電泳裝置帶有光源，樣品的回收情況能夠進行實時觀察。
具體實施例方式
電泳槽水平電泳槽及放置光源的部件可以參照圖3至圖4所列制作。電泳槽可以用透明或不透明材料制作，但要求絕緣并不滲漏。垂直電泳分析槽可以如圖2所示制作垂直分析電泳槽。
光源插框按照圖5所示用塑料模具制作。光源插框需置于透光分析板的兩側(cè)。放置光源的部件的朝向分析板的一面必須是透明的。
透光分析板分析板位于光源之間。分析板可以是天然透光材料如瓊脂制作的凝膠或人工聚合透光材料的固體，半固體或液體材料。
光源可換窄譜或純光譜光源位于光源插件內(nèi)。所發(fā)射的光線必須與以分析(凝膠)板平行的角度射入。光源波長的選擇依所選擇的熒光染料或熒光標記物而定?，F(xiàn)在已有許多廠家生產(chǎn)熒光染料或熒光標記物。有關(guān)熒光染料與何種波長光源相配對可以從生產(chǎn)廠家提供的產(chǎn)品資料[10]或商品參考手冊[3]中找到。本領(lǐng)域技術(shù)人員參考這些資料能夠熟練掌握何種熒光染料與何種波長光源相配對的知識。表2歸納列出了部分常用的熒光蛋白質(zhì)與熒光化合物的入射與發(fā)射光的光譜。
制作本裝置需要采用窄譜或純光譜光源。隨著半導(dǎo)體技術(shù)與光學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)可以很容易通過發(fā)光二極管(LED)或激光技術(shù)獲得較純光譜光源。發(fā)光二極管技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)能夠生產(chǎn)從紫外到紅外線所有光譜的產(chǎn)品[11]。因而很容易獲得各種波長的LED。但LED或激光管的發(fā)光面積較小，需要制作并測試特定形狀、發(fā)光角度與亮度的LED、并以一定距離成排裝配，以期獲得均勻的入射光線。
表2部分常用的熒光化合物與熒光蛋白質(zhì)的入射與發(fā)射光[3，10]

濾色片(板)利用本發(fā)明涉及到的特殊設(shè)計，完全不需要使用濾色片或濾色板以獲得特定的入射光光源，用肉眼即可以觀察到熒光并對其進行照相記錄。但在熒光樣品與觀察者或相機之間使用只讓熒光(發(fā)射光)通過的濾色片或濾色板則可能提高靈敏度。濾色片可以是平板狀的蓋子，亦可以做成眼鏡狀，亦可以是置于相機的前面鏡頭狀。濾色鏡的顏色與濾光特性的選擇依選用的熒光染料或熒光標記物的發(fā)射光波長而定。選用原則是阻斷入射光通過但盡可能讓熒光通過。
本發(fā)明不僅適用于核酸的電泳分析，只要是基于熒光標記與熒光反應(yīng)都可以利用本發(fā)明提到的原則制作檢測儀器。這里提到熒光標記與熒光反應(yīng)包括天然發(fā)熒光物質(zhì)，如各種熒光蛋白與各種衍生物，與人工合成的熒光化合物；如熒光素等。
運用本發(fā)明制作的水平凝膠電泳分析裝置的一個例子見圖3。圖中的虛線部分表示儀器箱，箱內(nèi)的上部為數(shù)碼相機。當(dāng)然也可使用光學(xué)相機替換該數(shù)碼相機。數(shù)碼相機的下面是一光學(xué)塑料蓋，之下為帶有可以變換光源的凝膠電泳分析裝置。
圖3至圖5顯示了本發(fā)明水平凝膠電泳分析裝置的一個例子及其工作原理。圖5其中E表示電泳電源，A表示帶光源的凝膠電泳裝置，B表示可將帶濾色片的蓋子揭開，C表示已移出凝膠的電泳槽，D表示已移出可變換光源的電泳槽。換言之，在具體操作時，電泳槽最先可以是以D所示的狀態(tài)存在。技術(shù)人員可先安裝上純光譜光源，然后放上凝膠板；或者也可先制膠，再裝上光源。然后加入電泳液、加樣。之后覆蓋帶濾色片的蓋子，最后接上電源進行電泳。
垂直凝膠電泳分析裝置的工作原理與垂直凝膠電泳分析裝置類似。圖6顯示帶有可變換光源的垂直型凝膠電泳裝置的裝配示意圖與光源的入射方向。
在電泳期間，由純光譜光源發(fā)出的光線與凝膠板平行射入板中，并以凝膠板作為導(dǎo)光介質(zhì)使光線在凝膠板中均勻分布。入射光在凝膠板中激活熒光物質(zhì)即可顯現(xiàn)樣品在凝膠板中的位置。由此技術(shù)人員可實時、連續(xù)監(jiān)測電泳的進展。合適的時候可停止電泳。需要的時候，可對該凝膠板進行拍照記錄。
以下將對本發(fā)明的裝置及其使用方法進行詳細的描述。應(yīng)理解，這些具體實施方式
僅僅是闡述性的，并不應(yīng)將其視為對本發(fā)明范圍的限定。
實施例1用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析采用美國Molecular Probes公司出售的非致癌熒光染料SYBR Green I[10]進行DNA樣品分析，操作步驟如下；1.系統(tǒng)的光源采用490納米的發(fā)光二極管光源。
2.按所分析分子的分子量大小制作不帶任何DNA染色劑的瓊脂糖凝膠板(傳統(tǒng)方法中需要在凝膠板或緩沖液中放入致癌的溴化乙啶作為DNA染色劑)。所選瓊脂糖凝膠板的濃度與欲分析DNA的分子量的關(guān)系可以從有關(guān)參考書籍中查到[12，13]，并是生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
3.將適當(dāng)量的DNA與帶有SYBR Green I熒光染色劑的上樣液混合。
4.將電泳緩沖液加入電泳槽中。
5.將步驟3中混合液加入凝膠板的樣品孔中。
6.將電泳槽與電泳儀連接。加樣端為陰極端。按8-10伏/厘米長度進行電泳。
7.電泳過程中通過用肉眼或通過電泳蓋中間的濾色板可以實時觀察電泳進展狀態(tài)。
8.樣品電泳至所需距離時，記錄實驗結(jié)果。圖8顯示一典型DNA凝膠電泳分析結(jié)果。
實施例2用于DNA的電泳分離與純化(示意圖見圖9)每一個從事基因克隆、基因表達的實驗室都會從電泳分離的凝膠板中分離純化DNA片段。從凝膠中分離純化DNA片段一般都需要購買成套試劑，而且純化效率低下。由于利用本發(fā)明制作的電泳裝置是可以用肉眼或通過電泳蓋的濾色板實時觀察電泳進展狀態(tài)。因而純化DNA樣品非常簡單可靠。用帶有490納米的純化裝置分離純化DNA樣品的操作步驟如下1.系統(tǒng)的光源采用490納米的發(fā)光二極管光源。
2.按照分子生物學(xué)的普遍原則用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化DNA樣品[12，13]。
3.按照分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的普遍原則制作不帶任何染色劑的瓊脂糖凝膠板。
4.在消化后的樣品中加入1/10量的上樣液并混勻。上樣液中含有DNA熒光染色SRBR Green I。
5.將混合好的上樣液加入凝膠板的樣品孔中。
6.加電泳緩沖液于電泳槽中并與電泳儀連接。加樣端為陰極端。按8-10伏/厘米長度進行電泳。
7.用肉眼或通過電泳蓋的濾色板實時觀察電泳進展狀態(tài)。
8.達到所要求的DNA分離效果時，停止電泳，將凝膠板轉(zhuǎn)至分離板上。將需要回收的DNA帶譜移動并與純化板的開槽處對齊。
9.將純化板的上方接負電極、下方接陽電極。以按4-6伏/厘米膠長度運行電泳分離。用肉眼或通過濾色板可以實時觀察到電泳分離進展狀態(tài)。
10.當(dāng)帶熒光DNA帶的完全電泳進入分離孔后關(guān)掉電源。移開凝膠板、用移液器從分離孔中移取樣品至小試管。
11.直接加入酶緩沖液與連接酶連接DNA片段與載體，或?qū)悠酚靡掖汲恋頋饪s后再用連接酶連接。乙醇沉淀DNA的技術(shù)可以從有關(guān)參考書籍中查到[12，13]，并是生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
12.后續(xù)操作按照分子克隆的標準程序進行[12，14]。
實施例3用于綠熒光蛋白405的電泳分析綠熒光蛋白作為報告基因已經(jīng)在現(xiàn)代生物技術(shù)中使用相當(dāng)普遍。綠熒光蛋白的表達通常經(jīng)用熒光顯微鏡分析確定。傳統(tǒng)綠熒光蛋白的檢測需要405納米的入射光光源。由于一般的熒光顯微鏡中沒有配置該入射光光源而無法觀察到該型熒光蛋白的存在。然而，用本發(fā)明制作的電泳裝置則很容易觀察到。用帶有可變換光源的電泳分析系統(tǒng)用于分析、檢測傳統(tǒng)綠熒光蛋白405的具體操作步驟如下；1.將系統(tǒng)的入射光光源變換為波長為405納米的光源。
2.按照細胞生物學(xué)的標準程序制作非變性的細胞融胞液。
3.制作1％的不帶任何染色劑的瓊脂糖凝膠板或10％聚丙稀酰胺凝膠板。
4.將適當(dāng)量的細胞融胞液(一般10-25微克)加入凝膠板的樣品孔中。
5.加電泳緩沖液于電泳槽中并與電泳儀連接。加樣端為陰極端。按8-10伏/厘米長度進行電泳。
6.電泳過程中可以用肉眼或通過濾色板實時觀察電泳進展狀態(tài)。
樣品電泳至所需距離時，用光學(xué)或數(shù)碼相機記錄實驗結(jié)果。實驗實施過程表明，采用本發(fā)明的裝置和方法可連續(xù)、實時地對電泳情況進行觀察，操作簡便。
實施例4由于分析DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)由于DNA與蛋白質(zhì)或RNA與蛋白質(zhì)的相互結(jié)合反應(yīng)在調(diào)節(jié)細胞的生長、分化與細胞功能有非常重要的作用，因而在體外常用測定DNA/蛋白質(zhì)或RNA/蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)為目前生物研究的熱點之一[15-17]。其測定原理為特異的DNA或RNA片段與蛋白質(zhì)結(jié)合后其在聚丙稀酰胺凝膠中的遷移率將小于未結(jié)合的DNA片段，從而檢測到活化的與DNA結(jié)合的蛋白調(diào)節(jié)因子。常用測定技術(shù)需要用放射性同位素顯現(xiàn)與蛋白質(zhì)結(jié)合的探針的存在，或用生物素或地高新標記DNA探針代替同位素法標記與蛋白質(zhì)結(jié)合的探針。然而，用非同位素的方法需要一些后續(xù)的步驟才能夠顯現(xiàn)與蛋白質(zhì)結(jié)合的探針的位置。這些后續(xù)的顯現(xiàn)步驟費時而且昂貴。采用本發(fā)明涉及的垂直電泳裝置(示意圖見圖6)結(jié)合使用熒光材料Cy5標記的探針，則可以在凝膠電泳分析的工程中對DNA/蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)進行實時監(jiān)測與直接測定，從而使測定大大簡化，節(jié)省費用。其具體操作步驟如下；1.自行制備或通過生物公司商業(yè)合成用熒光化合物Cy5標記的DNA探針。
2.將系統(tǒng)采用的入射光光源換成波長換為650納米的光源。
3.按照分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的普遍原則制作不帶任何染色劑的1.4-1.8％的瓊脂糖凝膠板或5-6％的聚丙稀酰胺凝膠板[12，16]。
4.按照有關(guān)產(chǎn)品的說明書或教科書介紹的標準方法在試管中讓細胞提取液與熒光探針進行結(jié)合反應(yīng)[16]。
5.在反應(yīng)管中加入1/10量的實驗室普遍使用的DNA上樣液并混勻。
6.將混合好的上樣液加入凝膠板的樣品孔中。
7.加電泳緩沖液于電泳槽中并與電泳儀連接。加樣端為陰極端。按8-10伏/厘米膠長度進行電泳。
8.通過肉眼或通過電泳蓋的濾色板實時觀察電泳進展狀態(tài)。
9.當(dāng)樣品電泳至所需距離時，用光學(xué)或數(shù)碼相機記錄實驗結(jié)果。
實驗實施過程表明，采用本發(fā)明的裝置和方法可連續(xù)、實時地對電泳情況進行觀察，操作簡便。
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權(quán)利要求
1.一種電泳分析裝置，其特征在于，該裝置包括透光分析板和放置在該透光分析板兩側(cè)的窄譜或純光譜光源，其中，該光源發(fā)射的光線以與凝膠板水平的角度射入。
2.如權(quán)利要求1所述的電泳分析裝置，其特征在于，使用發(fā)光二極管或激光管產(chǎn)生窄譜或純光譜光源。
3.如權(quán)利要求1所述的電泳分析裝置，其特征在于，所述窄譜或純光譜光源為可以變換的光源。
4.如權(quán)利要求1所述的電泳分析裝置，其特征在于，所述透光分析板由透光材料制成。
5.如權(quán)利要求4所述的電泳分析裝置，其特征在于，所述透光材料選自天然或人工合成的透光材料、凝膠或聚合物或透明液體。
6.如權(quán)利要求1所述的電泳分析裝置，其特征在于，所述裝置還包括照相裝置和濾光片。
7.如權(quán)利要求1所述的電泳分析裝置，其特征在于，所述電泳分析槽選自水平分析電泳槽和垂直分析電泳槽。
8.一種實時、連續(xù)地監(jiān)測凝膠電泳的方法，其特征在于，所述方法包括使用權(quán)利要求1所述的電泳分析裝置進行電泳，使用與加入的熒光染料相配合的純光譜，以凝膠板水平的角度射入，該光激活該熒光染料，使樣品顯現(xiàn)出其在凝膠板中的位置，從而可對其進行實時、連續(xù)監(jiān)測。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述熒光材料選自天然熒光物質(zhì)、用熒光材料標記或與熒光材料結(jié)合的物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該方法還包括對所得電泳結(jié)果進行拍照。
全文摘要
本發(fā)明涉及制作集成有可變換光源的電泳分析與分離裝置的技術(shù)。該裝置包括電泳槽、透光分析板、位于分析板兩側(cè)的窄譜或純光譜光源。在系統(tǒng)中使用窄譜或純光譜光源可以省掉濾色片而直獲得較純光源，使光源小型化并使之與電泳槽整合一體。利用該技術(shù)制作的裝置的特別之處為集成光源發(fā)出的光以與透光分析板平行方向射入。光線在透光分析板中運行使其中的熒光物質(zhì)發(fā)光，因而可以對熒光樣品物質(zhì)進行實時電泳分析與檢測。裝置中使用的光源可以變換，適用性強，因而可以用于各種熒光物質(zhì)的電泳分離與分析。利用所制作的裝置用于核酸分析時，可以不需要暗室、避免使用對環(huán)境與人體有害的熒光染色劑與紫外光，并使測定的靈敏度大大提高。
文檔編號G01N33/559GK1854716SQ200510025170
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月18日
發(fā)明者劉運康 申請人:寧波唯奧基因科技發(fā)展有限公司