專利名稱：毛細管電泳芯片分離檢測尿蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用毛細管電泳芯片分離檢測尿蛋白的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腎病是目前臨床最常見的病癥之一。腎小球或腎小管病變時都可出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白電泳可將尿液中各種蛋白質(zhì)分離用于區(qū)分蛋白類型，可在無損傷的情況下，協(xié)助臨床判斷損傷的部位。尿蛋白電泳主要用來區(qū)分蛋白尿的類型，如腎小球性蛋白尿、腎小管性蛋白尿及溢出性蛋白尿，有助于查明腎病綜合征的病因，從而進行針對性的治療。尿蛋白電泳后出現(xiàn)中、高分子量蛋白帶，主要反映腎小球病變；出現(xiàn)低分子量蛋白帶，常見于腎小管病變及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿則可見到大、中、小各種分子量區(qū)帶，表示腎小球及腎小管均受累及。
目前用于尿蛋白分離檢測的常規(guī)方法主要有十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和十二烷基硫酸鈉-瓊脂糖凝膠電泳(SDS-AGE)，如Marshall等人曾用SDS-PAGE方法檢測尿液(Marshall T，et al.Clin Chem.1993，39(11)2314-2318)，先向樣品里加入SDS及巰基乙醇，95℃變性10分鐘，電泳3-4小時，進行固定、染色及脫色，然后再掃描得到檢測結(jié)果，因此SDS-PAGE方法的操作非常繁瑣；SDS-AGE方法則依賴昂貴的儀器和試劑，檢測成本很高，如法國Sebia公司生產(chǎn)的電泳儀，儀器價格昂貴，另外，需要配套的試劑盒，因此這些因素大大限制了其應(yīng)用(Le Bricon T，et al.ClinChem.1998，441191-1197.)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種毛細管電泳芯片分離檢測尿蛋白的方法，是一種快速低成本的檢測尿蛋白的方法。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的首先通過微加工工藝制作石英介質(zhì)的毛細管電泳芯片(有關(guān)芯片的制作方法已以“電泳微芯片的制作方法”名稱提出了發(fā)明專利申請，申請?zhí)枮?2110584.7)，然后在管道中充入篩分介質(zhì)，并在加樣池中加入檢測樣品，最后將加樣后的毛細管電泳芯片，置于光學(xué)檢測平臺上，各池中插入相應(yīng)電極，施加適當時序和幅值的電壓進行分離檢測。
與常規(guī)尿蛋白分離檢測技術(shù)相比，利用毛細管電泳芯片分離檢測尿蛋白具有樣品和試劑消耗量少，分離檢測速度快，檢測成本低，檢測裝置易于實現(xiàn)微型化、集成化和自動化等優(yōu)勢。
具體的檢測方法1尿蛋白樣品收集與處理按常規(guī)方法進行樣品收集、過濾與濃縮；并用電泳緩沖液按一定比例進行稀釋，使蛋白終濃度為0.5mg/ml-5mg/ml。
2電泳緩沖液本方法中所用電泳緩沖液為極端緩沖液，即自行配制的PH9.5-10.5、75mM的硼酸緩沖液，經(jīng)0.22um的濾膜過濾。
3毛細管電泳芯片本方法中所用芯片為未涂層芯片，芯片管道內(nèi)徑50-100μm，進樣、分離管道分別長2-4cm和5-10cm。
在PH9.5-10.5、75mM的硼酸緩沖液中，石英玻璃毛細管表面因硅羥基解離會產(chǎn)生負的定域電荷，其結(jié)果是產(chǎn)生指向負極的電滲流。管道中蛋白分子的遷移速度是外加電場、溶劑阻力與電滲流作用的綜合結(jié)果。由于電滲流的作用通常大于粒子所受電場力作用，所以樣品中粒子在管道進行與電滲流方向一致的差速遷移。通過在通道末端安裝上一種檢測器，將各分離組分通過檢測窗口的情況記錄下來，就得到電泳譜圖。
4 電泳檢測將尿蛋白檢測樣品3-4ul加在毛細管電泳芯片的加樣孔中，在其余三個孔里(緩沖液池、廢液池1、廢液池2)及各管道里加入硼酸緩沖液。進樣電壓500-600V，進樣10s，然后停止加壓；在分離管道加分離電壓2000-3000V，分離2min，通過檢測系統(tǒng)的信號收集、自動化處理及分析，即可得到相應(yīng)的檢測結(jié)果。進樣通道和分解通道交叉或“十”字型，交叉處為樣品進樣口，檢測窗口在廢液池端的上面。
5 將微型分析系統(tǒng)檢測結(jié)果與相應(yīng)的臨床資料結(jié)合分析，進一步確定檢測結(jié)果。


圖1為毛細管電泳芯片電壓施加模式圖，左圖為進樣電壓模式，右圖為分離電壓模式，圖中，A端為樣品池，B端為樣品廢液池，C端為緩沖液池，D端為廢液池；進樣通道(AB通道)與分離通道(CD通道)交叉成“十”字型，交叉處為樣品進樣口(加樣孔)，檢測窗口設(shè)在D端上1cm處。
圖2為多發(fā)性骨髓瘤病人的尿液樣品的檢測結(jié)果，在該類病人尿液中檢測到大量免疫球蛋白及白蛋白；圖3為腎病綜合癥病人的尿液樣品的檢測結(jié)果，在該類病人尿液中檢測到大量白蛋白和及少量球蛋白；
具體實施例方式
實施例1毛細管電泳芯片分析多發(fā)性骨髓瘤病人的尿液樣品(14號樣品)1 取500ul多發(fā)性骨髓瘤病人的尿液，濃縮、稀釋，使蛋白終濃度為4mg/ml；2 電泳緩沖液自行配制的PH10.5、75mM的硼酸緩沖液，經(jīng)0.22um的濾膜過濾。
3 毛細管電泳芯片所用芯片為未涂層芯片，芯片管道內(nèi)徑50μm，進樣、分離管道分別長2cm和6cm。
4 電泳檢測將按步驟1處理過的樣品3ul加在毛細管電泳芯片的加樣池里，在其余三個池里(緩沖液池、廢液池1、廢液池2)及管道里加入硼酸緩沖液。進樣電壓500V，進樣10s，然后停止加壓；在分離管道加分離電壓2000V，分離2min，通過檢測系統(tǒng)的信號收集、自動化處理及分析，即可得到相應(yīng)的檢測結(jié)果。
5 檢測結(jié)果經(jīng)檢測，在該多發(fā)性骨髓瘤病人的尿液中有大量免疫球蛋白及白蛋白。而在正常人的尿液里是檢測不到蛋白質(zhì)的。經(jīng)臨床上其他方法的檢測，證實多發(fā)性骨髓瘤病人由于骨髓瘤浸潤腎臟，引起骨髓瘤腎病，導(dǎo)致尿液中含有大量蛋白質(zhì)，主要成分為免疫球蛋白及白蛋白。
實施例2毛細管電泳芯片分析腎病綜合癥病人的尿液樣品(16號樣品)
1 取500ul腎病綜合征病人的尿液，濃縮、稀釋，使蛋白終濃度為4mg/ml；2 電泳緩沖液自行配制的PH10.5、75mM的硼酸緩沖液，經(jīng)0.22um的濾膜過濾。
3 毛細管電泳芯片所用芯片為未涂層芯片，芯片管道內(nèi)徑70μm，進樣、分離管道分別長2cm和5cm。
4 電泳檢測將按步驟1處理過的檢測樣品3ul加在毛細管電泳芯片的加樣池里，在其余三個池(緩沖液池、廢液池1、廢液池2)及管道里加入硼酸緩沖液。進樣電壓500V，進樣10s，然后停止加壓；在分離管道加分離電壓2000V，分離2min，通過檢測系統(tǒng)的信號收集、自動化處理及分析，即可得到相應(yīng)的檢測結(jié)果。
5 檢測結(jié)果經(jīng)檢測，在該腎病綜合癥病人的尿液中有大量白蛋白及少量球蛋白，經(jīng)臨床上其他方法的檢測，證實在腎病綜合癥病人體內(nèi)，由于多種原因?qū)е麓罅康鞍啄?，尿中主要蛋白成分為白蛋白及球蛋白?br> 權(quán)利要求
1 一種毛細管電泳芯片分離檢測尿蛋白的方法，其特征在于首先通過微加工工藝制作石英介質(zhì)的毛細管電泳芯片，然后在管道中沖入篩分介質(zhì)，并在加樣池中加入檢測樣品，最后將加樣后的毛細管電泳芯片置于光學(xué)檢測平臺上，各池中插入相應(yīng)電極，施加適當時序和幅值的電壓進行分離檢測。
2 權(quán)利要求1所述的毛細管電泳芯片分離檢測尿蛋白的方法，包括按常規(guī)方法進行樣品收集、過濾與濃縮，其特征在于(1)用極端電泳緩沖液按比例稀釋樣品；使蛋白的濃度為0.5-5mg/ml；(2)使用的毛細管電泳芯片為未涂層芯片，芯片管道內(nèi)徑50-100um，進樣、分離管道分別長2-4cm和5-10cm；(3)將尿蛋白檢測樣品3-4ul加在毛細管電泳芯片的加樣孔中，在緩沖液池、廢液池1、廢液池2及管道里加入硼酸緩沖液。進樣電壓500-600V，進樣10s，然后停止加壓；在分離管道加分離電壓2000-3000V，分離2min，通過檢測系統(tǒng)的信號收集、自動化處理及分析，即可得到相應(yīng)的檢測結(jié)果。
3 按權(quán)利要求2所述的毛細管電泳芯片分離檢測尿蛋白的方法，其特征在于所述的極端緩沖液為PH9.5-10.5mM的硼酸緩沖液，并經(jīng)0.22um濾膜過濾。
4 按權(quán)利要求2所述的毛細管電泳芯片分離檢測尿蛋白的方法，其特征在于加樣孔位于進樣通道和分解通道的十字型交叉處；檢測窗口位于廢液池端的上面。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛細管電泳芯片分離檢測尿蛋白的方法，其特征在于首先通過微加工工藝制作石英介質(zhì)的毛細管電泳芯片，然后在管道中沖入篩分介質(zhì)，并在加樣池中加入檢測樣品，最后將加樣后的毛細管電泳芯片置于光學(xué)檢測平臺上，各池中插入相應(yīng)電極，施加適當時序和幅值的電壓進行分離檢測。與常規(guī)尿蛋白分離檢測技術(shù)相比，本發(fā)明具有樣品和試劑消耗量少，檢測速度快，成本低等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/493GK1554947SQ20031012286
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月26日
發(fā)明者趙建龍, 賈春平, 李剛, 莊貴生, 王惠民, 孫承龍, 王躍國, 徐良基, 劉菁, 金慶輝, 韓志勇, 王聿佶, 陳翔 申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所, 南通醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究