專利名稱：一種與預(yù)測心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的集成檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)，具體涉及與心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是危害我國人民身體健康最主要的因素之一。隨著高危人群的大量增加，快速準(zhǔn)確地預(yù)測心腦血管病的發(fā)生以及判斷心腦血管病的預(yù)后情況成為迫切需要解決的難題。以往認(rèn)為通過血壓、血糖、血脂以及吸煙等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素就可以評估心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，如果只憑傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素進(jìn)行評估可能會(huì)漏掉50％的急性冠脈綜合癥的患者。隨著研究的深入，一些蛋白質(zhì)作為新的危險(xiǎn)因素和標(biāo)志物成為研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)代檢測技術(shù)的進(jìn)步和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，使從蛋白質(zhì)標(biāo)志物著手研究心腦血管病發(fā)生的預(yù)測工具成為可能。由于現(xiàn)有檢測方法如免疫比濁法大部分只能檢測單個(gè)指標(biāo)，而單個(gè)指標(biāo)的準(zhǔn)確率較低，如果要評估多個(gè)指標(biāo)必須反復(fù)作多次實(shí)驗(yàn)，不便于臨床開展。高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(Hcy)、脂蛋白a(LP(a))、血栓前體蛋白(TpP)、D-二聚體(D-dimer)、纖維蛋白原(Fig)、von Willebrand因子(vWF)等被認(rèn)為是能夠預(yù)測冠心病、腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，要探討這些蛋白標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價(jià)值，闡明其在心腦血管疾病事件預(yù)測中的綜合作用，研究一種高度集成的蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢測技術(shù)，將多種指標(biāo)的檢測方法統(tǒng)一在一個(gè)平臺之上，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)簡便、快捷、準(zhǔn)確的獲得多個(gè)甚至上百個(gè)指標(biāo)的信息，為準(zhǔn)確預(yù)測心腦血管事件提供全面的依據(jù)，及早發(fā)現(xiàn)心腦血管病的高危對象，及時(shí)進(jìn)行有效干預(yù)，減少心腦血管疾病事件的發(fā)生，是一項(xiàng)具有極其重要價(jià)值的研究課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種與預(yù)測心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的集成檢測技術(shù)，從而簡便、快捷地分析人體內(nèi)與心腦血管事件發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的變化，以及早發(fā)現(xiàn)心腦血管病的高危對象，及時(shí)進(jìn)行有效干預(yù)，減少心腦血管事件的發(fā)生。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的技術(shù)方案為一種與預(yù)測心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的集成檢測方法，包括相關(guān)蛋白標(biāo)志物的確定，捕捉抗體的制備，檢測抗體的制備以及樣品的測定，本發(fā)明一次檢測同一樣品中與心腦血管病相關(guān)的hs-CRP、Hcy、LP(a)、TpP、D-dimer、Fig和vWF中的三種或三種以上蛋白標(biāo)志物，具體步驟為(1)捕捉抗體的制備，將確定的三種或三種以上蛋白標(biāo)志物的單抗包被在聚苯乙烯熒光微珠固體基質(zhì)上，用羊抗鼠IgG-生物素測定抗體的包被效率，(2)檢測抗體的制備，另將上述三種或三種以上蛋白標(biāo)志物另一不同抗原表位的單抗加入BAC-S-NHS，進(jìn)行生物素標(biāo)記，純化后測定抗體含量，計(jì)算生物素標(biāo)記效率，(3)樣品的測定[1]包被好抗體的蛋白標(biāo)志物微珠懸液于96孔抽濾板的液相體系中，[2]抽濾板中分別加入血清樣品或各種蛋白標(biāo)志物不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品，[3]加入生物素標(biāo)記的蛋白標(biāo)志物的檢測抗體，[4]PE染色后液相蛋白芯片閱讀儀檢測。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明。


圖1與心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物集成檢測技術(shù)流程圖；圖2Bio-plex液相蛋白芯片閱讀儀檢測包被了單抗的微珠的熒光值；圖3過柱收集10管標(biāo)記抗體穿流液的A280和A500檢測；圖4紫外-可見光分光光度計(jì)檢測收集的第4、5管標(biāo)記抗體A280和A500值；圖5紫外分光光度計(jì)檢測IgG抗體濃度為1mg/ml時(shí)的A280值(E280)；圖6生物素標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1、與心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物的確定冠心病(心肌梗死、心絞痛)和腦卒中是主要的心腦血管疾病，而hs-CRP、Hcy、LP(a)、TpP、D-dimer、Fig和vWF被認(rèn)為是能夠預(yù)測冠心病、腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。集成檢測技術(shù)選擇其中3種或3種以上的蛋白質(zhì)作為檢測標(biāo)志物。
2、蛋白標(biāo)志物集成檢測技術(shù)的設(shè)計(jì)采用液相芯片體系將3種或3種以上的蛋白標(biāo)志物單抗包被在不同色彩編號微珠上，將這些微珠懸浮于一個(gè)液相體系中，利用這個(gè)系統(tǒng)對同一個(gè)樣品中的3種或3種以上蛋白標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測，具體檢測步驟如下液相懸浮微珠法檢測步驟2.1、多種蛋白標(biāo)志物單抗的聚苯乙烯熒光微珠包被取300～700μl微珠，14000g離心4min，棄上清，加入240～560μl微珠洗滌緩沖液，震蕩30s，50Hz超聲30s，14000g離心4min，棄上清，加入240～560μl微珠活化緩沖液，震蕩30s，50Hz超聲30s，加入30～70μl EDC和30～70μl S-NHS，1400轉(zhuǎn)震蕩20min，14000g離心4min，棄上清，加入500μl～1ml PBS洗滌，震蕩30s，50Hz超聲30s，14000g離心4min，棄上清，加入300～700μl PBS重懸，分裝成3～7管，每管分別加入3～7種蛋白標(biāo)志物單抗各9μg，補(bǔ)充PBS至每管500μl終體積，4℃，1400轉(zhuǎn)震蕩過夜；14000g離心4min，棄上清，每管分別加入500μl PBS洗滌，加入250μl封閉緩沖液，1400轉(zhuǎn)震蕩20min，每管分別加入500μl儲存緩沖液洗滌，16000g離心6min，棄上清，每管分別加入150μl儲存緩沖液重懸，用羊抗鼠IgG-生物素檢測抗體的包被效率。
2.2、多種蛋白標(biāo)志物單抗的生物素標(biāo)記將3～7種蛋白標(biāo)志物另一不同抗原表位的單抗分別稀釋成1mg/ml，加入7.6μlBAC-S-NHS(5mg/ml)，1400轉(zhuǎn)震蕩30min，將標(biāo)記生物素的抗體過sephadex-G25柱純化，依次收集10管穿流液，每管1ml，紫外分光光度計(jì)測定抗體含量(A280值)，測定IgG抗體濃度為1mg/ml時(shí)的A280值(E280)，計(jì)算公式為蛋白(mg/ml)＝A280/E280；測定抗體標(biāo)記的生物素含量(A500值)；計(jì)算3～7種蛋白標(biāo)志物單抗的標(biāo)記生物素與蛋白的比例(摩爾分子比)，表示抗體的生物素標(biāo)記效率。
2.3、蛋白標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和血清樣品的檢測各種蛋白標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)品按400，200，100，50，25，10，5，0ng/L的濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。96孔板中每孔加入100μl包被好的微珠(1∶100稀釋)，洗滌緩沖液洗滌20次，抽濾，加入100μl各梯度濃度的各種蛋白標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)品，作3重復(fù)孔，其它孔加入100μl待測血清樣品(1∶105稀釋)，600轉(zhuǎn)震蕩1h；抽濾，洗滌緩沖液洗滌3次，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體100μl(2μg)，600轉(zhuǎn)震蕩30min；抽濾，洗滌緩沖液洗滌3次，加入50μl PE(1∶25稀釋)，600轉(zhuǎn)震蕩10min；抽濾，洗滌緩沖液洗滌3次，加入125μl分析緩沖液重懸；采用Bio-plex液相蛋白芯片微珠閱讀儀檢測。
微珠洗滌緩沖液(Bead wash buffer)；微珠活化緩沖液(Bead activation buffer)；PBS，PH 7.4；封閉緩沖液(Blocking buffer)；儲存緩沖液(Staining buffer)；上述溶液由Bio-rad公司的微珠包被試劑盒內(nèi)提供。
0.1M磷酸鹽緩沖液(0.1M Sodium Phosphate Buffer)；生物素化試劑(BiotinylationReagent)；鏈霉蛋白酶(Pronase)；由Sigma公司的抗體生物素標(biāo)記試劑盒內(nèi)提供。
Bio-plex液相蛋白芯片微珠閱讀儀及隨機(jī)配套的分析軟件，各種蛋白標(biāo)志物的單抗及抗原標(biāo)準(zhǔn)品購自Biodesign公司，聚苯乙烯熒光微珠，微珠包被試劑盒購自Bio-rad公司，抗體的生物素標(biāo)記試劑盒購自Sigma公司，本發(fā)明的蛋白標(biāo)志物集成檢測技術(shù)診斷冠心病的靈敏度和特異度明顯優(yōu)于單個(gè)指標(biāo)檢測的免疫比濁法(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1)。
表1 液相芯片法與免疫比濁法比較對CHD的診斷價(jià)值

脂蛋白(a)(Lp(a))、纖維蛋白原(Fig)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)聯(lián)合檢測對冠心病患者診斷的特異度(93.6％)高于單一指標(biāo)的檢測方法Lp(a)(70.3％)、Fig(75.7％)、hs-CRP(86.5％)；聯(lián)合檢測對冠心病患者診斷的靈敏度(88.7％)高于單一指標(biāo)的檢測方法Lp(a)(73.9％)、Fig(56.5％)、hs-CRP(63.0％)；該方法提高了對冠心病診斷的靈敏度和特異度，明顯優(yōu)于單個(gè)指標(biāo)檢測方法。
本發(fā)明建立了一種與預(yù)測心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的集成檢測技術(shù)，不僅簡便、快捷、而且顯著提高了對心腦血管病發(fā)生預(yù)測的準(zhǔn)確率。
具體實(shí)施例方式
冠心病診斷的3種相關(guān)蛋白標(biāo)志物的集成檢測方法1、研究對象待測血清樣品采集2004年10月-2005年5月在本院住院，有胸悶、胸痛等癥狀，疑診冠心病患者240例，排除肝腎功能不全、感染、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、凝血功能障礙以及近期有大手術(shù)史、急性心肌梗死急性期、血清磷酸肌酸激酶(CPK)升高大于正常值2倍以上等可能影響hs-CRP的情況后，共有100例符合標(biāo)準(zhǔn)納入研究，其中男性59例，女性41例，年齡59±11歲，同時(shí)記錄患者的高血壓、糖尿病、高血脂、既往心肌梗死病史。所有患者均接受冠狀動(dòng)脈造影檢查。冠心病組冠狀動(dòng)脈造影顯示左主干、左前降支、左回旋支、右冠脈4支血管中至少1支直徑狹窄程度≥50％，共53例；非冠心病組冠狀動(dòng)脈造影顯示所有血管直徑狹窄程度＜50％者歸為對照組，共47例；患者均清晨空腹采血。
2、蛋白標(biāo)志物的選擇脂蛋白(a)、纖維蛋白原和高敏C反應(yīng)蛋白作為冠心病診斷的集成檢測技術(shù)的3種相關(guān)蛋白檢測標(biāo)志物；
3、液相懸浮微珠法(液相蛋白芯片法)檢測方法3.1、捕獲抗體的制備-3種蛋白標(biāo)志物單抗的聚苯乙烯熒光微珠包被取300μl微珠，14000g離心4min，棄上清，加入240μl微珠洗滌緩沖液，震蕩30s，50Hz超聲30s，14000g離心4min，棄上清，加入240μl微珠活化緩沖液，震蕩30s，50Hz超聲30s，加入30μl EDC和30μl S-NHS，1400轉(zhuǎn)/分，震蕩20min，14000g離心4min，棄上清，加入500μl PBS洗滌，震蕩30s，50Hz超聲30s，14000g離心4min，棄上清，加入300μl PBS重懸，分裝成3管，每管分別加入脂蛋白(a)、纖維蛋白原和高敏C反應(yīng)蛋白的單抗7μg、12μg、9μg，補(bǔ)充PBS至每管500μl終體積，4℃，1400轉(zhuǎn)/分，震蕩過夜；14000g離心4min，棄上清，每管分別加入500μl PBS洗滌，加入250μl封閉緩沖液，1400轉(zhuǎn)/分，震蕩20min，每管分別加入500μl儲存緩沖液洗滌，16000g離心6min，棄上清，每管分別加入150μl儲存緩沖液重懸，用羊抗鼠IgG-生物素檢測抗體的包被效率，結(jié)果表明包被檢測的熒光值為25500-26500FI，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過2000FI的的最低包被熒光值。見圖2和表2。
表2 每100μl微珠分別包被不同量的3種單抗的最高平均熒光值

3.2、檢測抗體的制備-3種蛋白標(biāo)志物單抗的生物素標(biāo)記將3種蛋白標(biāo)志物另一不同抗原表位的單抗分別稀釋成1mg/ml，加入7.6μlBAC-S-NHS(5mg/ml)，1400轉(zhuǎn)/分，震蕩30min，將標(biāo)記生物素的抗體過sephadex-G25柱純化，依次收集10管穿流液，每管1ml，紫外-可見光分光光度計(jì)的A280檢測蛋白含量，A500檢測生物素標(biāo)記效率，見圖3；其中純化的抗體主要集中在第4、5管，見圖4；紫外分光光度計(jì)測定抗體含量(A280值)，測定IgG抗體濃度為1mg/ml時(shí)的A280值(E280)，見圖5；生物素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6；計(jì)算公式為蛋白(mg/ml)＝A280/E280；測定抗體標(biāo)記的生物素含量(A500值)；計(jì)算3種蛋白標(biāo)志物單抗的標(biāo)記生物素與蛋白的比例(摩爾分子比)，表示抗體的生物素標(biāo)記效率，結(jié)果表明每種抗體的生物素標(biāo)記效率約為12，即每摩爾分子的抗體蛋白有12摩爾分子的生物素被標(biāo)記上。
3.3 3種蛋白標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和血清樣品的檢測3種蛋白標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)品按400，200，100，50，25，10，5，0ng/L的濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，96孔板中每孔加入100μl包被好的微珠(1∶100稀釋)，洗滌緩沖液洗滌2次，抽濾，加入100μl各梯度濃度的3種蛋白標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)品，作3重復(fù)孔，其它孔加入100μl患者清晨空腹采血的血清樣品(1∶105稀釋)，600轉(zhuǎn)/分，震蕩1h；抽濾，洗滌緩沖液洗滌3次，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體100μl(2μg)，600轉(zhuǎn)/分，震蕩30min；抽濾，洗滌緩沖液洗滌3次，加入50μl鏈霉親和素標(biāo)記的PE熒光素(1∶25稀釋)染色，600轉(zhuǎn)/分，震蕩10min；抽濾，洗滌緩沖液洗滌3次，加入125μl分析緩沖液重懸；采用Bio-plex液相蛋白芯片微珠閱讀儀檢測。
檢測結(jié)果液相芯片法檢測血漿中脂蛋白a、纖維蛋白原和高敏C反應(yīng)蛋白值

續(xù)上表

續(xù)上表

注冠心病判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)冠脈造影的結(jié)果；1表示是冠心病；0表示不是冠心病。
各種檢測物參數(shù)的陽性界限分別為Lp(a)≥300mg/L、Fig≥4.0g/L、hs-CRP≥4.5mg/L；以冠脈造影的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明的蛋白標(biāo)志物集成檢測技術(shù)診斷冠心病的靈敏度為88.7％；特異度為93.6％。
權(quán)利要求
1.一種與預(yù)測心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的集成檢測方法，包括相關(guān)蛋白標(biāo)志物的確定，捕捉抗體的制備，檢測抗體的制備以及樣品的測定，本發(fā)明的特征在于(1)檢測樣品采用的相關(guān)蛋白標(biāo)志物為與心腦血管病相關(guān)的hs-CRP、Hcy、脂蛋白(a)、TpP、D-二聚體、纖維蛋白原和vWF中的三種或三種以上蛋白標(biāo)志物；(2)捕捉抗體的制備，將確定的三種或三種以上蛋白標(biāo)志物的單抗包被在聚苯乙烯熒光微珠固體基質(zhì)上，用羊抗鼠IgG-生物素測定抗體的包被效率；(3)檢測抗體的制備，另將上述三種或三種以上蛋白標(biāo)志物另一不同抗原表位的單抗加入BAC-S-NHS，進(jìn)行生物素標(biāo)記，純化后測定抗體含量，計(jì)算生物素標(biāo)記效率；(4)樣品的測定[1]包被好抗體的蛋白標(biāo)志物微珠懸液于96孔抽濾板的液相體系中，[2]抽濾板中分別加入血清樣品或蛋白標(biāo)志物不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品，[3]加入生物素標(biāo)記的蛋白標(biāo)志物的檢測抗體，[4]PE染色后液相蛋白芯片閱讀儀檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及與心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的檢測技術(shù)。集成檢測技術(shù)是指對同一樣品一次檢測多種與心腦血管病發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物，本發(fā)明采用液相芯片法，在聚苯乙烯熒光微珠上包被心腦血管病事件相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物的相應(yīng)抗體，用來捕捉被測液體中對應(yīng)的蛋白標(biāo)志物，并利用各蛋白標(biāo)志物的檢測抗體來測定樣品中各蛋白標(biāo)志物的濃度，集成檢測能在較短的時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確的獲得多個(gè)指標(biāo)的信息，與單一指標(biāo)的免疫比濁法比較，靈敏度在80％以上，特異度在90％以上，因此集成檢測可以為準(zhǔn)確預(yù)測心腦血管病的發(fā)生提供全面的依據(jù)，明顯提高對心腦血管病發(fā)生預(yù)測的準(zhǔn)確率。
文檔編號G01N33/68GK1773283SQ20051003236
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日
發(fā)明者袁洪, 閭宏偉, 黃志軍 申請人:袁洪, 閭宏偉, 黃志軍