專利名稱：腫瘤抑制蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合并調(diào)節(jié)諸如p53的腫瘤抑制蛋白活性的蛋白；編碼所述蛋白的核酸分子和調(diào)節(jié)所述多肽對其靶多肽的結(jié)合活性的篩選方法。
腫瘤抑制基因編碼能抑制細胞生長或分裂的蛋白質(zhì)，因此對于維持正常細胞的增殖、生長和分化很重要。腫瘤抑制基因中的突變產(chǎn)生了異常細胞周期過程，由此，例如當(dāng)DNA被破壞時，停止細胞周期的正常細胞周期檢測點被忽視，并且損害的細胞不可控制地分裂。腫瘤抑制基因的產(chǎn)物在細胞的所有部分起作用(例如細胞表面、細胞質(zhì)、細胞核)，以防止已被損害的細胞通過細胞周期途徑(即，G1、S、G2、M和細胞質(zhì)分裂)。一些腫瘤抑制基因已被分離并測序。這些包括視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因(Rb)、與諸如骨癌(骨肉瘤)、膀胱癌、小細胞肺癌和乳腺癌，以及視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤有關(guān)的突變。Wilms腫瘤1基因(WT-1)，與腎癌和神經(jīng)纖維瘤有關(guān)的突變。
可論證地，已經(jīng)成為最熱門研究課題的腫瘤抑制基因是p53。p53編碼了作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用并且是細胞分裂周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的蛋白質(zhì)。在1978年(Lane與Crawford，1979)發(fā)現(xiàn)它作為蛋白質(zhì)顯示親和性地與SV40大T抗原結(jié)合。p53基因編碼了具有53kDa的393個氨基酸多肽。p53的最重要的腫瘤抑制功能之一是它能夠誘導(dǎo)細胞凋亡。細胞凋亡或程序性細胞死亡，是一種多細胞有機體調(diào)節(jié)細胞數(shù)量和分化的過程。該過程通過誘導(dǎo)或者阻止細胞凋亡的因子進行調(diào)節(jié)。細胞凋亡的誘導(dǎo)劑包括Bcl-2家族成員、caspase(半胱天冬酶)家族成員以及他們有關(guān)聯(lián)的因子Apaf-1和Fadd。caspase作為酶原被合成，并通過蛋白裂解來活化。然后活化的caspase誘導(dǎo)許多與細胞凋亡有關(guān)的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的變化。
線粒體通過釋放諸如細胞色素c、AIF和Diablo的促凋亡因子在活化過程中起到關(guān)鍵作用。Bcl-2蛋白家族控制其從線粒體的釋放(例如，Bcl-2和Bcl-x1抑制釋放；Bax和Bak誘導(dǎo)釋放)。
國際公開WO2/12325所描述的稱為iASPP的多肽是參與細胞凋亡調(diào)節(jié)試劑的另一個例子。
我們描述了變體iASPP多肽，其具有區(qū)別于國際公開WO2/12325中公開的多肽的特征。與iASPP比較，該稱為iASPP6C的多肽在它的氨基末端延長并優(yōu)先結(jié)合到p53上。當(dāng)與WO2/12325中公開的較短的版本比較時，iASPP C6優(yōu)先結(jié)合p53。該較短的版本優(yōu)先結(jié)合細胞凋亡誘導(dǎo)蛋白Bcl 2。
iASPP C6是可能在體內(nèi)控制iASPP C6代謝(turnover)的泛素化的多肽。泛素是在種屬間高度保存的76個氨基酸所組成的小蛋白。泛素具有的最重要的功能是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝。近幾年的研究已經(jīng)鑒別了參與泛素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解的許多附屬蛋白質(zhì)。第一步是將泛素連接到欲降解的被指定的靶蛋白質(zhì)。這一步由三種被稱為E1、E2和E3的蛋白質(zhì)來介導(dǎo)。泛素通過E1活化酶首先被活化，該E1活化酶是通過硫酯鍵連接到泛素的兩個相同的105kDa亞基所組成的同型二聚體?；罨笫荅1泛素軛合物被E2(被稱為載體蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)運。E2蛋白質(zhì)在大小上明顯地不同但有一些保守元件。E2蛋白質(zhì)從E1接受了泛素并再次通過硫酯鍵形成第二復(fù)合物。E3蛋白質(zhì)可參與或不參與最后的步驟，該步驟是將泛素轉(zhuǎn)換成蛋白底物。隨后被降解該泛素化蛋白質(zhì)的蛋白酶識別。該蛋白酶可以是被稱為蛋白體的部分結(jié)構(gòu)，所述蛋白體是蛋白酶和有關(guān)協(xié)同因子的大型多亞基復(fù)合物。在一些實例中，蛋白質(zhì)可以被聚泛素化，是由被連接到泛素蛋白的泛素蛋白產(chǎn)生的，該泛素蛋白已經(jīng)連接到靶蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了分離的多肽或變體多肽，其中所述多肽由

圖1a所示的氨基酸序列表示，其變體是通過至少一個氨基酸殘基的添加、刪除和取代而修飾的，其特征是所述多肽具有下列特征i)當(dāng)與由圖2a所示氨基酸序列所表示的多肽比較時，優(yōu)先結(jié)合腫瘤抑制多肽p53以抑制p53的促凋亡活性的多肽或其變體；ii)包括至少一個氨基酸殘基被泛素化的多肽；和
iii)包含氨基末端多肽結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述結(jié)構(gòu)域由圖1a所示的氨基酸1-483的氨基酸序列所表示。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，當(dāng)與圖2a所示的氨基酸序列代表的多肽比較時，所述多肽優(yōu)先結(jié)合p53。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，所述多肽被至少一個氨基酸殘基的添加、缺失或取代所修飾，其中，所述修飾在圖1a所表示的氨基酸序列的氨基酸殘基+1至+483。
確定本文所公開的多肽的結(jié)合的分析，例如，本領(lǐng)域已知的和本申請所描述的p53。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，所述多肽包含圖1a所示的氨基酸序列。優(yōu)選的所述多肽由圖1a所示的氨基酸序列所組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼本發(fā)明的多肽。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明所述核酸分子由圖1b所示的核酸序列所表示，或者是在嚴格的雜交條件下與圖1b所示的序列雜交并編碼本發(fā)明多肽的核酸分子。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述核酸分子由圖1b所示的核酸序列組成。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，所示分離的核酸分子是cDNA。在本發(fā)明可選擇的優(yōu)選實施方式中所述核酸分子是基因組DNA。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸分子的載體。優(yōu)選所述載體是適合于所述多肽的重組表達的表達載體。
優(yōu)選地，所述載體適合于原核基因表達。在本發(fā)明可選擇的實施方式中，所述載體適合于真核基因表達。
作為實例但不作為限制的方式，通常所述的適應(yīng)包括介導(dǎo)細胞/組織特異表達的轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動子序列)的提供。這些啟動子序列可以是細胞/組織特異的、可誘導(dǎo)的或組成型的。
啟動子是本領(lǐng)域認可的術(shù)語并包括例如但不受限制的以下特征。增強子元件是經(jīng)常在基因的轉(zhuǎn)錄起始位點5’發(fā)現(xiàn)的(增強子也可在基因序列3’端或者甚至位于內(nèi)含子序列并因此其位置有獨立性)的順式(cis)作用核酸序列。增強子的功能是增加其連接的基因的轉(zhuǎn)錄率。增強子活性是對反式作用轉(zhuǎn)錄因子(多肽)的反應(yīng)，該因子已顯示出特異結(jié)合到啟動子元件。轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合/活性(請看圣地亞哥AcademicPress有限公司David S Latchman的“真核轉(zhuǎn)錄因子”(EukaryoticTranscription Factors))是對許多環(huán)境的信號作出的反應(yīng)，所述信號包括，例如但不限于中間代謝產(chǎn)物或環(huán)境作用因子，例如溫度。
啟動子元件也包括起到選擇轉(zhuǎn)錄起始位點作用的所謂的TATA框和RNA聚合酶起始選擇(RIS)序列。這些序列也結(jié)合多肽，該多肽起到通過RNA聚合酶的選擇尤其促進轉(zhuǎn)錄起始的作用。適應(yīng)性也包括提供在真核細胞或原核宿主內(nèi)都可促進所述載體維持的選擇標志和自我復(fù)制序列。自我維持的載體指的是游離基因的載體。由于這些分子可以結(jié)合大DNA片段(30-50kb DNA)，因此游離基因的載體是理想的。這類游離基因的載體公開在WO98/07876。
促進載體編碼基因表達的適應(yīng)性包括提供轉(zhuǎn)錄末端/聚腺苷酸化序列的基因。這也包括提供內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，其起到了最大化排列在雙順反子或多順反子表達盒中的載體編碼基因表達的作用。
這些適應(yīng)性是本領(lǐng)域所公知的。一般地，有大量的關(guān)于表達載體構(gòu)建和重組DNA技術(shù)的公開文獻。請參見，Sambrook等人(1989)的分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)、ColdSpring Harbour Laboratory、Cold Spring Harbour、NY及其中的參考文獻；Marston，F(xiàn)(1987)DNA克隆英國牛津大學(xué)IRL出版社A PracticalApproach卷III；DNA克隆John Wiley & Sons公司(1994)F M Ausubel等人，現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法(Current Protocols in Molecular Biology)。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法，包括i)提供用本發(fā)明核酸分子轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細胞；ii)在有助于制備所述多肽的條件下培養(yǎng)所述細胞；以及i)從所述細胞或其生長環(huán)境中純化所述多肽。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中本發(fā)明所述核酸分子是本發(fā)明的載體。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述載體編碼分泌信號以促進所述多肽的純化，并因此而提供所述重組多肽。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了結(jié)合本發(fā)明所述多肽的抗體，其特征是所述抗體結(jié)合圖1a所示的氨基酸序列的氨基酸殘基+1至+483的所述多肽。
優(yōu)選地所述抗體不結(jié)合圖1a所示的氨基酸序列的序列+484至+828所代表的所述多肽。
抗體，也被稱作免疫球蛋白，是對外來分子(抗原)通常具有特異性的蛋白分子。免疫球蛋白是一種由兩對多肽鏈、一對輕(L)(低分子量)鏈(κ或λ)和一對重(H)鏈(γ、α、μ、δ和∈)所組成的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)，所有這四種鏈都通過二硫鍵結(jié)合在一起。H和L鏈都具有對結(jié)合抗原起作用并從一個Ig分子到另一個Ig分子之間高度可變的區(qū)域。另外，H和L鏈包含非可變或恒定區(qū)域。
L鏈由兩個結(jié)構(gòu)域組成。在指定的類型的L鏈之中，羧基末端結(jié)構(gòu)域基本上是相同的，并稱為“恒定”(C)區(qū)。在L與L鏈之間，氨基末端結(jié)構(gòu)域是可變的并是該抗體的結(jié)合位點。因為其可變性，該區(qū)被稱為“可變”(V)區(qū)。
Ig分子的H鏈有幾類，α、μ、σ、α和γ(其又可分為幾種亞類)。裝配好的Ig分子由兩種相同的H和L鏈的一種或多種單位組成，并根據(jù)其具有的H鏈來命名。因此，有五種Ig同種型(isotypes)IgA，IgM，IgD，IgE和IgG(根據(jù)H鏈的“恒定”區(qū)的不同，其還有四種亞型，即IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)。有關(guān)抗體結(jié)構(gòu)及其不同功能的進一步詳細的資料可參見，抗體應(yīng)用實驗室手冊(Using AntibodiesA laboratorymanual)，Cold Spring Harbour Laboratory Press。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，所述片段為Fab片段。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，所述抗體選自F(ab′)2，F(xiàn)ab，F(xiàn)v和Fd片段；且抗體包含CDR3區(qū)。
優(yōu)選地，所述片段是單鏈抗體可變區(qū)(scFV’s)或功能結(jié)構(gòu)域抗體。如果存在產(chǎn)生特異單克隆抗體的雜交瘤，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知，通過RT PCR從所述雜交瘤中提取的mRNA中分離scFv’s?？蛇x擇地，可用噬菌體展示技術(shù)來篩選表達scFV’s的克隆。功能結(jié)構(gòu)域抗體是抗體的最小結(jié)合部分(大約13kDa)。這種技術(shù)的例子如專利US6,248,516、US6,291,158、US6,127,197和EP0368684中的公開，本文將其全部引入用作參考。
修飾抗體、或抗體變體以及參考抗體，可通過一種或多種替代、添加、缺失、平截以及其任意的組合使氨基酸序列不同。優(yōu)選的變體是通過保守氨基酸替代而不同于參考多肽的變體。這種替代是通過類似特性的另一種氨基酸替代指定氨基酸。以下非限制列出的氨基酸可考慮進行保守的替代(相似)a)丙氨酸，絲氨酸，和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和賴氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸，及f)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。最高優(yōu)選的是顯示增強生物活性的變體。
優(yōu)選地所述抗體是人源化或嵌合抗體。
通過重組方法來產(chǎn)生嵌合抗體，從而含有抗體的可變區(qū)以及人抗體的不變或恒定區(qū)。
通過重組的方法來產(chǎn)生人源化抗體，從而將抗體的互補決定區(qū)(CDRs)與人抗體的恒定(C)區(qū)和可變(V)區(qū)的框架區(qū)結(jié)合。
嵌合抗體是重組抗體，其中小鼠或大鼠抗體的所有V區(qū)與人抗體的C區(qū)結(jié)合。人源化抗體是重組的雜交抗體，其將來自嚙齒動物抗體V區(qū)的所述的互補決定區(qū)與來自人抗體V區(qū)的框架區(qū)融合。同時也使用來自人抗體的C區(qū)。該互補決定區(qū)(CDRs)處于該抗體的重鏈和輕鏈的N末端功能結(jié)構(gòu)域，在此限定V區(qū)變異的大部分。這些區(qū)域形成該抗體分子表面的環(huán)。這些環(huán)提供了抗體與抗原間的結(jié)合表面。
來自非人類的抗體激發(fā)對外來抗體的免疫反應(yīng)并從循環(huán)中去除該抗體。來自非人類的抗體激發(fā)對外來抗體的免疫反應(yīng)并從循環(huán)重去除該抗體。當(dāng)注射到人個體時，嵌合和人源化抗體均具有降低的免疫原性，因為在重組雜交抗體中嚙齒動物(即外來)抗體量減少，而人抗體區(qū)并不產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這導(dǎo)致對該抗體的較弱的免疫反應(yīng)和降低的清除率。當(dāng)利用治療性抗體治療人類疾病時，這是非常需要的?？蓪⑷嗽椿贵w設(shè)計成具有更少的“外來”抗體區(qū)域并由此設(shè)想比嵌合抗體具有更少的免疫原性。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用作藥物的多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用作藥物的核酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述藥物還含有稀釋劑、載體或賦形劑。
當(dāng)給藥時，本發(fā)明的治療組合物可以藥物可接受的制劑形式來給藥。這種制劑通常包括藥物可接受的鹽濃縮物，緩沖劑、防腐劑、匹配的載體、諸如佐劑和細胞因子的輔助免疫強化劑、以及任選的諸如化療劑的其它治療劑。
本發(fā)明的治療劑可以通過任何常規(guī)的途徑給藥，包括一段時間的注射和逐步的輸注。可例如，口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和透皮給藥。當(dāng)使用抗體進行治療時，優(yōu)選的給藥途徑是肺氣霧劑給藥。制備含有抗體的氣霧劑傳輸系統(tǒng)的技術(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的。一般而言，這種系統(tǒng)應(yīng)使用不顯著破壞該抗體生物學(xué)特性的組分，例如抗體決定簇結(jié)合能力(參見例如，Sciarra與Cutie，“氣霧劑”inRemington’s Pharmaceutical Sciences(雷明頓制藥學(xué))，18th edition，1990，pp 1694-1712；引用作為參考)。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員容易確定制備抗體氣霧劑的參數(shù)和條件而無需過多的試驗。當(dāng)使用本發(fā)明的反義制劑時，優(yōu)選緩慢的靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明的組合物以有效量給藥?！坝行Я俊睘榻M合物單獨和與另外的劑量一起的產(chǎn)生了所需的反應(yīng)的組合物量。在治療具體疾病的情況下，例如癌癥，所需的反應(yīng)是疾病進程的抑制。這可以包括該疾病進程的暫時性減緩，盡管更優(yōu)選地，其包括永久地阻斷該疾病的進程?？赏ㄟ^常規(guī)的方法或通過在本文中討論的本發(fā)明的診斷方法來監(jiān)測該疾病的進程。
當(dāng)然這種量依賴于治療的具體疾病狀態(tài)，該疾病狀態(tài)的嚴重程度，個體患者的參數(shù)包括年齡、物理狀態(tài)、身高和體重、治療的時間、同時治療的性質(zhì)(如果有)，給藥的特異途徑以及健康實踐者知識和經(jīng)驗范圍內(nèi)的類似因素。這些因素是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的，并僅通過常規(guī)試驗即可得到。通常優(yōu)選為使用的單獨組分或其組合的最大劑量，即根據(jù)合理的醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)理解，雖然出于醫(yī)療原因、心理因素或?qū)嶋H中的任何其它原因，患者可堅持較低劑量或耐受劑量。
用在前述方法中的藥物組合物優(yōu)選是無菌的并含有有效量的例如顯性陰性iASPPC6或者編碼顯性陰性iASPPC6的核酸、從而在適合對患者給藥的重量和體積單位中產(chǎn)生所需反應(yīng)。這些反應(yīng)可通過例如以下的方式被檢測的，例如，通過報告系統(tǒng)確定由所述顯性陰性iASPPC6組合物抑制的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，測量諸如基因表達的下游作用，或者測量iASPPC6組合物的生理學(xué)作用，諸如腫瘤的消退、疾病癥狀的減少、凋亡的調(diào)節(jié)等等。
根據(jù)不同的參數(shù)特別是根據(jù)給藥的方式以及該個體的狀態(tài)可選擇對個體給藥的顯性陰性iASPPC6多肽或核酸的劑量。其它的因素包括治療所需的時間。如果應(yīng)用的起始劑量不足以在個體中產(chǎn)生反應(yīng)，可采用更高的劑量(或利用不同的、更局限的傳輸途徑的有效的更高劑量)來擴展患者的耐受允許。
通常，根據(jù)本領(lǐng)域的標準方法，以1ng至約500mg，以及10ng至100mg的劑量配制和給藥藥物的劑量。當(dāng)使用編碼顯性陰性iASPPC6的核酸時，根據(jù)本領(lǐng)域的標準方法，以1ng至0.1mg的劑量配制和給藥。iASPPC6組合物給藥的其它方案是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的，其中劑量、給藥時間表、注射部位、與前述的有所不同的給藥方式(例如，瘤內(nèi))等等。對非人的哺乳動物的iASPPC6組合物的給藥，例如試驗?zāi)康幕颢F醫(yī)治療目的，以與上述基本相同的條件進行。本文所采用的個體為哺乳動物，優(yōu)選人，并包括非人的靈長類，牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒類。
當(dāng)給藥時，本發(fā)明的藥物制劑以藥物可接受的量并在藥物可接受的組合物中使用。術(shù)語“藥物可接受的”指非毒性材料，其不干擾活性成分的生物活性的有效性。這種制劑可常規(guī)的包含鹽、緩沖劑、防腐劑、匹配的載體、以及任選的其它治療劑。當(dāng)在醫(yī)藥中使用時，所述的鹽為藥物可接受的，但是非藥物可接受的鹽也可常規(guī)地用于制備其藥物可接受的鹽并不排除在本發(fā)明的范圍中。這種藥理學(xué)和藥物可接受的鹽包括但不限于，從以下酸中制備的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、蟻酸、丙二酸、琥珀酸等等。同時，藥物可接受的鹽也可制備成如鈉、鉀或鈣的堿金屬或堿土金屬鹽。
如果需要，iASPPC6組合物可與藥物可接受的載體結(jié)合。本文所用術(shù)語“藥物可接受的載體”指一種或多種匹配的固體或液體裝填物、稀釋劑或封裝物質(zhì)，其適于對人給藥。術(shù)語“載體”指有機或無機成分、天然和合成的，其與活性成分結(jié)合以便應(yīng)用。以沒有基本破壞所需藥物有效性的相互作用的方式，藥物組合的組分也能夠與本發(fā)明的所述分子相互共混合。
所述藥物組合物也可包含適合的緩沖劑，包括乙酸鹽；檸檬酸鹽；硼酸鹽；以及磷酸鹽。
所述藥物組合也可任意地包含適合的防腐劑，例如氯化芐烷胺；氯代丁醇；對羥基苯甲酸酯和乙基汞硫代水楊酸鈉。
所述藥物組合物可以存在常規(guī)的劑型，并可按照藥劑學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法來制備。所有的方法包括將所述活性試劑加入與載體的結(jié)合步驟，該載體組成一種或多種附加成分。一般而言，通過將所述活性化合物與液體載體、精細粉碎的固體載體和二者同時發(fā)生均一和密切的結(jié)合來制備所述的組合物，并隨后，如果需要，成型該產(chǎn)物。
適合口服給藥的組合物能以離散的單位存在，諸如膠囊、片劑、錠劑，每一種均含有活性化合物的預(yù)定劑量。其它的組合物包括諸如糖漿、酏劑或乳液的水性液體和非水性液體。
適合腸道外給藥的組合物通常包括iASPP C6多肽或核酸的無菌的水性或非水性制劑，其優(yōu)選與受者的血液等張。根據(jù)公知的方法利用適合的分散或濕化劑和懸浮劑來配制該制劑。該無菌的注射制劑也可以是非毒性腸道外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的注射溶液或懸浮液，例如，1，3-丁二醇溶液。在可接受的載體和溶劑中，可以使用水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。此外也可常規(guī)使用無菌不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。對于此目的，可使用任何混合的不揮發(fā)油，包括合成的甘油單或二酯。此外，諸如油酸的脂肪酸也可用于注射制劑。適合口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等等給藥的的載體制劑可參見《雷明頓制藥學(xué)》，Mack Publishing Co.，Easton，PA。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述核酸分子選自抑制性RNA(RNAi)分子或反義核酸分子。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述核酸分子選自參考圖1b所示的核酸序列所設(shè)計的反義分子或抑制性RNA分子。優(yōu)選的所述反義或抑制性RNA分子被設(shè)計成針對所述核酸序列的部分，其編碼由圖1a所示的氨基酸殘基+1至+483所限定的氨基酸序列。
本文所使用的術(shù)語“反義分子”或“反義”描述了寡核苷酸，其是在生理學(xué)條件下與包含特定基因的DNA或該基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本雜交的寡核糖核酸、寡脫氧核糖核酸、修飾寡核糖核酸或修飾寡脫氧核糖核酸，并因此抑制了該基因的轉(zhuǎn)錄和/或所述mRNA的翻譯。設(shè)計的反義分子依靠與靶基因或轉(zhuǎn)錄本雜交來干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認識到，所述反義寡核苷酸的精確長度和與其靶標的互補程度依賴于所選擇的具體靶標，其包括所述靶標的序列和含有該序列的具體堿基。優(yōu)選反義寡核苷酸被構(gòu)建或排列，以便在生理學(xué)條件下與所述靶標選擇性的結(jié)合，即，在生理學(xué)條件下，在靶細胞中，基本上更多地與所述靶序列雜交，而不是任何其它序列。基于本文所提供的iASPP6C核酸序列、或等位的或同源的基因組和/或cDNA序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地選擇并合成本發(fā)明所使用的任何適合的反義分子。例如，可以制備“基因漫步”，其包含跨越iASPP6C核酸長度的15-30核苷酸的一系列寡核苷酸，隨后檢測對相應(yīng)的iASPP6C表達的抑制。任選地，在寡核苷酸之間可以保留5-10核苷酸的間隔以降低合成和檢測寡核苷酸的數(shù)量。
盡管長度為7個堿基的修飾寡核苷酸已經(jīng)被成功地用作反義寡核苷酸(Wagner等人，Nature Biotechnol.14840-844，1996)，但為了充分地選擇和有效抑制，這樣的反義寡核苷酸應(yīng)該含有至少10個、并優(yōu)選至少15個與所述靶標互補的連續(xù)堿基。更優(yōu)選地，所述反義寡核苷酸含有20-30個堿基的互補序列。盡管可以選擇對基因和mRNA轉(zhuǎn)錄本的任何區(qū)域是反義的寡核苷酸，但是在優(yōu)選的實施方案中，所述反義寡核苷酸對應(yīng)于諸如翻譯起始、轉(zhuǎn)錄起始或啟動子位點的N末端或5’上游位點。另外，3’-非翻譯區(qū)域可以被作為靶標。靶向mRNA拼接位點也已經(jīng)在本領(lǐng)域中使用，但如果存在替代的拼接就不是優(yōu)選的。另外，所述反義被優(yōu)選靶向不出現(xiàn)mRNA二級結(jié)構(gòu)的位點(參見，例如Sainio等人，Cell Mol.Neurobiol.14(5)439-457，1994)內(nèi)并處在不希望蛋白質(zhì)結(jié)合的位點。最后，盡管本文公開了iASPP 6C cDNA序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地得出相應(yīng)于所述cDNA的所述基因組DNA。因此，本發(fā)明還提供了與iASPP6C基因組DNA互補的反義寡核苷酸。同樣地，不需要過多的實驗，對等位的或同源的cDNA和基因組DNA反義也是可以的。
在一組實施方式中，本發(fā)明的所述反義寡核苷酸可以由“天然的”脫氧核糖核酸、核糖核酸或其任意組合組成。也就是說，像在天然系統(tǒng)中一樣，一個天然的核苷酸的5’端與另一個天然的核苷酸的3’端可以通過磷酸二酯核苷酸間的鍵合共價地連接。可以通過領(lǐng)域內(nèi)已知的可以手工實施的方法或通過自動合成儀制備這些寡核苷酸。也可以通過載體重組產(chǎn)生這些寡核苷酸。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了包含可操作地連接到啟動子的核酸序列的轉(zhuǎn)錄盒，該啟動子轉(zhuǎn)錄所述核酸分子以產(chǎn)生反義核酸分子，所述序列選自i)圖1b所代表的核酸分子序列或其部分；ii)，與存在于圖1b所述的有義序列雜交并編碼本發(fā)明多肽的核酸序列。
最近的特異消融基因功能的技術(shù)是通過將雙鏈的RNA，也稱為抑制性RNA(RNAi)，介入細胞產(chǎn)生與該RNAi分子序列互補的mRNA的破壞。該RNAi分子包括RNA的兩條互補鏈(有義鏈和反義鏈)相互退火來形成雙鏈RNA分子。該RNAi分子通常來自欲消融的基因外顯子或編碼序列。
最近的研究表明，來自編碼序列的長100-1000bp的RNAi分子，是有效的基因表達抑制劑。令人驚奇的是，僅需要一些RNAi來阻斷基因的表達，提示其機制為催化作用。作用的位點位于核內(nèi)，因為很少有在細胞漿中檢測到任何RNAi，如果檢測到其提示RNAi在mRNA合成和加工階段來發(fā)揮作用。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，提供了含有核酸分子或其部分的轉(zhuǎn)錄盒，其選自i)在圖1b中由所述核酸序列代表的核酸分子；ii)與上述(i)中序列雜交并編碼本發(fā)明多肽的核酸分子；或者iii)因上述(i)和(ii)定義的序列的遺傳密碼而作為簡并密碼子的核酸分子，其中適應(yīng)所述盒從而有義和反義核酸分子均可從所述盒轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述盒提供有適合轉(zhuǎn)錄所述核酸分子的有義和反義鏈的至少兩個啟動子。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，所述盒包括核酸分子，其中所述分子包括連接于第二部分的第一部分，其中所述第一和第二部分的至少一部分的它們序列是互補的，以及其中所述核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA分子，其通過所述第一和第二部分的互補堿基配對形成雙鏈區(qū)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述第一和第二部分通過至少一個核苷酸堿基連接。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述第一和第二部分通過2，3，4，5，6，7，8，9或至少10個核苷酸堿基連接。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，所述RNAi分子長度為100bp-1000bp。更優(yōu)選地，所述RNAi分子長度選自100bp；200bp；300bp；400bp；500bp；600bp；700bp；800bp；900bp或1000bp。更加優(yōu)選地，所述RNAi分子長度為至少1000bp。
在本發(fā)明可選擇的優(yōu)選實施方式中，所述RNAi分子長度為15bp-25bp，優(yōu)選地，所述分子為21bp。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述盒是載體的一部分。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供鑒別試劑的篩選方法，該試劑調(diào)節(jié)p53結(jié)合蛋白與p53多肽的相互作用，其中，所述方法包括如下步驟iii)形成制劑，其包括本發(fā)明的多肽和p53多肽、或其序列變體，以及至少一種待檢測的試劑；iv)測定與所述多肽和p53多肽結(jié)合相關(guān)的所述試劑的活性。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供鑒別試劑的篩選方法，該試劑調(diào)節(jié)Bcl-2結(jié)合多肽與Bcl-2多肽的相互作用，其中，所述方法包括如下步驟i)形成制劑，其包括圖2a所示氨基酸序列代表的多肽或多肽變體、Bcl-2多肽或其變體、以及至少一種待檢測的試劑，所述多肽變體被至少一個氨基酸殘基的添加、缺失或替代來修飾；及ii)測定與所述多肽結(jié)合所述Bcl-2多肽相關(guān)的所述試劑的活性。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供鑒別試劑的篩選方法，該試劑調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽的泛素化，所述方法包括如下步驟i)形成制劑，其包括本發(fā)明的多肽，泛素多肽或其變體，具有與泛素軛合多肽有關(guān)的特異活性的多肽以及至少一種待檢測的試劑；ii)測定與泛素軛合到所述多肽相關(guān)的所述試劑的活性。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述試劑是肽或多肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述肽的長度是至少6個氨基酸殘基。所述肽/多肽優(yōu)選的長度選自至少7個氨基酸殘基；8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20個氨基酸殘基長度。所述肽/多肽可選擇的長度是至少20個氨基酸殘基；30，40，50，60，70，80，90或100氨基酸殘基長度。
對本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員顯而易見的是，對肽試劑的氨基酸序列的修飾可增強該肽對其靶序列的結(jié)合和/或穩(wěn)定性。此外，所述肽的修飾還可增加該肽的體內(nèi)穩(wěn)定性從而減少抑制iASPP的p53結(jié)合所需的肽的有效量。這將有利于減少可能在體內(nèi)發(fā)生的不必要的副作用。修飾包括，例如但不限于乙?；蝓０坊？蛇x擇地或優(yōu)選地，所述修飾包括在重組或合成形式肽的制備中修飾的氨基酸的使用。對本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員顯而易見的是，修飾的氨基酸包括，例如但不限于4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、N6-乙酰賴氨酸、N6-甲基賴氨酸、N6，N6-二甲基賴氨酸、N6，N6，N6-三甲基賴氨酸、環(huán)己基丙氨酸，D-氨基酸、鳥氨酸。其它的修飾包括氨基酸中C2、C3或C4烷基R基團任意被1，2或3個取代基取代，該取代基選自鹵素(例如F，Br，I)、羥基或C1-C4烷氧基。修飾還可包括，例如但不限于乙?；王０坊?。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述肽序列被乙?；?yōu)選地所述乙酰化是針對所述肽的氨基末端。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，所述肽序列被酰胺化。優(yōu)選地所述酰胺化是針對所述肽的羧基末端。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員顯而易見的是，可通過環(huán)化作用來修飾肽。環(huán)化是本領(lǐng)域公知的(參見Scott等人，Chem Biol(2001)，8801-815；Gellerman等人，J.Peptide Res(2001)，57277-291；Dutta等人，J.PeptideRes(2000)，8398-412；Ngoka與Gross J Amer Soc Mass Spec(1999)，10360-363)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方法中，所述拮抗劑是抗體或抗體結(jié)合部分。優(yōu)選所述抗體是單克隆抗體或其結(jié)合部分。
在本發(fā)明可選擇的優(yōu)選方法中，所述試劑為適體(aptamer)。
核酸具有線性序列結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)，該三維結(jié)構(gòu)部分由其線形序列確定并還由這些分子所處的環(huán)境來決定。常用的治療分子為小分子，例如，肽、多肽或抗體，其結(jié)合靶分子來產(chǎn)生激動或拮抗作用。越來越顯而易見的是，核酸分子還具有提供具有所需的結(jié)合特性的試劑的潛力，該結(jié)合特性可具有治療用途。這些核酸分子通常稱為適體(aptamer)。適體是小的通常是穩(wěn)定的核酸分子，其包括對靶分子的結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域。美國專利申請US5,270,163描述了鑒定適體的篩選方法，本文將其引入作為參考。適體通常是寡核苷酸，其可以是單鏈的寡脫氧核酸，寡核糖核酸，或者修飾的寡脫氧核酸或寡核糖核酸。
術(shù)語“修飾”包括具有共價修飾的堿基和/或糖的核苷酸。例如，修飾的核苷酸包括具有糖的核苷酸，該糖共價連接至低分子量的有機基團而不是3′位的羥基以及5′位的磷酸基。因此修飾的核苷酸可包括2’取代的糖，例如，2’-O-甲基-；2-O-烷基-；2-O-烯丙基-；2’-S-烷基-；2’-S-烯丙基-；2’-氟-；2’-鹵素或2；疊氮基-核糖，碳環(huán)型的糖類似物a-端基異構(gòu)糖；諸如樹膠醛糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖的差向異構(gòu)糖。
修飾的核酸是本領(lǐng)域所公知的并包括例如但不限于，烷基化嘌呤和/或嘧啶；乙酰化嘌呤和/或嘧啶或其它雜環(huán)。嘧啶和嘌呤的種類也是本領(lǐng)域所公知的并包括，假異胞嘧啶；N4，N4-ethanocytosine(乙醇基胞嘧啶)；8-羥基-N6-甲基腺嘌呤；4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶；5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶；二氫尿嘧啶；肌苷；N6-異戊基-腺嘌呤；1-甲基腺嘌呤；1-甲基假尿嘧啶；1-甲基鳥嘌呤；2，2-二甲基鳥嘌呤；2-甲基腺嘌呤；2-甲基鳥嘌呤；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；7-甲基鳥嘌呤；5-甲基氨基甲基尿嘧啶；5-甲氧氨基甲基-2-硫尿嘧啶；β-D-甘露糖基queosine；5-甲氧羰基甲基尿嘧啶；5-甲氧尿嘧啶；2甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤；尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯；假尿嘧啶；2-硫胞嘧啶；5-甲基-2硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；N-尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯；尿嘧啶5-羥乙酸；queosine；2-硫胞嘧啶；5-丙基尿嘧啶；5-丙基胞嘧啶；5-乙基尿嘧啶；5-乙基胞嘧啶；5-丁基尿嘧啶；5-戊基尿嘧啶；5-戊基胞嘧啶；以及2，6，-二氨基嘌呤；甲基假尿嘧啶；1-甲基鳥嘌呤；1-甲基胞嘧啶。
通過常規(guī)的磷酸二酯連接的核苷酸來合成本發(fā)明的適體，并利用標準的本領(lǐng)域公知的固相和液相合成技術(shù)來合成。核酸間的連接可利用可選擇的連接分子。例如，以下式的連接基團P(O)S，(硫酯，thioate)；P(S)S，(二硫酯)；P(O)NR’2；P(O)R’；P(O)OR6；CO；或CONR’2，其中R為H(或鹽)或烷基(1-12C)，而且R6為烷基(1-9C)通過-O-或-S-加入到相鄰的核苷酸。通過本文所公開的分析法容易檢測到適體對靶多肽的結(jié)合。
現(xiàn)在參考以下附圖僅利用實施例來描述本發(fā)明的實施方式。
圖1a為iASPP C6蛋白的氨基酸序列，下劃線的氨基酸序列與iASPP相同；圖1b為iASPP6C的核酸序列；圖2a為iASPP的氨基酸序列；圖2b為iASPP的核酸序列；
圖3為全長iASPP6C和iASPP的序列比對；圖4A所示為在不同細胞系表達的iASPP的表達。在約100kDa檢測全長iASPP6C。用抗體LX049.3探查的樣品是在體外翻譯的2.1kb iASPP；RKO(結(jié)腸癌細胞系)；HeLa；293(腎臟)；MCF7(乳腺)；SaOS2(骨肉瘤)；HBL100(乳腺)；H1299(肺)；U937(肺)；U20S(骨肉瘤)細胞；圖4B、4C和4D顯示通過抗iASPP和iASPP6C中序列的不同抗體可以檢測iASPP6C。4B所示為用于產(chǎn)生抗體LX049.3、SA4.1和pAb18抗體的抗原相對位置圖；4C示出了用未標記氨基酸在體外翻譯iASPP6C和iASPP cDNA。同時進行包含空載體的對照反應(yīng)。用LX049.3探查印記中的兩個iASPP蛋白之間所觀察到的條帶是非特異的。4D示出了用LX049.3在細胞系中檢測的iASPP6C和iASPP的表達水平。iASPP6C和iASPP cDNA在體外的翻譯產(chǎn)物(IVT)作為陽性對照物被加載。分子量標記的位置顯示在右邊。抗PCNA抗體PC-10用作細胞裂解的加載對照物；圖5所示為用兩個不同的iASPP抗體的免疫沉淀反應(yīng)/western(蛋白)印記LX049.3是小鼠單克隆抗體而pAb18是兔抗體(參見圖3，在肽比對中給出了抗原決定簇)；圖6a和6b顯示iASPP C6是泛素化的。這個過程導(dǎo)致產(chǎn)生了83kDa片段，其在MG132(泛素-蛋白體抑制劑)存在下被阻斷。泛素化也依賴于細胞密度產(chǎn)生。按照所需要的細胞密度分開細胞并在第二天(16-24小時以后)加入MG132。
圖7顯示p53優(yōu)先與全長iASPP6C結(jié)合，而Bcl-2優(yōu)先結(jié)合iASPP；圖8顯示細胞中全長iASPP6C的活性，以及iASPP和p53參與細胞凋亡基因而不是細胞周期調(diào)節(jié)基因的活化，且其也與p63和p73互相作用；圖9顯示全長iASPP6C而不是iASPP優(yōu)先在細胞內(nèi)表達，但以不同的表達水平來表達。
圖10顯示iASPP6C的N-末端導(dǎo)致它定位到細胞漿(a)LX049.3用于在Saos-2和H1299細胞內(nèi)檢測iASPP6C。在Saos-2細胞中分析轉(zhuǎn)染(左)的或者內(nèi)源性的iASPP6C(中心)，以及H1299細胞(右)中的內(nèi)源iASPP6C。(b)編碼圖中所示iASPP區(qū)域的V5表位標簽的構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染入Saos-2細胞，并利用抗-V5抗體的免疫熒光分析確定它們的亞細胞定位；以及圖11顯示抑制p53所需的iASPP6C的C末端。(a)用p53和示出的iASPP介導(dǎo)體轉(zhuǎn)染Saos-2細胞，并通過FACS檢測細胞凋亡。右手圖是顯示所述轉(zhuǎn)染蛋白的相對表達水平的免疫印跡。(b)用1μg含PIG-3啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒，以及50ng p53、0.25ng iASPP6C質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Saos-2細胞。該圖顯示了相對的轉(zhuǎn)錄活性的變化。
材料與方法細胞培養(yǎng)和試劑細胞在含10％胎牛血清的Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)液(Invitrogen)的培養(yǎng)中生長。用于這個研究中的細胞為Tera(睪丸腫瘤細胞系)、RKO(結(jié)腸癌)、Saos-2(骨肉瘤)、H1299(肺癌)、293(胎腎)、SK-MEL-37(黑素瘤)、MCF7(乳腺上皮)和U2OS(骨肉瘤)?？?V5抗體從Invitrogen購買。N-20 CD20Leu FITC-軛合單克隆抗體從Becton Dickinson得到。采用磷酸鈣沉淀進行全部的轉(zhuǎn)染。
質(zhì)粒含有編碼iASPP6C(I.M.A.G.E.克隆4994121)的cDNA的EST從MRC Geneservice(英國劍橋)得到。cDNA被亞克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)。pcDNA3.1 iASPP、pcDNA3.1ASPP2、pcDNA3.1 Ce-iASPP和pcDNA3 p53已經(jīng)在前面描述過(Bergamaschi等人，2003；Samuels-Lev等人，2001)。用于圖10中的iASPP6C平截體通過PCR-定向克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO而產(chǎn)生。具有5’多接頭插入的兩個V5序列的修飾pcDNA3載體用于產(chǎn)生N末端V5標記的iASPP6C。
抗iASPP抗體的產(chǎn)生抗iASPP6C抗體pAb18(兔多克隆)和SA4.1(鼠單克隆)是產(chǎn)生用來抗肽RLQPALPPEAQSVPELEE(iASPP6C的氨基酸492至509)的。抗iASPP6C鼠單克隆抗體LX049.3是抗含有iASPP6C的氨基酸459至639的C末端His-標簽融合蛋白。通過PCR擴增對應(yīng)的cDNA并亞克隆至pCRT7/CTTOPO(Invitrogen)。重組iASPP6C片段在BL21 Star埃布氏菌(E.coli)中通過用1mMIPTG孵育4小時產(chǎn)生，接著在變性條件下純化。
電泳和免疫印跡法將細胞用PBS沖洗兩次，然后倒入1ml PBS并在400g條件下沉淀。通過室溫下，在8M脲、1M硫脲、0.5％CHAPS、50mM DTT和24mM精胺中孵育30分鐘裂解細胞，接著在16℃、20000g離心。通過如上述(Yap等人，2000)的SDS-PAGE和免疫印跡法，將30μg的蛋白質(zhì)用于分析。
免疫沉淀反應(yīng)通過在NP40裂解緩沖液(50mM Tris pH8.0、150ml NaCl、1mMEDTA，1％NP40和蛋白酶抑制劑(完全的蛋白酶抑制劑雞尾酒，Roche))中在冰上孵育45分鐘裂解細胞，接著在4℃20000g離心分離20分鐘。通過與蛋白質(zhì)G瓊脂糖珠(Amersham Biosciences)在4℃旋轉(zhuǎn)1h，預(yù)清洗0.5-2mg的裂解產(chǎn)物。該珠的去除后，將該裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新的試管并在4℃與阻斷蛋白質(zhì)G瓊脂糖珠，以及大約1μg特異性抗體或作為對照的非特異性鼠或兔的IgG(Sigma)旋轉(zhuǎn)過夜。接著用冰冷的NP40細胞裂解緩沖液沖洗該珠三次，采用SDS-PAGE和免疫印跡法分析所得到的復(fù)合物。
iASPP6C siRNA的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染如上文所述(Brummelkamp等人，2002)，將含有存在于iASPP6C和iASPP cDNA中的19個堿基序列的寡核苷酸連接到pSuper表達質(zhì)粒。通過測序證實該質(zhì)粒。利用上述所示的cDNA序列，用于產(chǎn)生siRNA的寡核苷酸的完整序列如下
有義，5’gatccccTGTCAACTCCCCCGACAGCttcaagagaGCTGTCGGGGGAGTTGACAtttttggaaa3’；反義，5’agcttttccaaaaaTGTCAACTCCCCCGACAGCtctcttgaaGCTGTCGGGGGAGTTGACAggg3’。dish對于轉(zhuǎn)染，將1×106H1299細胞接種在10cm皿上。用3μg pMACSH-2KK以及pSuper或pSuper-si-RNA iASPP(10μg)轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染后48小時，根據(jù)制造者的說明書，用MACS系統(tǒng)(Miltenyi Biotec)分離表達pMACS H-2KK質(zhì)粒的細胞。這產(chǎn)生了兩個細胞種群H-2KK表達(已轉(zhuǎn)染的)細胞和非表達(非轉(zhuǎn)染的細胞)。兩個細胞種群都用RIPA緩沖液(150mM NaCl、1mMEDTA、50mM Tris pH8、0.5％脫氧膽酸、1％NP40、0.1％ SDS)在冰上裂解30分鐘，接著在4℃20000g離心分離30分鐘。
在體外翻譯并在體外免疫沉淀反應(yīng)采用TNT T7快速轉(zhuǎn)錄/翻譯聯(lián)合系統(tǒng)(TNT T7 Quick coupledTranscription/Translation System，Promega)用35S-蛋氨酸在體外翻譯p53和iASPP6C。含有每個蛋白的網(wǎng)狀細胞裂解產(chǎn)物按說明結(jié)合并在30℃一起孵育1h。將固定在蛋白質(zhì)G瓊脂糖珠上的LX049.3抗體加到結(jié)合反應(yīng)并在4℃旋轉(zhuǎn)16h。然后用PBS沖洗該珠。在SDS樣品緩沖液中釋放結(jié)合蛋白并用10％ SDS-PAGE分析。結(jié)果通過放射自顯影顯示。
轉(zhuǎn)錄活化根據(jù)前面的描述(Samuels-Lev等人，2001)進行轉(zhuǎn)錄分析。
流式細胞儀在轉(zhuǎn)染之前，將流式細胞儀的1×106Saos-2細胞接種在10cm皿上24-48小時。用2μg pCMV CD20作為轉(zhuǎn)染標記轉(zhuǎn)染所有細胞。用以下所述適當(dāng)量轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3 p53(1μg)、pcDNA3.1 Ce-iASPP(7.5μg)、pcDNA3.1 iASPP(7.5μg)、pcDNA3.1 iASPP6C(1μg)、pcDNA3.1ASPP2(10μg)。用于圖11的是2μg iASPP6C平截體?？盏膒cDNA3載體被用于平衡所有樣品中的DNA總量。轉(zhuǎn)染36h后，獲得附著和漂浮的細胞，并以前述方法(Hsieh等人，1997)分析。
免疫熒光分析將Saos-2細胞以50％的密度接種在24孔培養(yǎng)板的蓋片上，并用編碼iASPP6C平截體的0.5-3μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h后，用200μl含4％的多聚甲醛的PBS固定該細胞12分鐘，然后用含0.1％ Triton-X100的PBS通透4分鐘。采用抗-V5抗體(在0.2％魚皮凝膠中1∶100稀釋)孵育40分鐘，接著用TRITC或FITC-軛合第二抗體20分鐘，來檢測iASPP6C構(gòu)建體的表達。
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權(quán)利要求
1.分離的多肽或多肽變體，其中所述分離的多肽由圖1a所示的氨基酸序列代表，所述多肽變體通過至少一個氨基酸殘基的添加、缺失或替代來修飾，其特征在于，所述多肽具有以下特性i)當(dāng)與圖2a所示的氨基酸序列代表的多肽或其變體比較時，優(yōu)先結(jié)合腫瘤抑制多肽p53從而抑制p53的促細胞凋亡活性的多肽；ii)包含至少一個被泛素化的氨基酸殘基的多肽；以及iii)包含氨基末端多肽結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述結(jié)構(gòu)域由圖1a所示氨基酸序列的氨基酸1至483代表。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中當(dāng)與圖2a所示的氨基酸序列代表的多肽比較時，所述多肽優(yōu)先結(jié)合p53。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽通過至少一個氨基酸殘基的添加、缺失或替代來修飾，其中所述修飾位于圖1a表示的氨基酸序列的氨基酸殘基1至483。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽包含圖1a所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽由圖1a所示的氨基酸序列組成。
6.分離核酸分子，其中所述核酸分子編碼權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離核酸分子，其中所述核酸分子由圖1b所示的核酸序列代表，或者是在嚴格的雜交條件下與圖1b所示序列雜交并編碼權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述多肽的核酸分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的核酸分子，其中所述核酸分子由圖1b所示的核酸序列組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述分子是cDNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述分子是基因組DNA。
11.載體，包含權(quán)利要求6-10任一權(quán)利要求所述的核酸分子。
12.權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述多肽的制備方法，包括以下步驟i)提供用權(quán)利要求6-11任一權(quán)利要求所述的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細胞；ii)在有助于制備所述多肽的條件下培養(yǎng)所述細胞；以及iii)從所述細胞或其生長環(huán)境中純化所述多肽。
13.抗體或其結(jié)合片段，其結(jié)合權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的多肽，其特征在于，所述抗體結(jié)合圖1a所示氨基酸序列的氨基酸殘基1至483的所述多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體，其中所述片段是Fab片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體片段，其中所述抗體選自F(ab′)2、Fab、Fv和Fd片段；以及含有CDR3區(qū)域的抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15任一權(quán)利要求所述的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體是人源化抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-15任一權(quán)利要求所述的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體是嵌合抗體。
18.權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的多肽作為藥物的用途。
19.權(quán)利要求6-11任一權(quán)利要求所述的核酸分子或載體作為藥物的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中所述核酸分子是抑制性RNA分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中所述核酸分子是反義核酸分子。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的用途，其中所述核酸分子選自參考圖3所示核酸序列設(shè)計的反義分子或抑制性RNA分子，其中所述反義或抑制性RNA分子被設(shè)計成針對所述核酸序列的部分，其編碼由圖1a所示定義的氨基酸殘基1至483。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中以轉(zhuǎn)錄盒提供所述核酸分子，所述轉(zhuǎn)錄盒包含操作地連接到啟動子的核酸序列，該啟動子轉(zhuǎn)錄所述核酸分子以產(chǎn)生反義核酸分子，所述序列選自i)圖1b代表的核酸序列，或其部分；ii)與圖1b所示的有義序列雜交并編碼權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述多肽的核酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中以轉(zhuǎn)錄盒提供所述核酸分子，所述轉(zhuǎn)錄盒包含選自以下的核酸分子，或其部分i)圖1b中核酸序列代表的核酸分子；ii)與上述(i)中序列雜交并編碼權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述多肽的核酸分子；或者iii)核酸分子，其是根據(jù)上述(i)和(ii)定義的序列的遺傳密碼的簡并密碼，其中適應(yīng)所述盒從而從所述盒轉(zhuǎn)錄有義和反義核酸分子。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，其中所述盒提供有適合轉(zhuǎn)錄所述核酸分子的有義和反義鏈的至少兩個啟動子。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，其中所述盒含有核酸分子，其中所述分子包括連接于第二部分的第一部分，其中所述第一和第二部分的至少一部分它們的序列是互補的，以及其中所述所述核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA分子，其通過所述第一和第二部分的互補堿基配對形成雙鏈區(qū)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的用途，其中所述第一和第二部分通過至少一個核苷酸堿基連接。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-27任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述盒是載體的一部分。
29.鑒別試劑的篩選方法，所述試劑調(diào)節(jié)p53結(jié)合蛋白與p53多肽的相互作用，其中所述方法包括如下步驟i)形成制劑，其包括權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求的多肽和p53多肽、或它們的序列變體，以及至少一種待檢測的試劑；ii)測定與所述多肽結(jié)合所述p53多肽相關(guān)的所述試劑的活性。
30.鑒別試劑的篩選方法，所述試劑調(diào)節(jié)Bcl-2結(jié)合多肽與Bcl-2多肽的相互作用，其中所述方法包括如下步驟i)形成制劑，其包括圖2a所示的氨基酸序列代表的多肽或多肽變體，Bcl-2多肽或其變體，以及至少一種待檢測的試劑，所述多肽變體被至少一個氨基酸殘基的添加、缺失或替代來修飾；及ii)測定與所述多肽結(jié)合所述Bcl-2多肽相關(guān)的所述試劑的活性。
31.鑒別試劑的篩選方法，所述試劑調(diào)節(jié)多肽的泛素化，所述方法包括如下步驟i)形成制劑，其包含權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的多肽，泛素多肽或其變體，具有與泛素軛合多肽有關(guān)的特異活性的多肽以及至少一種待檢測的試劑；ii)測定與泛素軛合到所述多肽相關(guān)的所述試劑的活性。
32.根據(jù)權(quán)利要求29-31任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述試劑是肽或多肽。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述肽/多肽是抗體或抗體結(jié)合片段。
34.根據(jù)權(quán)利要求29-31任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述試劑是適體。
全文摘要
本發(fā)明描述了結(jié)合并調(diào)節(jié)諸如p53的腫瘤抑制多肽活性的多肽；編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子以及對其靶多肽調(diào)節(jié)所述多肽的結(jié)合活性的篩選方法。
文檔編號C07K14/47GK1890263SQ200480036472
公開日2007年1月3日 申請日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月10日
發(fā)明者盧欣, 伊麗莎白·希利 申請人:路德維希癌癥研究院