專利名稱：波長轉(zhuǎn)換雙分子信標的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物制品的研制及腫瘤的早期診斷試劑，特別涉及一種波長轉(zhuǎn)換雙分子信標。
背景技術(shù)：
根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(FRET)設(shè)計的分子信標(Molecule Beacon，MBs)是一種敏感性很強、特異性很高、操作極為簡單方便的新的分子生物學(xué)方法(Mitchell，P.Turning the spotlight on cellular imaging.Nat.Biotechmol.，2001，19，1013-1017.)。近年來分子信標研究得到了迅速發(fā)展，并已廣泛應(yīng)用于實時監(jiān)測聚合酶鏈反應(yīng)、基因突變的快速分析、DNA/RNA的檢測、DNA/RNA雜交的動力學(xué)研究，以及DNA/蛋白相互作用研究等，其應(yīng)用領(lǐng)域仍在不斷拓展(Tyagi S，Bratu DP，Kramer FR.Multicolormolecular beacons for allele discrimination.Nat Biotechnol 1998，1649-53.)。該方法通過設(shè)計一段與特定核酸互補的寡聚核苷酸探針，使其空間結(jié)構(gòu)呈柄環(huán)狀。其中環(huán)序列是與靶核酸互補的探針，柄的一端連接一個熒光分子，另一端連接熒光淬滅分子。當(dāng)靶序列不存在或不能完全互補時，分子信標仍呈柄環(huán)結(jié)構(gòu)，柄部的熒光分子與淬滅分子非常接近(7～10nm)，熒光分子發(fā)出的熒光被淬滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，此時檢測不到熒光信號；當(dāng)有靶序列存在時，分子信標的環(huán)序列與靶序列特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的雙鏈體，熒光分子因此與淬滅分子分開，熒光分子發(fā)出的熒光不能被淬滅分子吸收，從而可以檢測到熒光。
為保證分子信標的高敏感性，可研究設(shè)計使用雙分子信標來降低假陽性率。其中一個分子信標的熒光分子稱供體熒光(信標供體)，另一個分子信標的熒光分子稱受體熒光(信標受體)。設(shè)計這一對分子信標與靶分子mRNA序列的相鄰區(qū)互補，使兩個分子信標的熒光分子位于熒光共振能量傳遞作用區(qū)(4～6nm)。當(dāng)刺激供體熒光時，兩個熒光基團間發(fā)生熒光共振能量傳遞作用，這時可以檢測到受體熒光的特異性熒光光譜。由于雙分子信標檢測陽性必須是兩個分子信標都與靶分子完全雜和互補，受體熒光發(fā)射的熒光才能被檢測到，這就降低了因為單分子信標進入活細胞被核酸酶降解或被與核酸結(jié)合的蛋白打開環(huán)柄結(jié)構(gòu)時出現(xiàn)假陽性的發(fā)生率(Tyagi.S，Salvatore A.E.Marras and Kramer FR.Wavelength-shifting molecularbeacons.Nat Biotechnol 2000，181191-1196.)。為了保證兩個分子信標的受體和供體熒光分子間的距離固定，分子信標連接熒光分子的柄結(jié)構(gòu)也必須參與同靶分子雜和，從而保證兩個分子信標在完全互補雜和后它們之間的距離保持恒定。
有研究用波長轉(zhuǎn)換分子信標來解決同時檢測多個分子信標時需要多個激發(fā)光源問題(Tyagi.S，Salvatore A.E.Marras，and Kramer FR.Wavelength-shifting molecularbeacons.Nat Biotechnol 2000，181191-1196.)。通過在探針柄結(jié)構(gòu)的一端連接兩個熒光分子——熒光供體分子(綠色)和熒光受體分子(紅色)。當(dāng)反應(yīng)體系中無相應(yīng)互補靶分子時，由于熒光分子與淬滅劑互相接近，給予單色光源激發(fā)后，熒光供體分子產(chǎn)生的熒光被淬滅劑淬滅。當(dāng)反應(yīng)體系中存在相應(yīng)的互補靶分子，探針與靶分子雜交，熒光供體分子與淬滅劑分開。在單色光源的激發(fā)下，熒光供體分子吸收能量產(chǎn)生熒光，通過熒光共振能量傳遞作用將能量傳遞給熒光受體分子使之發(fā)出熒光。在檢測中只需改變不同的熒光受體分子，而不需要改變激發(fā)光源就能實現(xiàn)多個分子信標的同時檢測。
臨床中腫瘤的檢測不僅需要較高的靈敏性，還要具有較高的特異性。盡管分子信標具有較高的敏感性，但分子信標進入細胞后有被細胞中的核酸酶降解或環(huán)柄被核酸結(jié)合蛋白打開的可能，因而出現(xiàn)假陽性(Mitchell，P.Turning the spotlight oncellular imaging.Nat.Biotechmol.，2001，19，1013-1017.)。應(yīng)用單個分子信標檢測腫瘤的特異性較低，因此常需兩個分子信標檢測一個靶分子，同時檢測一種腫瘤的兩種靶分子，能夠提高應(yīng)用分子信標檢測腫瘤的特異性。在使用攜帶不同熒光分子的多個分子信標同時進行檢測時，要求有多種不同的激發(fā)光源，使得同時檢測多個靶分子時不能夠做到方便、快捷，而且由于多種激發(fā)光源本身的特性，導(dǎo)致熒光分子的熒光強度不能達到最大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供了一種特異性強、靈敏度高，方便、快捷、實用的波長轉(zhuǎn)換雙分子信標。
為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是包括信標供體和信標受體，兩對分子信標中的信標供體采用相同的熒光分子，兩對分子信標中的信標受體的熒光分子采用德州紅和FITC、熒光黃和EADNS或四甲基羅丹明和cy3，且此信標受體的熒光分子應(yīng)與信標供體的熒光分子不同。
本發(fā)明信標供體的熒光分子為熒光素、香豆素、德州紅、FITC、熒光黃、EADNS、四甲基羅丹明或cy3。
本發(fā)明的波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，首先是同時使用兩組分子信標同時檢測一種腫瘤的兩個靶分子，既具備了分子信標的高敏感性，還保持了其高特異性。其次，在檢測中只使用一種激光光源，為臨床應(yīng)用分子信標試劑檢測腫瘤提供了可能性。


圖1是本發(fā)明波長轉(zhuǎn)換分子信標原理圖；圖2是本發(fā)明波長轉(zhuǎn)換雙分子信標檢測同一細胞中的不同靶分子的示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
參見圖1，當(dāng)分子信標未與靶分子3結(jié)合時，熒光照射所激發(fā)的綠色熒光會被淬滅劑淬滅，檢測不到熒光。當(dāng)分子信標與能夠完全互補的靶分子3相遇時，由于寡核酐酸鏈具有相互反應(yīng)的特性而完全結(jié)合，在分子信標與靶分子結(jié)合后，熒光4照射信標供體1時，信標供體1產(chǎn)生的綠色熒光通過FRET作用于信標受體2，就可以觀察到信標受體2的強烈的紅色熒光。
實施例1波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，在檢測一個細胞的兩個靶分子3時，兩對分子信標中的信標供體1均采用熒光素，兩對分子信標中的信標受體2采用德州紅和FITC。
實施例2波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，在檢測一個細胞的兩個靶分子3時，兩對分子信標中的信標供體1均采用香豆素，兩對分子信標中的信標受體2采用熒光黃和EADNS。
實施例3波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，在檢測一個細胞的兩個靶分子3時，兩對分子信標中的信標供體1均采用德州紅，兩對分子信標中的信標受體2采用熒光黃和EADNS。
實施例4波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，在檢測一個細胞的兩個靶分子3時，兩對分子信標中的信標供體1均采用熒光黃，兩對分子信標中的信標受體2采用四甲基羅丹明和cy3。
實施例5波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，在檢測一個細胞的兩個靶分子3時，兩對分子信標中的信標供體1均采用四甲基羅丹明，兩對分子信標中的信標受體2采用德州紅和FITC。
實施例6波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，在檢測一個細胞的兩個靶分子3時，兩對分子信標中的信標供體1均采用熒光黃，兩對分子信標中的信標受體2采用德州紅和FITC。
實施例7波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，在檢測一個細胞的兩個靶分子3時，兩對分子信標中的信標供體1均采用熒光素，兩對分子信標中的信標受體2采用德州紅和FITC。
本發(fā)明可以用兩對分子信標共同檢測同一個靶細胞中的兩個靶分子3，采用一種單一激發(fā)光源4刺激信標供體1的供體熒光，根據(jù)激發(fā)出的不同信標受體2的熒光而確定活細胞中存在何種靶分子3，這種設(shè)計不僅由于應(yīng)用雙分子信標檢測同一個靶分子而降低了分子信標檢測可能出現(xiàn)的假陽性，而且只使用一種激發(fā)光源就能達到檢測多個靶分子的目的，真正做到特異性強、靈敏度高，方便、快捷、實用。比如在檢測膀胱腫瘤脫落細胞時，可以設(shè)計檢測癌細胞中的Survivin和H-ras mRNA，每一個mRNA對應(yīng)著1對分子信標，將這2對分子信標中的信標供體都連接上熒光素，信標受體分別連接德州紅和FITC。在將分子信標與待檢脫落細胞作用后，僅僅用488nm一種波長的熒光照射，如果待檢細胞中只存在Survivin mRNA，待檢細胞會發(fā)出紅色熒光；如果待檢細胞中只存在H-ras mRNA，待檢細胞會發(fā)出藍色熒光；如果待檢細胞中上述兩種mRNA都不存在，檢測細胞不發(fā)熒光；如果檢測細胞中上述2種mRNA都存在，則可以同時在一個細胞中檢測到2種熒光(紅和藍色)。這種設(shè)計不僅由于應(yīng)用雙分子信標檢測同一個靶分子而降低了分子信標檢測可能出現(xiàn)的假陽性，而且只使用一種激發(fā)光源就能達到檢測多個靶分子的目的，真正做到特異性強、靈敏度高，方便、快捷、實用。
參見圖2，當(dāng)雙分子信標與靶分子3結(jié)合后，使用同一波長的熒光4照射待檢細胞，當(dāng)待檢細胞內(nèi)存在相應(yīng)的靶分子3時，信標供體1產(chǎn)生的黃色熒光通過FRET作用到相應(yīng)的信標受體2的熒光，就可以同時檢測到信標受體強的綠色和橙色熒光。
權(quán)利要求
1.一種波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，包括信標供體[1]和信標受體[2]，其特征在于兩對分子信標中的信標供體[1]采用相同的熒光分子，兩對分子信標中的信標受體[2]的熒光分子采用德州紅和FITC、熒光黃和EADNS或四甲基羅丹明和cy3，且此信標受體[2]的熒光分子應(yīng)與信標供體[1]的熒光分子不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，其特征在于所說的信標供體[1]的熒光分子為熒光素、香豆素、德州紅、FITC、熒光黃、EADNS、四甲基羅丹明或cy3。
全文摘要
一種波長轉(zhuǎn)換雙分子信標，包括信標供體和信標受體，兩對分子信標中的信標供體采用相同的熒光分子，兩對分子信標中的信標受體的熒光分子采用德州紅和FITC、熒光黃和EADNS或四甲基羅丹明和cy3，且此信標受體的熒光分子應(yīng)與信標供體的熒光分子不同。本發(fā)明首先是同時使用兩組分子信標同時檢測一種腫瘤的兩個靶分子，既具備了分子信標的高敏感性，還保持了其高特異性。其次，在檢測中只使用一種激光光源，為臨床應(yīng)用分子信標試劑檢測腫瘤提供了可能性。
文檔編號G01N21/76GK1696668SQ20051004282
公開日2005年11月16日 申請日期2005年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月16日
發(fā)明者賀大林, 趙軍, 何輝 申請人:西安交通大學(xué)