一種快速檢測肺炎鏈球菌的分子信標探針及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測肺炎鏈球菌的分子信標探針，其特征在于，所述分子信標探針的堿基序列為：BeaconSP：5’-FAM- CTGCA TATTGGAAACGATAGCTAAT TGCAG -DABCAL-3’；所述探針的5’端用FAM標記，3’端用DABCAL標記，熒光基團激發(fā)波長495nm，檢測波長520nm。本發(fā)明的分子信標探針信號強度高，并且特異性高，可以有效、快速地檢測肺炎鏈球菌。本發(fā)明還公開了一種快速檢測肺炎鏈球菌的試劑盒及檢測方法。
【專利說明】一種快速檢測肺炎鏈球菌的分子信標探針及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，特別涉及一種分子信標探針和試劑盒，通過使用熒 光原位雜交的手段，檢測樣品中少量的肺炎鏈球菌。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎鏈球菌是臨床上重要的致病菌，2012年WHO數(shù)據(jù)顯示：全球每年由肺炎鏈球 菌感染引起的死亡病例達210萬，其中100萬以上是5歲以下兒童。據(jù)統(tǒng)計，中國53%的 肺炎鏈球菌可引起兒童的社區(qū)獲得性肺炎，7% -9%的肺炎鏈球菌感染會引起細菌性腦膜 炎。此外，中國是肺炎鏈球菌引起感染病例最多的國家之一，占全球病例的12%，也是5歲 以下兒童肺炎鏈球菌感染引起死亡病例數(shù)最多的國家之一。為有效控制肺炎鏈球菌感染的 傳播，以及降低疾病造成的危害，建立準確，快速的檢測方法是首要任務。
[0003] 目前臨床上檢測肺炎鏈球菌常用的方法有細菌培養(yǎng)法、乳膠凝集法和PCR法。其 中細菌培養(yǎng)法是檢測肺炎鏈球菌的金標準，但（1)抗生素的廣泛使用要以使其分離率大大 降低；（2)非侵襲性疾病不伴有菌血癥，血液培養(yǎng)難有陽性結(jié)果；（3)因為肺炎鏈球菌常在 上呼吸道定植，呼吸道標本的細菌培養(yǎng)結(jié)果會受到干擾。深部呼吸道標本的細菌培養(yǎng)可以 確診，去需要侵入性操作，如肺穿刺等，通常令患兒的家長難以接受。此外該方法需要二氧 化碳培養(yǎng)箱和脫纖維羊血培養(yǎng)基，并且需要16-18小時才能看到檢測結(jié)果，檢測成本高、檢 測周期長。乳膠凝集法原理是利用肺炎鏈球菌莢膜的抗原性，用覆蓋了所有肺炎鏈球菌血 清型的抗體來致敏乳膠顆粒。有肺炎鏈球菌存在時，其莢膜上的抗原和乳膠顆粒上的抗體 可發(fā)生抗原抗體反應，產(chǎn)生肉眼可見的乳膠顆粒凝集現(xiàn)象。此法可以快速鑒定肺炎鏈球菌。 乳膠凝集法的局限性在于如果檢測的細菌數(shù)量較少，會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，需要傳以獲得足 夠量的菌；此外有些C群鏈球菌可能發(fā)生假陽性反應。利用PCR方法可在短時間內(nèi)使特定 的核酸序列拷貝數(shù)幾何級數(shù)增加，有很高的靈敏度和特異性，但缺點是假陽性率高，另一方 面，患者分泌物中有往往含有抑制PCR反應的成分，這又會導致假陰性的出現(xiàn)，這兩方面的 缺點限制了 PCR檢測的臨床應用。目前，已有用熒光原位雜交（FISH)檢測肺炎鏈球菌的報 道，但均采用的是線形探針，該方法的缺點是，雜交完成后，必須用嚴格的洗滌條件來除去 未雜交的探針，而且經(jīng)常會因為探針清洗不完全而造成假陽性。由此可見，肺炎鏈球菌感染 的臨床診斷，急需更簡潔、靈敏的檢測方法。
[0004] 分子信標探針（Molecular beacon probe)，具有靈敏度高、特異性強、只有和革巴序 列雜交上了才會發(fā)出熒光等優(yōu)點，被應用于熒光原位雜交。本發(fā)明通過對大量肺炎鏈球菌 菌株的16S rRNA序列進行比對，挑選肺炎鏈球菌的特異性序列，設計、合成分子信標探針， 建立穩(wěn)定的分子信標原位雜交反應體系，克服了肺炎鏈球菌當前臨床檢測的諸多問題，為 肺炎鏈球菌感染的診斷、預防和控制提供新的檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種分子信標探針，通過熒光原位雜交的手段，建立一種 快速、靈敏、特異性地檢測樣品中肺炎鏈球菌的方法。
[0006] -種快速檢測肺炎鏈球菌的分子信標探針，其特征在于，所述分子信標探針的堿 基序列為：
[0007] Beacon SP :5' -FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3' ；
[0008] 所述探針的5'端用FAM標記，3'端用DABCAL標記，熒光基團激發(fā)波長495nm，檢 測波長520nm。
[0009] 進一步地，所述分子信標濃度為IOng/ μ L。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種快速檢測肺炎鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 括：
[0011] (1)裂解液：1% TritonX-100, 2% NaOH，50mM Tris-HCl (pH 7. 5)
[0012] (2)雜交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺，0· 1% (w/v) 焦磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris-HCl (pH 7· 5)，IOng/ μ L 分子信標，其堿基序列為：
[0013] Beacon SP :5' -FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3' ；
[0014] (3)終止液：1 %稀硫酸
[0015] (4)洗滌液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100, pH 值為 10。
[0016] 本發(fā)明最后提供了一種上述試劑盒快速檢測肺炎鏈球菌的方法，其特征在于包括 如下步驟：
[0017] (1)吸取10 μ L樣品滴在載玻片上，雜交爐加熱至52°C風干；
[0018] (2)在風干的樣品上加入10 μ L裂解液，雜交爐加熱至52°C風干，浸入無水乙醇 中，浸泡5分鐘；
[0019] (3)待乙醇完全揮發(fā)后，加入IOyL含Beacon探針的雜交液，52°C雜交10分鐘；
[0020] (4)終止液侵泡1分鐘，終止反應；
[0021] (5)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20 X物鏡掃視和計數(shù)，用60或100X物 鏡觀察細菌形態(tài)。
[0022] 本發(fā)明的技術(shù)要點或原理：突光原位雜交（Flourescence in situ Hybridization，F(xiàn)ISH)是一種應用標記有熒光物質(zhì)的探針，通過雜交的方法來檢測細胞或 組織內(nèi)特異性DNA或RNA的方法；分子信標探針是一種具有獨特"發(fā)夾"空間結(jié)構(gòu)的探針，在 未與靶序列結(jié)合時，分子信標呈"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，有一環(huán)序列（loop)和一莖序列（stem)，其中 環(huán)序列是與靶位點互補的堿基序列，而莖序列是與靶位點無關(guān)的互補序列；在探針的兩端 分別標記有熒光基團和熒光猝滅基團，當探針處于發(fā)卡結(jié)構(gòu)時，熒光基團和猝滅基團相鄰， 產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移效應，使得熒光基團被猝滅，不能產(chǎn)生熒光信號，而當探針與靶位點結(jié)合 時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，熒光基團和猝滅基團分開，產(chǎn)生熒光信號，通過熒光顯微鏡可以檢測 到該突光信號。
[0023] 本發(fā)明通過比對多個肺炎鏈球菌菌株的16S rRNA序列，篩選出1條肺炎鏈球菌特 有的靶序列。根據(jù)該靶序列，人工合成分子信標探針，其堿基組成為：
[0024] Beacon SP :5' -FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3'
[0025] 探針的5'端用FAM標記，3'端用DABCAL標記，熒光基團激發(fā)波長495nm，檢測波 長 520nm。
[0026] 本發(fā)明通過大量實驗，確定熒光原位雜交的最佳溫度為52°C，甲酰胺最佳濃度為 20%，分子信標最佳濃度為IOng/ μ L。
[0027] 本發(fā)明分子信標探針5'端的熒光標記，包括但不限于FITC、FAM或Cy3等等，3'端 的熒光猝滅標記，包括但不限于DABCYL、BDH或TANRA等，熒光基團或熒光猝滅基團可以根 據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進行添加。
[0028] 本發(fā)明的分子信標探針能夠用于檢測的樣本范圍廣泛，包括但不限于，痰、咽拭 子、胃灌洗液、支氣管灌洗液、活體組織、吸引物、咳出物、體液（脊髓、胸腹水、心包液等）、 血液、膿液、骨髓、尿液、組織切片、食物樣本、來自土壤、空氣和水的樣本，以及它們的培養(yǎng) 物。這些樣本經(jīng)相應處理后，原則上是只要保持細胞形態(tài)完整并且靶核酸未被破壞，均可使 用本發(fā)明的分子信標探針檢測。這些樣本的處理方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的，例如：
[0029] 痰：痰液涂片法；
[0030] 膿液：同痰液涂片法；
[0031] 病灶組織：先用組織研磨器磨碎后再行涂片；
[0032] 尿液：留全量夜尿，靜置4?5h后，棄上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，離 心30min，取沉淀物涂片；
[0033] 胸、腹水標本：參照尿液涂片法；
[0034] 腦脊液：無菌操作收集腦脊液，放置冰箱或室溫24h，待薄膜形成后涂片。也可將 腦脊液離心沉淀，3000rpm，離心30min，棄上清液，取沉淀物涂片。
[0035] 本發(fā)明的分子信標探針信號強度高，并且特異性高，可以有效、快速地檢測肺炎鏈 球菌。

【具體實施方式】
[0036] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但下列實施例僅用于說明 本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造 商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn) 品。
[0037] 實施例1 :分子信標探針及寡聚核苷酸序列的設計與合成
[0038] 選擇出能特異性地檢測肺炎鏈球菌的靶序列，在該段靶序列上設計與其完全互補 的分子信標探針：
[0039] Beacon SP(5, -FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3,）
[0040] 該分子信標是由堿基組成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異序列，其中5,端用FAM標記，3,端用 DABCTL標記，熒光基團要求激發(fā)波長495nm，檢測波長520nm ;人工設計合成分子信標及與 其完全互補的寡核苷酸（5' -AGGTCCGGGTTCTCTCGGAT-3'）。通過對分子信標和寡聚核苷酸 做熱變性曲線實驗，確定熒光原位雜交的最佳反應溫度為52°C，去離子甲酰胺的最佳濃度 為 20%。
[0041] 實施例2 :三種方法檢測痰樣本的對比試驗
[0042] A、培養(yǎng)法檢測
[0043] 將痰液樣本放入CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)4小時，震蕩10-20秒，取40 μ L液體轉(zhuǎn)種 于5%脫纖維羊血培養(yǎng)皿上。為了提高肺炎鏈球菌培養(yǎng)的陽性率，抑制雜菌，可以在培養(yǎng)基 中加入終濃度為5mg/L的慶大霉素，37°C培養(yǎng)過夜。平板上的菌落應該有草綠色的溶血環(huán)， 邊緣整齊，呈臍窩狀。
[0044] B、PCR 法檢測
[0045] 用細菌基因組DNA提取試劑盒（HYQ)提取痰液中的細菌DNA，肺炎鏈球菌特異性引 物，熒光定量PCR檢測。以無菌水為陰性對照，CT值比陰性對照小10及以上的視為陽性。
[0046] C、分子信標探針FISH檢測
[0047] 檢測試劑盒包括：
[0048] (1)裂解液：1% TritonX-100, 2% NaOH，50mM Tris-HCl (pH 7. 5)
[0049] (2)雜交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺，0· 1% (w/v) 焦磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris-HCl (pH 7· 5)，IOng/ μ L 分子信標，其堿基序列為：
[0050] Beacon SP :5' -FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3' ；
[0051] (3)終止液：1 稀硫酸
[0052] (4)洗滌液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100, pH 值為 10。
[0053] 檢測方法：
[0054] (I)吸取10 μ L樣品滴在載玻片上，雜交爐加熱至52°C風干；
[0055] (2)在風干的樣品上加入10 μ L裂解液，雜交爐加熱至52°C風干，浸入無水乙醇 中，浸泡5分鐘；
[0056] (3)待乙醇完全揮發(fā)后，加入10μ L含Beacon探針的雜交液，52°C雜交10分鐘；
[0057] (4)終止液侵泡1分鐘,終止反應；
[0058] (5)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20 X物鏡掃視和計數(shù)，用60或100X物 鏡觀察細菌形態(tài)。
[0059] 在暗色背景中，肺炎鏈球菌發(fā)出綠色熒光。
[0060] 結(jié)果判定方法：
[0061] 肺炎鏈球菌陰性:連續(xù)觀察50個不同視野，未發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌。
[0062] 肺炎鏈球菌陽性（報告細菌數(shù)）：1-9條/50視野。
[0063] 肺炎鏈球菌陽性（1+) :10-99條/50視野。
[0064] 肺炎鏈球菌陽性（2+) : 1-9條每視野。
[0065] 肺炎鏈球菌陽性（3+) :10-99條每視野。
[0066] 肺炎鏈球菌陽性（+) :>100條每視野。
[0067] D、三種檢測方法的結(jié)果及分析
[0068] 采用培養(yǎng)法、PCR法、分子信標探針FISH法三種方法對145份病人痰液樣本的進 行檢測（將145份病人痰液樣本的檢測結(jié)果分為8種情形），檢測結(jié)果如表一所示：
[0069] 表一：三種方法檢測的結(jié)果
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測肺炎鏈球菌的分子信標探針，其特征在于，所述分子信標探針的堿基 序列為： Beacon SP :5' -FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3' ； 所述探針的5'端用FAM標記，3'端用DABCAL標記，熒光基團激發(fā)波長495nm，檢測波 長 520nm。
2. 如權(quán)利要求1所述的分子信標探針，其特征在于，所述分子信標濃度為IOng/y L。
3. -種快速檢測肺炎鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (1)裂解液TritonX-100, 2% NaOH，50mM Tris-HCl (pH7. 5) ⑵雜交液：1〇% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺,0.1% (w/v)焦 磷酸鈉，0.2 % (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2 % (w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA, 0.1 % (v/v) TritonX-100, 50mM Tris-HCl (pH7. 5)，IOng/ ii L分子信標探針，所述分子信標探針的堿基 序列為： Beacon SP :5' -FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3' ； (3) 終止液：1 %稀硫酸； (4) 洗滌液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100，pH 值為 10。
4. 一種利用權(quán)利要求3所述試劑盒快速檢測肺炎鏈球菌的方法，其特征在于包括如下 步驟： (1) 吸取10 U L樣品滴在載玻片上，自然風干； (2) 在風干的樣品上加入10 y L裂解液，待其自然風干后，浸入無水乙醇中，浸泡5分 鐘； (3) 在樣品上加入10 y L雜交液，置于雜交爐中52°C雜交10分鐘； (4) 用終止液侵泡1分鐘，終止反應； (5) 滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20 X物鏡掃視和計數(shù)，用60或100 X物鏡觀 察細菌形態(tài)。
【文檔編號】C12R1/46GK104313174SQ201410635300
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】方華成, 洪冉, 易春, 劉振世 申請人:方華成