一種锝標(biāo)耐久霉素分子探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于耐久霉素分子探針技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種锝標(biāo)耐久霉素分子探針。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞凋亡在腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療效應(yīng)、心肌缺血再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊、缺血缺氧性腦損傷、心、肝、肺移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測(cè)以及帕金森病等的機(jī)制研究有重要作用，而建立一種早期檢測(cè)細(xì)胞凋亡的特異性影像學(xué)技術(shù)一直是一項(xiàng)臨床難題。放射性核素顯像由于具有檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，因此，成為發(fā)展活體凋亡檢測(cè)技術(shù)的重要研究方向。目前較成熟的凋亡探針膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)已被多項(xiàng)研究證實(shí)用于凋亡檢測(cè)，放射性锝標(biāo)記的Annexin V(99mTc-AnnexinV)存在較為明顯的不足，其分子量較大(36000Da)，血液清除速率較慢，肝臟本底十分明顯。因此，注射后相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)靶器官/本底放射性計(jì)數(shù)比仍然不能達(dá)到最佳水平，另外Annex in V主要與凋亡細(xì)胞中的脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)結(jié)合，由于哺乳動(dòng)物中凋亡細(xì)胞中PS遠(yuǎn)低于磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，革E點(diǎn)的親和力較低，限制了其在臨床的實(shí)際應(yīng)用。
[0003]耐久霉素(Duramycin)是由19個(gè)氨基酸構(gòu)成的最小的三維結(jié)構(gòu)聚肽，能以1:1的比例與PE結(jié)合，具有較高的親和力，并且分子量(1200Da)遠(yuǎn)小于Annexin V(36000Da)，靶/非靶比值高。HYNIC可作為輔助側(cè)鏈來標(biāo)記小分子多肽，根據(jù)以往的報(bào)道中表現(xiàn)出較好的攝取和清除性質(zhì)。另外，一步法標(biāo)記試劑盒的合成，使得放射性核素標(biāo)記簡(jiǎn)單易行，且無需進(jìn)一步純化。因此，我們對(duì)99mTc-HYNIC標(biāo)記的Duramy c in進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
[0004]常規(guī)對(duì)Duramycin進(jìn)行標(biāo)記都是進(jìn)行HYNIC單標(biāo)記，本專利通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)路線創(chuàng)新性的實(shí)現(xiàn)了HYNIC對(duì)Duramycin的雙標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了最終對(duì)Duramyc in進(jìn)行99mTc雙放射性標(biāo)記的目標(biāo)。相比傳統(tǒng)的99mTc單標(biāo)顯像劑，本專利目標(biāo)產(chǎn)物在不改變主體分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上每個(gè)分子結(jié)構(gòu)中含有的放射性信號(hào)提高一倍，因此明顯具有更高的放射活性和比活度，也必將極大的提高生物顯像的靈敏度和分辨率，為臨床科研工作提供更強(qiáng)大的顯像手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種锝標(biāo)耐久霉素分子探針，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種锝標(biāo)耐久霉素分子探針，其制備方法為以下幾個(gè)步驟:
[0007]步驟一:HYNIC對(duì)耐久霉素的修飾:
[0008]1.1.1反應(yīng)液的配置:
[0009]將HYNIC(琥珀酰亞胺基-6-肼基煙酸鹽丙酮腙)溶解到無水DMF(二甲基甲酰胺)中，配置成溶液I，最終濃度為20mg/100uL;將耐久霉素溶解到無水DMF中，配置成溶液2，最終濃度為lmg/100uL;將DIEA(二異丙基乙胺)配置成DMF溶液3，濃度為5mg/100uL。
[0010]1.1.2HYNIC與耐久霉素的共價(jià)偶聯(lián):
[0011]于1.5mL EP管內(nèi)依次加入10uL溶液I，10uL溶液2和10uL溶液3，充分混合均勻后，避光，室溫下反應(yīng)15h。
[0012]步驟二:偶聯(lián)產(chǎn)物的純化:
[0013]利用HPLC對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行純化，流動(dòng)相A:含有0.1 %的純凈水；流動(dòng)相B:含有
0.1 % 的乙腈。梯度洗脫條件:0-5min 10 % A，5_20min ,10% B—90 % B，20_25min 90 % B，25-30min 90%B一10%B，流速4mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):254nm。
[0014]步驟三:偶聯(lián)產(chǎn)物的放化標(biāo)記
[0015]取10ug偶聯(lián)產(chǎn)物HYNIC-Duramycin加入到含有10mg Tricine(三甲基甘氨酸)、32mg TPPTS(三苯基膦三間磺酸鈉)和21ug SnCl的2mL水溶液中。分取其中500uL置于2mL離心管中進(jìn)行凍干備用。最后將0.5mL活度大于50mCi的99mTc加入到上述備用離心管中80°C反應(yīng)30分鐘即可。
[0016]進(jìn)一步的，所述步驟二中，梯度洗脫條件為:0-5min 10%Α,5-20πι?η,10%Β—90%B，20-25min 90%B,25-30min 90%B—10%B，流速4mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):254nm。
[0017]進(jìn)一步的，HYNIC和耐久霉素的投料比例為20:1。
[00? 8]本發(fā)明的有益效果:常規(guī)對(duì)Duramycin進(jìn)行標(biāo)記都是進(jìn)行HYNIC單標(biāo)記，本專利通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)路線創(chuàng)新性的實(shí)現(xiàn)了HYNIC對(duì)Duramyc in的雙標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了最終對(duì)Duramycin進(jìn)行99mTc雙放射性標(biāo)記的目標(biāo)。相比傳統(tǒng)的99mTc單標(biāo)顯像劑，本專利目標(biāo)產(chǎn)物在不改變主體分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上每個(gè)分子結(jié)構(gòu)中含有的放射性信號(hào)提高一倍，因此明顯具有更高的放射活性和比活度，也必將極大的提高生物顯像的靈敏度和分辨率，為臨床科研工作提供更強(qiáng)大的顯像手段。
[0019]本研究中的分子探針99mTc雙放射性標(biāo)記的HYNIC-Duramycin(99mTc-d1-HYNIC-Duramycin)在新西蘭兔模型中顯示出較好的理化和生物學(xué)性質(zhì)，與已發(fā)表的鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。在體內(nèi)器官分布實(shí)驗(yàn)中，正常新西蘭兔耳緣靜脈注射99mTc-d1-HYNIC-Duramycin(lmci/kg)30、60、90min后，分別行平面顯像觀察顯像劑血液清除及臟器分布可見該探針主要在心、肝、腎、骨髓及膀胱攝取，隨時(shí)間心、肝、腎、骨髓的攝取濃度逐漸降至本底水平。在藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，耳緣靜脈注射99mTc-d1-HYNIC-Duramycin(lmci/kg) 1、2、3、4、5、10、、30、60，90、120、180min后，分別采集靜脈血lml，測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)時(shí)間衰減校正后，擬合血液-放射性曲線，其半排時(shí)間為2.8 ± 0.2min。
[0020]血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡異常活躍是造成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定，弓丨發(fā)心肌梗死、猝死等嚴(yán)重臨床后果的重要原因。我們采用新西蘭大白兔，通過高脂飼料喂養(yǎng)加腹主動(dòng)脈球囊損傷建立動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，喂養(yǎng)3月后進(jìn)行99mTc-d1-HYNIC-Duramycin活體與離體腹主動(dòng)脈顯像，計(jì)算活體顯像腹主動(dòng)脈革E/非革E比值(T/NT)與離體腹主動(dòng)脈組織測(cè)定每克組織百分注射劑量率(% ID/g) J^Tc-d1-HYNIC-Duramycin能夠與易損斑塊組的腹主動(dòng)脈易損斑塊特異性結(jié)合并清晰顯像，而正常組腹主動(dòng)脈攝取很少，易損斑塊組腹主動(dòng)脈T/NT值及％ID/g值明顯高于正常對(duì)照組(p<0.05)。并且模型組給予阿托伐他汀治療4周后，99mTc-d1-HYNIC-Duramycin的攝取明顯減少，腹主動(dòng)脈T/NT值及％ ID/g值較治療前降低(P<0.05)。。因此，99mTc-d1-HYNIC-Duramycin作為一種新型凋亡探針，有望將來運(yùn)用到臨床，更為活體檢測(cè)易損斑塊并且評(píng)價(jià)藥物穩(wěn)定斑塊的療效的影像學(xué)手段。
【附圖說明】
[0021]圖1 是通過 Ma tr i x_as s i s t ed laser desorpt1n / 1nizat1n massspectrometry (MALDI)對(duì)原料耐久霉素的分子量進(jìn)行確認(rèn)圖譜。