專(zhuān)利名稱(chēng):用于高靈敏度地檢測(cè)多種多核苷酸序列的微陣列支持物的制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及新的微陣列制備方法、所獲得的微陣列支持物、包含它們的試劑盒以及它們用于高效地檢測(cè)存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中的多種靶多核苷酸(或核苷酸序列)的用途。所獲得的微陣列支持物尤其可用于分子診斷和基因表達(dá)分析。本發(fā)明的微陣列支持物也允許鑒定、檢測(cè)和/或定量通過(guò)遺傳擴(kuò)增所獲得的大量基因或基因產(chǎn)物(擴(kuò)增子),這些基因或基因產(chǎn)物存在于樣品之中,并由包含所述基因的屬于不同遺傳分類(lèi)組別(綱、科、屬、種、個(gè)體)的(微)生物體獲得。
背景技術(shù):
多個(gè)表達(dá)基因的鑒定以及(微)生物體的鑒定可通過(guò)來(lái)自遺傳物質(zhì)的特定序列的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)。(樣品中存在的)表達(dá)基因的鑒定和定量通常是在將mRNA反轉(zhuǎn)錄為其相應(yīng)的cDNA后并檢測(cè)所述cDNA進(jìn)行的。特定(微)生物體的檢測(cè)通過(guò)擴(kuò)增(或復(fù)制)(樣品中存在的)基因組DNA的特定序列、然后檢測(cè)和/或鑒定所擴(kuò)增的序列而很容易地進(jìn)行。在這兩種情況下,所擴(kuò)增或復(fù)制的序列(靶序列)都可介由與存在于或連接于根據(jù)微陣列的固體支持物之上的相應(yīng)俘獲分子的特異性雜交而予以檢測(cè)。與其特異性俘獲分子結(jié)合的靶序列的定量允許估計(jì)樣品中存在的mRNA或基因組DNA的含量。優(yōu)選地,合適的對(duì)照手段包括在內(nèi),并進(jìn)行必要的校正以考慮不同步驟的效率,例如靶序列的復(fù)制或擴(kuò)增步驟以及它們介由與形成微陣列的俘獲分子的雜交的結(jié)合。微陣列為主要是根據(jù)兩種方法制造的固體支持物。第一種方法在美國(guó)專(zhuān)利5,510,270和5,700,637中有描述,是基于位于固體支持物表面的俘獲序列的光蝕刻原位合成。光蝕刻DNA合成使用的是快速固相亞磷酰胺(phosphoramidite)化學(xué)。位置及順序的控制是通過(guò)組合可因光照射而激活的5′-光保護(hù)的亞磷酰胺和在適當(dāng)位置上含有光得以通過(guò)的孔洞的系列光罩實(shí)現(xiàn)的。一經(jīng)激發(fā),在此操作初期合成的部分寡核苷酸序列上存在的光保護(hù)基團(tuán)即被除去,而寡聚體則在添加有關(guān)單體之后延伸又一個(gè)核苷酸。當(dāng)前的偶聯(lián)效率對(duì)這些微陣列造成大約25個(gè)堿基實(shí)際大小限制的影響。除此限之外,還積累不完全產(chǎn)物,削弱了該測(cè)定的特異性。根據(jù)本方法的俘獲寡核苷酸大小或長(zhǎng)度方面的限制是歸因于逐步進(jìn)行的合成的效率并非100%、從而在同一位置內(nèi)發(fā)生截短的寡核苷酸的積累的事實(shí)。光蝕刻法導(dǎo)致了支持物上短寡核苷酸的存在。該方法的主要優(yōu)勢(shì)在于使如此獲得的俘獲核苷酸序列小型化以及產(chǎn)生含數(shù)千個(gè)俘獲核苷酸序列的高密度陣列的可能性。第二種方法是基于化學(xué)或酶促合成俘獲序列,之后機(jī)械沉積到已知的(根據(jù)固體支持物表面的)特定位置上。利用這種方法,在待點(diǎn)樣、沉積或連接的序列的大小方面沒(méi)有限制,因?yàn)樗鼈兛筛鶕?jù)任何化學(xué)或酶促方法合成,且其序列可通過(guò)分析方法(通常為測(cè)序法)加以確認(rèn)。與原位合成途徑相比,沉積技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)在于其重要的多功能性。該方法允許制造具有實(shí)際上任何目的俘獲分子的微陣列,包括但不限于任何長(zhǎng)度的核酸序列、抗體、脂質(zhì)、碳水化合物、小化合物等。此外,可優(yōu)化序列的合成、可純化序列、可在用前檢驗(yàn)其質(zhì)量和/或在偶聯(lián)至固體表面前調(diào)整其濃度。不過(guò),該方法的一個(gè)劣勢(shì)在于此操作費(fèi)時(shí),因?yàn)槊恳粋€(gè)俘獲分子序列在點(diǎn)樣到根據(jù)陣列的固體支持物表面前都必需分別處理,因而限制了所獲得的微陣列的大小。與寡核苷酸微陣列雜交的化學(xué)明顯不同于由長(zhǎng)DNA俘獲序列或分子構(gòu)建的陣列。已觀察到長(zhǎng)的特定俘獲序列提供了比其相應(yīng)短片段好得多的溶液或樣品中存在的互補(bǔ)靶序列的結(jié)合。在實(shí)踐中,長(zhǎng)多核苷酸俘獲序列用于長(zhǎng)多核苷酸靶序列的直接結(jié)合。在典型的基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,用于cDNA結(jié)合的俘獲核苷酸序列含50個(gè)堿基或更多,例如70個(gè)堿基或者可能甚至含600個(gè)堿基或核苷。當(dāng)僅有15-20個(gè)堿基的短寡核苷酸用作為俘獲序列時(shí)(參見(jiàn)US5,510,270),長(zhǎng)cDNA的結(jié)合罕見(jiàn)且可能不可檢測(cè)。為充分地檢測(cè)、鑒定和/或定量長(zhǎng)cDNA,需采取以下附加步驟。通過(guò)使用攜帶T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的引物,首先將RNA序列反轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA。然后將這些cDNA序列在體外重新轉(zhuǎn)錄為若干RNA拷貝,隨之將其切割成小片段。然后利用這些小RNA片段在攜帶針對(duì)這些RNA片段中每一個(gè)的系列俘獲序列的陣列上進(jìn)行雜交。片段化是必需的,以確保靶RNA序列充分地接近極短的俘獲序列。需要特定的算法以恰當(dāng)?shù)貙⑦@些不同俘獲分子的雜交模式與靶DNA或mRNA的原始序列聯(lián)系起來(lái)。
為了能夠檢驗(yàn)特定靶序列的特異性雜交,也有必要為每一個(gè)俘獲核苷酸序列實(shí)施對(duì)照,這包括添加除了一個(gè)堿基的差異之外與俘獲核苷酸序列相同的對(duì)照俘獲核苷酸序列。另一個(gè)問(wèn)題因雙鏈DNA(dsDNA)而起。當(dāng)待于微陣列上分析dsDNA時(shí),將優(yōu)選其在溶液中重新結(jié)合,而不與存在于或連接于固體基質(zhì)表面的相應(yīng)俘獲核苷酸序列雜交。利用短寡核苷酸直接鑒定和/或定量大的雙鏈擴(kuò)增子(遺傳擴(kuò)增后獲得的)產(chǎn)生極低的靈敏度或者根本不靈敏,因此并不實(shí)用。再次地,擴(kuò)增子必需使用由攜帶T3或T7序列的引物進(jìn)行的雙鏈擴(kuò)增操作、然后是使用RNA聚合酶的反轉(zhuǎn)錄重新轉(zhuǎn)錄為RNA。這些RNA被切割成大約40個(gè)堿基的片段,之后于陣列上檢測(cè)(參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO97/29212的實(shí)施例1)。這里利用了小于30個(gè)核苷的俘獲核苷酸序列,將上述技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)rpoB基因的鑒定。所述方法就其不允許直接檢測(cè)由遺傳擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR)產(chǎn)生的擴(kuò)增子、而是需要另一輪的反應(yīng)和靶序列的復(fù)制而言很復(fù)雜,這在所述靶序列的定量中分別引入了額外的偏差。然而,介由短多核苷酸序列的化學(xué)合成和沉積構(gòu)建微陣列是有用的,因?yàn)樗强焖偾伊畠r(jià)的方法。除此之外,俘獲分子或序列的設(shè)計(jì)可根據(jù)待分析或辨別序列的要求而容易地調(diào)配。不過(guò),如上文所解釋的那樣,使用短核苷酸俘獲探針對(duì)長(zhǎng)靶核苷酸片段的檢測(cè)造成強(qiáng)大的限制。
發(fā)明目的本發(fā)明旨在提供用于獲得無(wú)現(xiàn)有技術(shù)中缺點(diǎn)的微陣列支持物的新穎的制造方法。本發(fā)明尤其旨在提供用于快速構(gòu)建攜帶序列的微陣列支持物的新穎方法,其在檢測(cè)方法中有利地將(1)短核苷酸序列對(duì)待檢測(cè)、鑒定和/或定量的靶核苷酸序列特異的高特異性和(2)長(zhǎng)核苷酸序列的高靈敏度(與超過(guò)150個(gè)堿基的長(zhǎng)核苷酸序列的結(jié)合靈敏度相同)結(jié)合起來(lái)。本發(fā)明的另一個(gè)目.的在于提供高度適合于直接檢測(cè)cDNA或長(zhǎng)雙鏈DNA序列的新穎的(微)陣列支持物。本發(fā)明的另一目的在于提供新穎的構(gòu)建方法,以獲得高度適合于進(jìn)一步調(diào)配并構(gòu)建適應(yīng)不同客戶(hù)需求的可定制(微)陣列的標(biāo)準(zhǔn)(微)陣列固體支持物。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面涉及用于獲得位于固體支持物表面的核苷酸組(set)(微)陣列的新方法,以用于檢測(cè)、鑒定和/或定量很可能存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中的至少兩種、優(yōu)選四種不同靶多核苷酸或核苷酸序列。有利地,所述方法包括步驟-將核苷酸線序列(line sequence)固定于固體支持物表面,所述核苷酸線(nucleotide line)長(zhǎng)至少20個(gè)核苷酸,并且具有與待檢測(cè)和/或定量的靶核苷酸序列無(wú)關(guān)的(隨機(jī))核苷酸序列(這意味著所述序列不能夠與所述靶核苷酸序列互補(bǔ)雜交);-將核苷酸釣鉤(hooks)置于由所述核苷酸線所覆蓋的固體支持物表面的至少4個(gè)特定位置上,所述釣鉤具有對(duì)于所述待檢測(cè)和/或定量的靶多核苷酸序列特異性的序列;和
-使苷酸釣鉤與核苷酸線在所述特定表面位置上共價(jià)連接,以便在固體支持物表面的所述特定位置上形成對(duì)于所述靶多核苷酸或核苷酸序列的結(jié)合特異性的多核苷酸組。核苷酸線通過(guò)其末端之一(5′或3′)將序列共價(jià)固定至固體支持物表面,并能夠通過(guò)另一未結(jié)合的末端固定核苷酸釣鉤。此簡(jiǎn)單且不貴的方法中獲得的具有長(zhǎng)核苷酸組構(gòu)建體的陣列提供了(1)短特異性核苷酸釣鉤序列的高特異性,其中每一種核苷酸釣鉤對(duì)至少四種不同多核苷酸或核苷酸序列中的一種靶序列是特異的,和(2)高靈敏度,達(dá)到了超過(guò)150個(gè)堿基、很可能超過(guò)350個(gè)堿基的長(zhǎng)多核苷酸序列的有利的靈敏度。此外,優(yōu)選的方法旨在通過(guò)沉積核苷酸線而獲得固體支持物表面均一和有效的覆蓋,其允許核苷酸釣鉤與這些核苷酸線在固體支持物表面的特定位置上進(jìn)一步共價(jià)連接。并非所述固體支持物表面都導(dǎo)致形成多核苷酸組,因?yàn)樗龉腆w支持物表面的有些位置依然僅被核苷酸線所覆蓋。
或者,通過(guò)例如為鏈抗生物素蛋白、抗原或抗體(與早已固定于固體支持物表面的互補(bǔ)分子(生物素、抗體、抗原)相結(jié)合)的接頭分子將線核苷酸序列固定于固體支持物的表面。
這樣,也可能通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法僅僅選擇固體支持物表面上包括了能夠與待檢測(cè)、鑒定和/或定量的相同或不同靶多核苷酸或核苷酸序列結(jié)合的(與所述線)相似或不同地相連的核苷酸釣鉤的特定位置。本發(fā)明的固體支持物表面優(yōu)選每cm2包含至少四個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)的多核苷酸組的微陣列。此陣列的核苷酸線序列可以是一個(gè)隨機(jī)(同一隨機(jī))序列或者可以是多隨機(jī)(不同隨機(jī))序列。優(yōu)選地,所述核苷酸線不包含或者不是由能夠在所用條件下與生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中存在的待檢測(cè)和/或定量的任何靶多核苷酸或核苷酸序列雜交的序列構(gòu)成的。兩核苷酸鏈的雜交,如所屬領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所公知的那樣,是由兩序列的同一性或相似性百分比決定的,并由所用的雜交條件(如嚴(yán)謹(jǐn)、輕度嚴(yán)謹(jǐn)或非嚴(yán)謹(jǐn)條件)決定。
在本案中,術(shù)語(yǔ)“不雜交”的含義意味著將有少于1%的靶雜交到俘獲多核苷酸上,且優(yōu)選少于0.1%,而且甚至優(yōu)選少于0.01%。為避免雜交,靶多核苷酸(或核苷酸)序列與其特異性或?qū)?yīng)的核苷酸線序列之間將有不多于約15個(gè)連續(xù)互補(bǔ)堿基對(duì)的結(jié)合,優(yōu)選可能將有少于10個(gè)這樣的配對(duì),更優(yōu)選少于5個(gè)。這樣,核苷酸線的序列將含有優(yōu)選少于15個(gè)堿基,并且更優(yōu)選少于10個(gè),而且還更優(yōu)選少于5個(gè)與待檢測(cè)的靶序列互補(bǔ)的連續(xù)堿基??赡艿倪B續(xù)序列的確定通過(guò)將該序列與如由Genbank所提供的分子數(shù)據(jù)庫(kù)比較并利用諸如Nucleotide-nucleotideBLAST(blastn)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)的軟件很容易進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案,核苷酸線是通過(guò)支持物上核苷酸序列的原位合成獲得的。根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案,核苷酸線具有由大約20個(gè)-大約1000個(gè)核苷酸組成的序列,更優(yōu)選大約50個(gè)-大約200個(gè)核苷酸,而且甚至更優(yōu)選大約60個(gè)-大約100個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案,與核苷酸釣鉤偶聯(lián)的核苷酸線是具有不同結(jié)合親和力并連接于不同固體支持物的序列,其中這些固體支持物中的每一個(gè)都以特定的化學(xué)或物理?xiàng)l件或性質(zhì)為特征,例如特定的化學(xué)或物理結(jié)合親和力(即不同珠子的不同化學(xué)或物理性質(zhì)包括(但不限于)不同的大小、熒光、顏色、磁性等)。該技術(shù)特征允許通過(guò)分析它們所結(jié)合的固體支持物的化學(xué)或物理性質(zhì)來(lái)辨別序列。根據(jù)本發(fā)明,待檢測(cè)、鑒定和/或定量的靶多核苷酸或和核苷酸序列為DNA或RNA序列,如基因組DNA或擴(kuò)增子,它們很可能在其結(jié)合到核苷酸釣鉤之前被擴(kuò)增或復(fù)制。本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的微陣列,用于檢測(cè)、鑒定和/或定量很可能同時(shí)存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中的至少2種、至少4種、優(yōu)選至少10種、更優(yōu)選至少30種不同靶多核苷酸或核苷酸序列。本發(fā)明的另一方面涉及固體支持物,其包括具有長(zhǎng)至少20個(gè)核苷酸的隨機(jī)序列的核苷酸線,且所述核苷酸線通過(guò)其序列的第一末端均一地共價(jià)固定于固體支持物的表面,即用于制備根據(jù)本發(fā)明的微陣列的表面。所述“經(jīng)處理的”固體支持物可被客戶(hù)作為適應(yīng)于制備檢測(cè)微陣列固體支持物的中間產(chǎn)品直接使用;在添加核苷酸釣鉤(以與核苷酸線相連)之后,客戶(hù)能夠在所述“經(jīng)處理的”固體支持物表面的特定位置上形成多核苷酸組。
該固體支持物在下文被定義為“可定制的(customizable)微陣列”。有利地,核苷酸線序列的另一(游離)末端(未固定至表面的)優(yōu)選包含能夠在之后與(很可能是官能團(tuán)化的)核苷酸釣鉤序列共價(jià)(以形成連接)反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)或官能團(tuán)。優(yōu)選地,所述核苷酸釣鉤也是以能夠與核苷酸線(官能團(tuán)化或否)反應(yīng)(以形成連接)的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)為端點(diǎn)的序列。優(yōu)選地,核苷酸線末端的所述反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)或基團(tuán)是由能夠與核苷酸釣鉤末端的NH2官能團(tuán)直接反應(yīng)的醛、環(huán)氧化物或丙烯酸酯官能團(tuán)組成的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,固定在支持物上的核苷酸線在其游離末端(或附近(這意味著允許與另一核苷酸序列(釣鉤序列)的末端相結(jié)合的距離))含有核苷酸核糖。所述核糖被進(jìn)一步氧化為醛,以便隨后固定核苷酸釣鉤末端的NH2官能團(tuán)。有利地,固體支持物表面上的多核苷酸線和/或多核苷酸組的密度超過(guò)10fmole、優(yōu)選100fmole/cm2固體支持物表面。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中,線序列和釣鉤序列之間的共價(jià)連接并非磷酸二酯鍵連接。本發(fā)明的另一方面涉及所述的固體支持物,其中固定的具有官能團(tuán)化序列末端的核苷酸線通過(guò)共價(jià)連接與核苷酸釣鉤結(jié)合,形成多核苷酸組,其中所述固體支持物表面僅在該固體支持物表面的特定位置上包含與核苷酸線結(jié)合的核苷酸釣鉤,并且其中其它位置上仍?xún)H被核苷酸線所覆蓋。
這意味著固體支持物表面包含兩類(lèi)固定的核苷酸序列固體支持物特定位置上的多核苷酸組,以及所述固體支持物表面其它位置上的優(yōu)選由反應(yīng)活性的化學(xué)基團(tuán)和官能團(tuán)官能團(tuán)化的核苷酸線。其它位置是可用于進(jìn)一步固定釣鉤的那些位置。這類(lèi)固體支持物在下文被定義為“定制的微陣列”或“半定制的(semi-customized)微陣列”。這意味著這類(lèi)“定制的微陣列”在固體支持物表面包括可被客戶(hù)修飾的特定位置,以便在向核苷酸線添加特定的核苷酸釣鉤(由客戶(hù)選擇)之后在固體支持物表面的特定位置上形成其它多核苷酸組,所述核苷酸釣鉤能夠與核苷酸線的官能團(tuán)化末端共價(jià)反應(yīng)。
在另一方面,“半定制的微陣列”也包括由兩類(lèi)固定的核苷酸序列組成的固體支持物表面固體支持物不為核苷酸線(根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的陣列)所覆蓋的特定位置上的標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸,以及所述固體支持物其它位置上的核苷酸線。這意味著這類(lèi)定制的微陣列包含預(yù)先點(diǎn)樣到固體支持物特定位置上的常規(guī)多核苷酸,以及位于所述固體支持物其它位置上的核苷酸線,其能夠被客戶(hù)修飾以便在添加特定核苷酸釣鉤之后在被核苷酸線所覆蓋的固體支持物表面的特定位置上形成多核苷酸組。本發(fā)明的另一方面涉及包含選擇用于獲得為客戶(hù)改造的微陣列的根據(jù)本發(fā)明(可定制微陣列或定制微陣列)的工具和介質(zhì)的固體支持物的試劑盒。此類(lèi)工具和介質(zhì)優(yōu)選為能夠與核苷酸線或核苷酸釣鉤末端反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)或官能團(tuán)、能夠與官能團(tuán)化的核苷酸線反應(yīng)的核苷酸釣鉤(優(yōu)選官能團(tuán)化的),以及可用于洗滌固體支持物表面以除去未結(jié)合的核苷酸釣鉤序列的介質(zhì)(緩沖液)。存在于根據(jù)本發(fā)明的試劑盒之中的核苷酸釣鉤(優(yōu)選為官能團(tuán)化的核苷酸釣鉤)根據(jù)客戶(hù)的應(yīng)用需求選擇。因此,該試劑盒是可變通的,并可根據(jù)所需的樣品中多個(gè)靶分子的檢測(cè)、鑒定和/或定量調(diào)整。這意味著根據(jù)本發(fā)明的“定制的微陣列”可已經(jīng)在固體支持物表面的特定位置上包含具有特定核苷酸釣鉤的多核苷酸組,所述多核苷酸組存在于根據(jù)陣列的所述特定位置上,且其分布信息提供給客戶(hù),以使他能夠用另外的序列在其它特定位置上完成所述“定制的微陣列”的制備,用以改善所需的多個(gè)靶分子的檢測(cè)、鑒定和/或定量。存在于試劑盒之中的工具和介質(zhì)也被選擇用于實(shí)施一個(gè)或多個(gè)遺傳擴(kuò)增或復(fù)制步驟以及用于獲得多個(gè)目的核苷酸序列的特異性檢測(cè)、鑒定和/或定量。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的此類(lèi)工具和介質(zhì)包括引物、循環(huán)儀、聚合酶或其它介質(zhì),例如用于獲得由靶核苷酸序列與其相應(yīng)的核苷酸組的結(jié)合所引起的信號(hào)的熒光、比色和/或放射性標(biāo)記。多個(gè)靶分子的檢測(cè)、鑒定和/或定量可介由肉眼進(jìn)行,但優(yōu)選在特定的儀器如自動(dòng)讀數(shù)器中進(jìn)行,優(yōu)選配備有必要的軟件用以檢測(cè)和/或解讀因靶分子與其各自的俘獲分子(多核苷酸組的釣鉤末端)結(jié)合所產(chǎn)生的信號(hào)。此類(lèi)儀器可完全自動(dòng)化。在本發(fā)明上下文中,術(shù)語(yǔ)“核酸”、“寡核苷酸”、“靶或核苷酸序列”、“陣列”、“核苷酸序列”、“靶核酸”、 基本上結(jié)合”、“與…特異性雜交”、“背景”、“定量”等的含義如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO97/27317中所述,特此將其并入作為參考。本上下文中的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指至少2個(gè)核苷酸或核苷酸類(lèi)似物的核苷酸序列或核苷酸樣序列。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”或“短多核苷酸”尤其是指少于100且優(yōu)選少于50個(gè)核苷酸或核苷酸類(lèi)似物的核苷酸或核苷酸樣序列。術(shù)語(yǔ)“長(zhǎng)多核苷酸”是指多于100個(gè)核苷酸的核苷酸或核苷酸樣序列。核苷酸、寡核苷酸等包括類(lèi)似的物質(zhì),其中糖-磷酸主鏈被修飾和/或替換,只要其雜交性質(zhì)未受損害即可。作為舉例,主鏈可被替換為等價(jià)的合成肽,稱(chēng)之為肽核酸(PNA),或替換為嵌核酸(INA)。術(shù)語(yǔ)“同源序列”和“同源物”的含義如歐洲專(zhuān)利EP1266034所述,將其并入作為參考。本上下文中用于構(gòu)建微陣列的術(shù)語(yǔ)“固體支持物”旨在包括任何類(lèi)型的固體材料,可對(duì)其進(jìn)行物理操作以實(shí)施必要的反應(yīng),象溫育很可能含有靶核苷酸序列或靶核苷酸序列拷貝的測(cè)試溶液或樣品。該固體支持物可以是獨(dú)一的,或者可以是由數(shù)種材料組成的復(fù)合物,其中之一為基質(zhì)(substrate),在其上固定序列以產(chǎn)生微陣列。本領(lǐng)域所用基質(zhì)的典型實(shí)例為聚合物,其可被官能團(tuán)化以更好地固定俘獲分子。在其上固定核苷酸線的所述基質(zhì)或支持物可以是有孔或無(wú)孔支持物,可以是平滑或粗糙的,并且可被放置或安置到例如由玻璃或塑料制成的另一固體支持物之上。
術(shù)語(yǔ)“樣品”、“生物學(xué)樣品”或“測(cè)試溶液”旨在包括懷疑含有靶核苷酸序列的任何樣品或溶液。在本發(fā)明的上下文中,檢測(cè)的特別是對(duì)于(微)生物或其組分特異的多核苷酸或核苷酸序列。測(cè)試溶液可以是含有擴(kuò)增產(chǎn)物(微)生物或其組分?jǐn)U增子的溶液。
術(shù)語(yǔ)“均一地”旨在包括固定于固體支持物表面的均質(zhì)的核苷酸線層。在本上下文中,每cm2表面的核苷酸線密度是均一的,固體支持物表面不同部分的差異小于30%且優(yōu)選小于10%。陣列不同點(diǎn)上核苷酸釣鉤的固定必需是定量的且相似的,因?yàn)楹塑账後炪^是存在于同一樣品中的多個(gè)靶核苷酸的俘獲分子,對(duì)于其含量必需加以量化并彼此相當(dāng)。本發(fā)明將參照附圖在下列實(shí)施例和具體實(shí)施方案中更詳細(xì)地加以描述。所述實(shí)施例、實(shí)施方案和附圖無(wú)論如何都不旨在限制所主張的本發(fā)明的范圍,所用的參考標(biāo)記也不是。
圖1表示根據(jù)本發(fā)明具有核苷酸線(1)、核苷酸釣鉤(2)和多核苷酸組(3)、用以在被核苷酸線(1)所覆蓋的固體支持物表面(5)特定位置(6)上特異性檢測(cè)、鑒定和/或定量樣品中的多種靶多核苷酸或核苷酸序列(4)的陣列。
圖2表示根據(jù)本發(fā)明被存在于特定位置(6)上的線(1)或(線-釣鉤)多核苷酸特異性組(3)所覆蓋的陣列(5)表面。用于構(gòu)建(微)陣列的固體支持物表面均一地覆蓋有核苷酸線(1)。
圖3表示根據(jù)本發(fā)明“半定制陣列”的表面,其一部分(7)覆蓋有存在于支持物(6)特定位置上的某些靶序列所特異的多核苷酸組,而表面(5)另一部分(8)覆蓋有用于進(jìn)一步的核苷酸釣鉤(2)結(jié)合的核苷酸線(1),以便提供特定的多核苷酸組(3)用于進(jìn)一步的靶檢測(cè)。
圖4表示根據(jù)本發(fā)明“半定制陣列”的表面,其一部分(7)覆蓋有存在于不被核苷酸線(1)所覆蓋的支持物(9)特定位置上的某些靶序列所特異的多核苷酸,而表面(5)另一部分(8)覆蓋有用于進(jìn)一步的核苷酸釣鉤(2)結(jié)合的核苷酸線(1),以便提供特定的多核苷酸組(3)用于進(jìn)一步的靶檢測(cè)。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及新穎的構(gòu)建法,其產(chǎn)生高度適合于檢測(cè)很可能存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中的多個(gè)靶核苷酸序列、尤其是cDNA序列或長(zhǎng)雙鏈DNA序列的新穎的(微)陣列。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,如此獲得的陣列固體支持物表面(5)的至少一部分很可能隨機(jī)地覆蓋有作為核苷酸線(1)的核苷酸序列,然后在其上的特定位置(6)上沉積特定的核苷酸釣鉤,以產(chǎn)生多核苷酸組(3),其允許相應(yīng)的靶核苷酸序列的特異性結(jié)合。最后結(jié)合的序列(也稱(chēng)之為多核苷酸組(3))為長(zhǎng)核苷酸序列或一部分為與支持物結(jié)合的非特異性序列、而另一部分為特異性識(shí)別或結(jié)合待檢測(cè)靶序列(4)的序列的多核苷酸(見(jiàn)圖1和圖2)。所述多核苷酸組(3)也被稱(chēng)之為俘獲序列、特異性俘獲序列或?qū)?yīng)的俘獲序列,意味著它們以其互補(bǔ)于靶核苷酸序列的部分序列識(shí)別靶核苷酸序列。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,核苷酸線(1)存在于與樣品接觸的基質(zhì)或微陣列支持物的整個(gè)表面(5)上。然后該表面被特定的核苷酸釣鉤(2)部分或完全地覆蓋。
在本發(fā)明特別的實(shí)施方案中,所有的核苷酸線(1)可能由相同的隨機(jī)序列組成,其不與靶生物體基因組上多于10個(gè)的連續(xù)堿基互補(bǔ)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,線核苷酸序列(1)并不完全相同,即核苷酸線并不都具有相同的序列,而是涵蓋了大量的不同序列。核苷酸線的序列可能是已知或未知的。
在特別的實(shí)施方案中,核苷酸線(1)的序列為隨機(jī)序列,例如利用4核苷前體混合物經(jīng)由原位合成所獲得的隨機(jī)序列。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的那樣,給定序列的反應(yīng)取決于反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性。交叉反應(yīng)的概率主要地取決于序列同源性或同一性。在隨機(jī)合成中獲得與另一個(gè)相同的25個(gè)核苷的序列的概率為1/425或1/1×1015??紤]到相同序列這種極低的頻率,線(1)的隨機(jī)合成對(duì)于本發(fā)明的目的是可行的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中,在沉積到陣列之前從而在固定到線(1)上之前化學(xué)合成本發(fā)明的核苷酸釣鉤(2)或釣鉤。酶促合成也是可能的。
在本發(fā)明特別的實(shí)施方案中,核苷酸釣鉤(2)為寡核苷酸或短多核苷酸,具有由大約10個(gè)-大約120個(gè)核苷酸組成的序列,更優(yōu)選大約15個(gè)-大約60個(gè)核苷酸,更優(yōu)選大約20個(gè)-大約50個(gè)核苷酸,更優(yōu)選大約20個(gè)-大約40個(gè)核苷酸。本上下文中的“大約”是指有可能要比所提及的多或少1、2、3到多達(dá)5個(gè)核苷酸。
在特別的應(yīng)用中,(微)陣列攜帶具有少于大約100個(gè)核苷酸或堿基的序列的核苷酸釣鉤(2),但提供與具有多于大約150個(gè)核苷酸或堿基的長(zhǎng)多核苷酸序列相同的結(jié)合效率。更優(yōu)選地,它們提供與長(zhǎng)于大約250個(gè)核苷酸或堿基的長(zhǎng)多核苷酸序列相同的結(jié)合效率。介由核苷酸釣鉤(2)與至少大約20個(gè)、大約40個(gè)堿基或核苷酸的核苷酸線(1)的結(jié)合、偶聯(lián)或共價(jià)連接,這是可能的。
在特別的實(shí)施方案中,(微)陣列由具有核苷酸線和待檢測(cè)和/或定量的至少4、10、20、50種不同靶核苷酸序列的特異性核苷酸釣鉤的至少4、10、20、50、100、1000、10000個(gè)位置組成。此類(lèi)陣列具有至少4、10、20、50、100、1000或10000個(gè)點(diǎn)/cm2。
在特別的實(shí)施方案中,線以及待檢測(cè)的不同靶核苷酸分子的釣鉤序列存在于至少4、10、20、50、100、500或1000個(gè)物理上不同的支持物上(優(yōu)選為珠子),每一個(gè)支持物通過(guò)優(yōu)選不同的化學(xué)或物理性質(zhì)(大小、磁性…)鑒定。
在特別的實(shí)施方案中,核苷酸線(1)和/或核苷酸釣鉤(2)為DNA或RNA序列、PNA(參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO0075372)或INA。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中,在俘獲到陣列上之前,介由已知的遺傳擴(kuò)增法例如象PCR法復(fù)制、擴(kuò)增或拷貝待檢測(cè)的靶序列(即多核苷酸或核苷酸序列(4))。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中,核苷酸線(1)的末端(5′或3′)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)固定到固體支持物或基質(zhì)上。
優(yōu)選地,所述核苷酸線(1)被選擇性官能團(tuán)化,以含有或攜帶特定的反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)或基團(tuán),其與可能官能團(tuán)化的支持物或基質(zhì)反應(yīng),形成共價(jià)結(jié)合?;瘜W(xué)官能團(tuán)或基團(tuán)可以是醛、胺、環(huán)氧化物、丙烯酸酯、硫氰酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺…,上述列表并非詳盡的。
優(yōu)選的結(jié)合是在5′氨化末端的核苷酸序列和醛覆蓋表面之間獲得的,形成亞胺鍵,其隨之在NaBH4的存在下被還原。
優(yōu)選地,所述化學(xué)官能團(tuán)或基團(tuán)位于5′或3′末端。核苷酸線共價(jià)固定在支持物上;核苷酸線的第二末端在第二步中通過(guò)合適的化學(xué)或物理工具激活,從而獲得化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)用以固定核苷酸釣鉤。核苷酸釣鉤含有適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)或官能團(tuán),以與核苷酸線共價(jià)偶聯(lián)。反應(yīng)性基團(tuán)或官能團(tuán)再次地可以是但不限于醛、胺、環(huán)氧化物、丙烯酸酯、硫氰酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺…位于核苷酸序列末端(最后一個(gè)堿基)或接近末端的末端工具距末端堿基小于50個(gè)堿基,且優(yōu)選小于10個(gè)堿基。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,核苷酸線(1)可通過(guò)結(jié)合到接頭上而固定到陣列支持物上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,將鏈霉抗生物素蛋白固定到支持物上,并使生物素化的核苷酸線與包被的支持物溫育,從而通過(guò)生物素和鏈霉抗生物素蛋白之間的識(shí)別發(fā)生線的結(jié)合。另一種可能性包括使用合適的抗體-抗原或受體-配體對(duì),以實(shí)現(xiàn)核苷酸線到支持物的有效結(jié)合。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員掌握不同的備選方案。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中,核苷酸線(1)含有末端核糖,其隨之通過(guò)高碘酸鹽處理而被氧化,這導(dǎo)致形成醛基。這些醛基可用于氨化核苷酸釣鉤(2)的結(jié)合,兩者的偶聯(lián)形成亞胺鍵。該亞胺隨之被還原,產(chǎn)生共價(jià)胺的穩(wěn)定連接。末端核糖也指位于鄰近線未結(jié)合末端的核糖,這意味著距離末端堿基小于50個(gè)堿基,且優(yōu)選小于10個(gè)堿基。
在另一實(shí)施方案中,可利用介由亞磷酰胺法的固相合成將核苷酸釣鉤(2)共價(jià)結(jié)合到核苷酸線(1)上。在一個(gè)實(shí)例中,核苷酸線在固體支持物表面上原位合成。核苷酸線的最后一個(gè)核苷酸在核糖上攜帶游離5′-OH,其能與存在于核苷酸釣鉤最后一個(gè)核苷3′位的亞磷酰胺基團(tuán)共價(jià)反應(yīng)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,核苷酸釣鉤(2)以每cm2固體支持物表面超過(guò)10fmole且優(yōu)選100fmole的密度存在。
在本發(fā)明特別的實(shí)施方案中,微陣列上用于檢測(cè)的每一個(gè)特定位置都覆蓋有一類(lèi)特定的核苷酸釣鉤。一類(lèi)釣鉤優(yōu)選僅由一種分子組成。不過(guò),實(shí)際上多核苷酸的合成是由一個(gè)核苷酸跟著一個(gè)核苷酸進(jìn)行的連續(xù)過(guò)程。既然每一個(gè)連續(xù)反應(yīng)都沒(méi)有100%的產(chǎn)率,將有產(chǎn)生異質(zhì)混合物的次級(jí)產(chǎn)物的累積。只要次級(jí)產(chǎn)物的污染水平不高到以至于它擾亂了相應(yīng)靶序列或分子的特異性結(jié)合和識(shí)別或鑒定,終產(chǎn)物中此類(lèi)次級(jí)產(chǎn)物的存在對(duì)于本發(fā)明的應(yīng)用是無(wú)害的。
本發(fā)明的一方面涉及固體(不溶)支持物,其在所述固體表面(5)給定位置(6)上含有固定(在核苷酸線末端)的對(duì)給定靶多核苷酸或核苷酸序列(4)特異的核苷酸釣鉤(2),所述核苷酸釣鉤(2)在其共價(jià)連接到長(zhǎng)至少20個(gè)核苷酸的多核苷酸線(1)之后得以固定,從而形成靶-特異性的多核苷酸組(3),所述陣列允許對(duì)很可能存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液中的多種、優(yōu)選至少4種不同靶多核苷酸或核苷酸序列(4)進(jìn)行特異性檢測(cè)、鑒定和/或定量。
本發(fā)明另一方面涉及固體(不溶)支持物,其表面(5)(有限的部分)覆蓋有長(zhǎng)至少20個(gè)核苷酸的核苷酸線(1),并在該表面(5)給定的位置(6)上含有對(duì)給定的待檢測(cè)靶多核苷酸或核苷酸序列特異的核苷酸釣鉤(2),所述核苷酸釣鉤(2)與所述核苷酸線(1)共價(jià)連接,從而形成靶-特異性多核苷酸組(3),所述陣列允許對(duì)可能存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液中的多種、優(yōu)選至少4種不同靶多核苷酸或核苷酸序列(4)進(jìn)行特異性檢測(cè)、鑒定和/或定量。
本發(fā)明特定的實(shí)施方案涉及固體支持物,在其表面(5)第一部分(7)包括在空間上隔開(kāi)的用以檢測(cè)第一組靶多核苷酸序列(4)的至少3個(gè)固定的多核苷酸組(6);且在該固體支持物表面(5)第二部分(8)包括不能與所述第一組靶分子結(jié)合、但能夠在空間上隔開(kāi)的位置上固定、結(jié)合或俘獲用以檢測(cè)第二組靶多核苷酸序列(4)的靶特異性核苷酸釣鉤(2)的核苷酸線(1)(見(jiàn)圖3)。優(yōu)選地,第二組包括至少2種不同的俘獲分子,優(yōu)選至少4種不同的俘獲分子。
本發(fā)明另一個(gè)特別的實(shí)施方案涉及固體支持物,在其表面第一部分(7)包括第一組至少3個(gè)固定的標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸序列,它們固定在不被核苷酸線(1)所覆蓋的特定表面位置(9)上,且在空間上隔開(kāi),用以檢測(cè)第一組靶多核苷酸序列(4),且在該固體支持物表面(5)第二部分(8)包括不能與所述第一組靶分子結(jié)合、但能夠與用以檢測(cè)第二組靶多核苷酸序列(4)的靶特異性核苷酸釣鉤(2)形成共價(jià)連接的核苷酸線(1)(見(jiàn)圖4)。
兩組靶分子可能都存在于同一樣品或測(cè)試溶液之中。優(yōu)選兩組都以相同的效率結(jié)合、俘獲和/或檢測(cè)。如果需要,所述第一和第二組的檢測(cè)效率被校正以恰當(dāng)?shù)囟看嬖谟跇悠坊驕y(cè)試溶液之中的靶分子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,第一組多核苷酸組獨(dú)立于第二組的制備和固定而先行制備。在特別的實(shí)施方案中,第一組僅僅存在于陣列支持物中不含線或激活的線(1)的位置上。第二組多核苷酸組是通過(guò)將靶-特異性釣鉤(2)固定到激活的核苷酸線(1)上獲得的。
最優(yōu)選地,用于將來(lái)自第二組的多核苷酸組連接到支持物上的試劑并不導(dǎo)致所述第一組多核苷酸組的完全脫離和/或失活。優(yōu)選地,所述脫離和/或失活保持盡可能地低。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中,第一組組為長(zhǎng)多核苷酸,而第二組組由根據(jù)本發(fā)明的線(1)和釣鉤(2)組成,釣鉤(2)優(yōu)選為小或短的靶-特異性多核苷酸或寡核苷酸。優(yōu)選地,多核苷酸組(3)介由存在于固體支持物表面第二部分上的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)或官能團(tuán)與支持物或陣列共價(jià)結(jié)合,該表面優(yōu)選為支持物上界定的表面。所述化學(xué)官能團(tuán)或基團(tuán)可通過(guò)化學(xué)處理激活。
本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測(cè)、鑒定和/或定量可能存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中的(微)生物或其組分的試劑盒,所述試劑盒包括如上文所述的支持物或微陣列。
當(dāng)靶分子俘獲到所述支持物或微陣列上時(shí),試劑盒可進(jìn)一步包括用以檢測(cè)其的必要溶液和試劑。
試劑盒可進(jìn)一步包括用于實(shí)施本發(fā)明的方法以獲獲得本發(fā)明的微陣列的工具和介質(zhì),攜帶含連接于核苷酸線的靶-特異性核苷酸釣鉤的靶-特異性多核苷酸組,所述俘獲多核苷酸組優(yōu)選以陣列的形式沉積在所述固體支持物的表面上,密度優(yōu)選為至少4個(gè)單鏈俘獲核苷酸序列/cm2固體支持物表面。
本發(fā)明支持物或陣列高度適合于檢測(cè)不同的靶序列,即可能存在于測(cè)試溶液或樣品之中的至少一種、優(yōu)選至少4種靶核苷酸序列。屬于第一和第二組的靶序列可存在于同一生物學(xué)樣品之中,并由根據(jù)本發(fā)明的陣列同時(shí)檢測(cè)。
本發(fā)明也涵蓋這樣的固體支持物,至少在其部分表面均一地固定有核苷酸線,其具有至少20個(gè)核苷酸的序列,通過(guò)第一末端固定至所述支持物的表面,且另一末端具有與核苷酸釣鉤共價(jià)反應(yīng)或能夠被激活以與之反應(yīng)的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。在特別的實(shí)施方案中,本發(fā)明的陣列或支持物可用于制備半定制的陣列。半定制的陣列是攜帶固定數(shù)目的根據(jù)本發(fā)明的給定多核苷酸組或可在支持物的其它部分補(bǔ)充有現(xiàn)有技術(shù)中具有對(duì)所選的其它靶特異的序列的標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸序列的陣列。在陣列第一部分具有標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸序列或組且在第二部分存有備用于制備所選第二組多核苷酸組的線的微陣列,則將作為其上可根據(jù)應(yīng)用需求點(diǎn)樣靶-特異性釣鉤的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品交付。本發(fā)明涉及此類(lèi)半定制的陣列。
本發(fā)明的方法尤其可用于這樣的微陣列的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),其支持物一部分具有針對(duì)給定數(shù)目的特定靶序列的標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸組,而在另一方面具有根據(jù)應(yīng)用以檢測(cè)不同靶序列的可變通部分,并且是非標(biāo)準(zhǔn)的。以這種方式,可根據(jù)用戶(hù)的需求將標(biāo)準(zhǔn)陣列轉(zhuǎn)化為無(wú)限數(shù)目的陣列。當(dāng)在陣列第一位置上使用長(zhǎng)多核苷酸集合、而在第二位置上使用容易合成的小寡核苷酸序列時(shí),此類(lèi)陣列尤為有用。比較兩群多核苷酸組的結(jié)合效率允許比較存在于測(cè)試溶液或樣品之中的每一個(gè)靶分子的最初含量。優(yōu)選地,象測(cè)試溶液或樣品之中添加適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)以允許校正兩組多核苷酸組的結(jié)合效率。
本發(fā)明的另一方面包括陣列支持物或基質(zhì),其上一部分或第一部分結(jié)合有俘獲分子用以檢測(cè)給定的靶分子,而另一部分結(jié)合有線,很可能被激活以結(jié)合釣鉤,適應(yīng)于檢測(cè)其它靶分子。
本發(fā)明的陣列高度適合于檢測(cè)和/或定量細(xì)胞表達(dá)的基因,很可能是在至少部分地將靶基因序列復(fù)制為cDNA鏈、并將cDNA雜交到根據(jù)本發(fā)明提供的特異性俘獲分子之上以后。本發(fā)明的方法尤其適用于檢測(cè)需要及其靈敏的方法的彼此同源的cDNA序列。介由允許此類(lèi)辨別同時(shí)具有良好的結(jié)合效率的小或短特異性序列的使用,可辨別同源或幾乎相同序列。本發(fā)明的方法允許區(qū)別僅有一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸差異、以及因而包含一個(gè)或數(shù)個(gè)SNP(單核苷酸多態(tài)性)的靶序列。
有利地,本發(fā)明的方法和陣列可用于鑒定和/或定量由生物體或其部分直接獲得的-即未經(jīng)任何在先的擴(kuò)增步驟-或者在擴(kuò)增其部分基因組DNA或RNA之后獲得的DNA序列、單或雙鏈序列。靶序列的擴(kuò)增可介由本領(lǐng)域公知的任何方法實(shí)現(xiàn),包括但不限于PCR、LCR、NASBA、滾環(huán)或允許產(chǎn)生給定序列相當(dāng)可信的拷貝的任何其它方法。
微陣列上俘獲的靶序列的檢測(cè)可介由本領(lǐng)域公知的任何物理或化學(xué)檢測(cè)法進(jìn)行,包括但不限于利用熒光、比色、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、電子、表面胞質(zhì)團(tuán)共振、電磁信號(hào)… 用于構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的微陣列的固體支持物或基質(zhì)優(yōu)選從由玻璃、電子裝置、硅支持物、硅石、金屬或其混合物組成的組中選擇,制備成選自載片、盤(pán)、凝膠層和/或珠子的形式。珠子被視為陣列,只要其具有允許其彼此區(qū)分的特征,這樣珠子的鑒定與給定釣鉤序列從而是靶序列的鑒定相關(guān)。上述實(shí)例并非是詳盡的。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中,俘獲的靶序列的檢測(cè)、鑒定和/或定量通過(guò)使用至少包括檢測(cè)和/或定量裝置以檢測(cè)和/或定量在俘獲來(lái)自(微)生物的靶序列的陣列位置上形成的信號(hào)的儀器而易化,可是有關(guān)記錄在所述固體支持物表面上的信息的閱讀裝置,用以識(shí)別攜帶結(jié)合其相應(yīng)多核苷酸組上的靶序列的不連續(xù)區(qū)域以及它們的位置的計(jì)算機(jī)程序,可是所述位置上存在的信號(hào)的定量程序以及用于將這些位置上信號(hào)的存在與所述(微)生物或組分的診斷和/或定量關(guān)聯(lián)起來(lái)的程序。本發(fā)明延及適應(yīng)于這些目的且能夠閱讀本發(fā)明的微陣列和闡釋其結(jié)果的儀器。
實(shí)施例實(shí)施例1支持物上的核苷酸線固定玻璃支持物的官能化 玻片根據(jù)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP1184349中描述的方法進(jìn)行醛存在的官能化。
支持物上核苷酸線的固定 醛支持物上氨化線的固定如下進(jìn)行。通過(guò)化學(xué)合成(Eurogentec,Liege,Belgium)合成在5′端擁有氨基而在3 ′端擁有核糖核苷酸的DNA核苷酸線。在milliQ純水中將其稀釋至1mg/l。每一個(gè)生物芯片都在含DNA溶液的銀綠色管中于室溫下攪拌(+/-200rpm)溫育60分鐘。在室溫下洗滌玻片0.2%SDS水溶液2分鐘3次、純水2分鐘2次、氫硼化鈉溶液(2.5mg/ml NaBH4的PBS/無(wú)水乙醇(比為75/25)溶液)5分鐘1次以及純水2分鐘1次。然后玻片于95℃用純水洗滌3分鐘。玻片室溫下干燥,之后4℃貯存。
實(shí)施例2支持物特定位置上的核苷酸釣鉤固定支持物上官能化線的激活 DNA核苷酸線上存在的核糖核苷酸以如下方式氧化為醛基。將玻片與新鮮制備的含0.1M pH 5.2醋酸鈉溶液(CH3COONa.3H2O,Merck,ref.-1.06267)和25μl0.45M高碘酸鈉溶液(NaIO4,Sigma,ref.-S1878)的溶液溫育。溶液在支持物上于室溫下暗中溫育2小時(shí)。玻片以1ml醋酸緩沖溶液洗滌,然后以氧化形式于4℃保持備用。
釣鉤固定 5′端氨化的核苷酸釣鉤通過(guò)Eurogentec(Liege,Belgium)化學(xué)合成。將其在點(diǎn)樣液中稀釋(EAT,Namur,Belgium)。DNA溶液由點(diǎn)陣儀(arrayer)使用平針在支持物上點(diǎn)樣。玻片于室溫下干燥1小時(shí)。玻片用洗滌緩沖液洗滌2分鐘2次,并用水洗滌3次。玻片于4℃保持在evergreen管中備用。
設(shè)計(jì)了3種大鼠基因所特異的氨化核苷酸,并具有如下序列SEQIDN°1(釣鉤1)大鼠Fas抗原配體(登錄號(hào)U03470)5′-ataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcagaggcaaagagaaggaact-3′SEQIDN°2(釣鉤2)大鼠解偶聯(lián)蛋白2(登錄號(hào)AB010743)5′-atgccattgtcaactgtactgagctggtgacctatgacctcatcaaagat-3′SEQIDN°(釣鉤3)大鼠核糖體蛋白L19(登錄號(hào)J02650)5′-cgtcctccgctgtggtaaaaagaaggtgtggttggaccccaatgaaacca-3′實(shí)施例3通過(guò)比色法檢測(cè)生物芯片上的cDNA 含俘獲分子的支持物表面圍有雜交框,這界定了與含靶序列的溶液接觸的支持物表面。將陣列與生物素化來(lái)自大鼠肝的cDNA如Delongueville等2002(Biochem.Pharmacol.64137-149)所解釋的那樣溫育。靶DNA雜交后,洗滌陣列并在含有在封閉緩沖液(EppendorfHamburg,Germany)中以1/100稀釋的偶聯(lián)于20nm金顆粒的15ml抗-生物素抗體(British Biocell International,ref.BL-GAB20)的Evergreen管中于室溫下溫育45分鐘。然后生物芯片用B1緩沖液(Eppendorf Hamburg,Germany)洗滌2分鐘5次。每一個(gè)生物芯片都在新的Eppendorf管中在Silverquant溶液(Eppendorf,Hamburg,Germany)中于室溫下暗中溫育10分鐘。通過(guò)用700μlmilliQ水洗滌2次終止暴露。然后生物芯片在比色Scanarray(Eppendorf,Hamburg,Germany)中掃描和定量。在數(shù)字化圖像以后,使用軟件程序(Eppendorf,Hamburg,Germany)以界定點(diǎn)樣點(diǎn)的表面、整合各點(diǎn)信號(hào)、扣除各點(diǎn)周?chē)木植勘尘?、鑒定點(diǎn)樣點(diǎn)的分布并將此分布與靶標(biāo)的密度關(guān)聯(lián)起來(lái)。定量是通過(guò)將由摻入(spiked)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)獲得的信號(hào)與不同靶核苷酸點(diǎn)的信號(hào)進(jìn)行比較獲得的。
實(shí)施例4通過(guò)熒光檢測(cè)生物芯片上的cDNA 實(shí)驗(yàn)基本上如實(shí)施例3中那樣進(jìn)行,但是在與生物素化的靶cDNA雜交后,陣列與在封閉緩沖液中以1/1000稀釋的抗-花菁抗體(Jackson ImmunoResearch,Cy3ref.-200.162.096,Cy5ref.-200.172.096)溫育。然后生物芯片用B1緩沖液洗滌2分鐘4次。生物芯片于室溫下干燥,并由GMS418 ScanArray掃描(總體掃描)。在數(shù)字化圖像以后,利用imagene程序(Biodiscovery,Marina Del Rey,USA)以界定點(diǎn)樣點(diǎn)的表面、整合各點(diǎn)信號(hào)、扣除各點(diǎn)周?chē)木植勘尘?、鑒定點(diǎn)樣點(diǎn)的分布并將此分布與靶序列的密度關(guān)聯(lián)起來(lái)。樣品中存在的靶序列的定量基本上如Delongueville等2002(Biochem.Pharmacol.64137-149)出版物中所述獲得。
序列表<110>Eppendorf Array Technologies<120>用于高靈敏度地檢測(cè)多種多核苷酸序列的微陣列支持物的制備方法和用途<130>BP.EAT.003A/EP<140>EP04447111.8<141>2004-05-04<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>50<212>DNA<213>大鼠Fas抗原配體(登錄號(hào)U03470)<400>1ataaagtttt gggctgctgt gtggcaatgc agaggcaaag agaaggaact 50<210>2<211>50<212>DNA<213>大鼠解偶聯(lián)蛋白2(登錄號(hào)AB010743)<400>2atgccattgt caactgtact gagctggtga cctatgacct catcaaagat 50<210>3<211>50<212>DNA<213>大鼠核糖體蛋白L19(登錄號(hào)J02650)<400>3cgtcctccgc tgtggtaaaa agaaggtgtg gttggacccc aatgaaacca 50
權(quán)利要求
1.用于在固體支持物表面(5)構(gòu)建多核苷酸組(3)的微陣列的方法,微陣列用于檢測(cè)和/或定量可能存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中的至少四種不同的靶多核苷酸或核苷酸序列(4),所述方法包括步驟-將核苷酸線序列(1)固定于固體支持物表面(5),所述核苷酸線(1)長(zhǎng)至少20個(gè)核苷酸,并且具有隨機(jī)的核苷酸序列;-將核苷酸釣鉤(2)置于所述固體支持物表面(5)的至少4個(gè)特定位置(6)上,所述釣鉤具有對(duì)于所述待檢測(cè)和/或定量的至少四種不同靶多核苷酸序列(4)之一特異的序列;和-使所述核苷酸釣鉤(2)與核苷酸線序列(1)在所述特定表面位置(6)上共價(jià)連接,以便形成對(duì)于所述靶多核苷酸序列(4)的結(jié)合特異性的多核苷酸組(3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中用于構(gòu)建微陣列的固體支持物表面(5)均一地覆蓋有核苷酸線(1)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2的方法,其中核苷酸線(1)序列通過(guò)其末端(5′,3′)之一共價(jià)固定至固體支持物表面,并通過(guò)另一個(gè)末端共價(jià)固定至核苷酸釣鉤(2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的方法,其中固體表面每cm2包含至少四個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)的多核苷酸組(3)的微陣列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的方法,其中核苷酸線(1)的序列包含少于15個(gè)堿基,優(yōu)選少于10個(gè),并且還優(yōu)選少于5個(gè)與待檢測(cè)靶多核苷酸序列(4)互補(bǔ)的連續(xù)堿基。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中核苷酸線(1)序列為多隨機(jī)序列。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中所有核苷酸線(1)由相同的隨機(jī)序列構(gòu)成。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中核苷酸線(1)序列與少于1%、優(yōu)選少于0.1%并且甚至優(yōu)選少于0.01%的任一待檢測(cè)靶多核苷酸序列(4)雜交。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中核苷酸釣鉤(2)具有約10個(gè)-約120個(gè)核苷酸組成的序列。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中在與核苷酸線(1)相連之后,核苷酸釣鉤(2)實(shí)現(xiàn)了與用至少150個(gè)核苷酸的多核苷酸序列所獲得的雜交效率等同或比其更高的雜交效率。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中在與核苷酸線(1)相連之后,核苷酸釣鉤(2)實(shí)現(xiàn)了與用至少250個(gè)核苷酸的多核苷酸序列所獲得的雜交效率等同或比其更高的雜交效率。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中核苷酸釣鉤(2)是化學(xué)合成的寡核苷酸。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中核苷酸線(1)在固體支持物表面(5)原位合成。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中偶聯(lián)于核苷酸釣鉤(2)的核苷酸線(1)是對(duì)不同靶多核苷酸序列(4)具有不同結(jié)合親和力的序列并且連接于不同固體支持物,每一個(gè)這些固體支持物都以特定的化學(xué)或物理性質(zhì)為特征。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中固體支持物包含具有不同化學(xué)或物理性質(zhì)的不同珠子。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中靶多核苷酸序列(4)是擴(kuò)增或復(fù)制的核苷酸序列。
17.固體支持物,包含通過(guò)其末端(3′或5′)之一均一地固定在該固體支持物至少一個(gè)表面(5)上的核苷酸線(1),所述核苷酸線長(zhǎng)至少20個(gè)核苷酸,并具有隨機(jī)的核苷酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的固體支持物,其中所有的核苷酸線(1)由相同的隨機(jī)序列構(gòu)成。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的固體支持物,其中核苷酸線(1)序列為多隨機(jī)序列。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求17至19中任何一項(xiàng)的固體支持物,其中核苷酸線序列(1)中不與固體支持物表面(5)相結(jié)合的末端(5′或3′)包含能夠與另一核苷酸序列(2)末端建立共價(jià)連接的反應(yīng)性基團(tuán)或官能團(tuán)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的固體支持物,其中存在于核苷酸線序列末端的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)選自醛、環(huán)氧化物和丙烯酸酯基團(tuán)。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至21的固體支持物,其中核苷酸線序列在(或鄰近)其非結(jié)合末端處包含至少一個(gè)核苷酸-核糖。
23.根據(jù)權(quán)利要求17至22的固體支持物,其中在特定位置結(jié)合于固體支持物的核苷酸線(1)的密度超過(guò)10fmoles、優(yōu)選100fmoles摩每cm2固體支持物表面。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求17至23中任何一項(xiàng)的固體支持物,其中在固體支持物表面(5)上特定位置(6)結(jié)合的核苷酸線(1)序列提供了與核苷酸釣鉤(2)的共價(jià)連接,以便在固體支持物表面(5)所述特定位置(6)上形成多核苷酸組(3),所述核苷酸釣鉤(2)具有對(duì)待檢測(cè)和/或定量的一種靶多核苷酸序列(4)特異的序列,并且其中核苷酸線(1)末端和核苷酸釣鉤(2)末端之間的共價(jià)連接并非磷酸二酯連接。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的固體支持物,在其表面(5)第一部分(7)包括第一組至少3個(gè)固定的多核苷酸組(3),其在空間上被隔開(kāi)以檢測(cè)第一組靶多核苷酸序列(4),而在固體支持物表面(5)的第二部分(8)包括核苷酸線(1),其不能與所述第一組的靶多核苷酸序列結(jié)合,但能夠與對(duì)于檢測(cè)第二組靶多核苷酸序列(4)特異的靶特異性核苷酸釣鉤形成共價(jià)連接。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的固體支持物,在其表面第一部分(7)包括第一組至少3個(gè)固定的標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸序列,其被固定在未被核苷酸線(1)所覆蓋的特定表面位置(9)上,并且在空間上被隔開(kāi)以檢測(cè)第一組靶多核苷酸序列(4),而在固體支持物表面(5)的第二部分(8)包括核苷酸線(1),其不能與所述第一組靶多核苷酸序列結(jié)合,但能夠與對(duì)于檢測(cè)第二組靶多核苷酸序列(4)特異的靶特異性核苷酸釣鉤形成共價(jià)連接。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求17至26中任何一項(xiàng)的固體支持物,其選自玻璃、電子裝置、硅支持物、塑料支持物、硅石支持物、金屬支持物或其混合物。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求17至27中任何一項(xiàng)的固體支持物,其中所述固體支持物為選自載片、盤(pán)、凝膠層和微珠的形式。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求24至28中任何一項(xiàng)的固體支持物,其中在特定位置結(jié)合于固體支持物的多核苷酸組(3)的密度超過(guò)10fmoles、優(yōu)選100fmoles每cm2固體支持物表面。
30.用于檢測(cè)、鑒定和/或定量可能存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中的(微)生物體或其核苷酸組分的試劑盒,所述試劑盒包括根據(jù)前述權(quán)利要求17至29中任何一項(xiàng)的固體支持物,以及用于檢測(cè)由所述微生物體或核苷酸組分獲得的靶多核苷酸序列(4)的工具和介質(zhì)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的試劑盒,其進(jìn)一步包括對(duì)于待檢測(cè)和/或定量的一種或多種不同靶多核苷酸序列(4)特異的核苷酸釣鉤序列(2),以及可能的用以允許在核苷酸釣鉤(2)序列末端和核苷酸線(1)序列末端之間形成共價(jià)連接的試劑。
32.用于檢測(cè)、鑒定和/或定量可能存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中的(微)生物體或其核苷酸組分的裝置,其包括根據(jù)前述權(quán)利要求17至29中任何一項(xiàng)的固體支持物,可能存在于根據(jù)權(quán)利要求30或31的試劑盒之中,所述裝置進(jìn)一步包括能夠檢測(cè)和/或定量在靶核苷酸序列(4)與固體支持物表面(5)的多核苷酸組(3)相結(jié)合的位置上形成的信號(hào)的檢測(cè)和/或定量裝置,可能是用于讀取固體支持物表面(5)上記錄的信息的閱讀裝置,以及用于檢測(cè)攜帶與其對(duì)應(yīng)的多核苷酸組(3)結(jié)合的靶多核苷酸序列(4)的分離區(qū)域及其位置的計(jì)算機(jī)程序,以將這些位置上檢測(cè)信號(hào)的存在與(微)生物體或其核苷酸組分的診斷和/或定量關(guān)聯(lián)起來(lái)。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求30至32中任何一項(xiàng)的試劑盒或裝置用于診斷和基因表達(dá)分析的用途。
34.權(quán)利要求33的用途,用于鑒定、檢測(cè)和/或定量多種不同多核苷酸靶標(biāo),這些多核苷酸很可能通過(guò)復(fù)制步驟的遺傳擴(kuò)增獲得,并由屬于不同遺傳分類(lèi)組別(例如綱、科、屬、種或個(gè)體)的遺傳序列獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在固體支持物表面(5)構(gòu)建多核苷酸組(3)的微陣列的方法,以用于檢測(cè)和/或定量可能存在于生物學(xué)樣品或測(cè)試溶液之中的至少四種不同的靶多核苷酸或核苷酸序列(4),所述方法包括步驟將核苷酸線序列(1)固定于固體支持物表面(5),所述核苷酸線(1)長(zhǎng)至少20個(gè)核苷酸,并且具有隨機(jī)的核苷酸序列;將核苷酸釣鉤(2)置于包含所述固定的核苷酸線序列(1)的固體支持物表面(5)的至少4個(gè)特定位置(6)上,所述釣鉤具有對(duì)于所述待檢測(cè)和/或定量的至少四種不同靶多核苷酸序列(4)之一特異的序列;和使所述苷酸釣鉤(2)與核苷酸線序列(1)在所述特定表面位置(6)上共價(jià)連接,以便形成對(duì)于所述靶多核苷酸序列的結(jié)合特異的多核苷酸組(3)。
文檔編號(hào)G01N37/00GK1702177SQ20051006841
公開(kāi)日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月4日
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