專利名稱：三功能納米球的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及三功能或多功能納米顆粒(nanoparticle)，通過將生物材料結(jié)合到熒光-磁性雙功能納米顆粒(BFN)上而制成。
相關(guān)技術(shù)描述熒光標(biāo)記和磁選是兩種重要的生物技術(shù)。同時具有這兩種功能的材料在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域有眾多應(yīng)用。
對于迅速增多的醫(yī)藥應(yīng)用以及生物醫(yī)學(xué)研究而言，納米球(nanosphere)正在成為一種可選擇的材料。在相關(guān)技術(shù)中，已經(jīng)開發(fā)了若干使用量子點(QDs)和磁性納米顆粒、將這兩種顆粒一起封裝在聚合物微膠囊中的方法。
但是，這些相關(guān)技術(shù)主要依靠核-殼型技術(shù)。一般使用磁性材料如磁鐵或熒光顆粒如QD作為核。這樣的核-殼結(jié)構(gòu)存在弊端，特別是對于熒光應(yīng)用，因為殼傾向于吸收激發(fā)光和發(fā)射光中的一種或兩種，從而使熒光信號變暗。在相關(guān)技術(shù)的一些實施方式中，熒光分子被加入到殼材料中。在這些情況下，熒光信號會因從激發(fā)熒光團向周圍固態(tài)基質(zhì)的能量轉(zhuǎn)移而變暗。
附圖簡述為了便于進一步理解發(fā)明，而被加入的附圖構(gòu)成了本申請的一部分，它們描述了本發(fā)明的實施方案，并和說明書一起用于解釋本發(fā)明的主旨。
附圖中

圖1A-B是a＝0.835nm的面心(face-centered)立方晶胞(cubic cell)的X射線衍射(XRD)圖譜以及納米-γ-Fe2O3的透射電鏡(TEM)照片。
圖2是同時嵌入了CdSe/ZnS QDs和納-γ-Fe2O3的納米球的TEM照片。
圖3A-3D是嵌入到經(jīng)過肼處理的苯乙烯/丙烯酰胺共聚物(H2N-St-AA)中的CdSe/ZnS QDs和γ- Fe2O3納米顆粒的HRTEM高分辨率透射電鏡(HRTEM)照片。
圖4A-B是雙功能納米顆粒(BFNs)的明視場和熒光顯微照片。
圖5是三功能納米顆粒(TFN)的制備及其捕獲癌細(xì)胞的示意圖。
圖6A-I是三功能納米顆粒(TFNs)的熒光顯微照片，其中葉酸用作生物材料，且將TFNs結(jié)合到具有葉酸受體的癌細(xì)胞。
圖7是制備三功能納米顆粒的示意圖。
圖8A-8D是結(jié)合了兔抗人IgG-FITC的三功能抗兔IgG-納米顆粒的顯微照片。
圖9A-9D是結(jié)合了鏈霉親和素-藻紅素的三功能生物素-納米顆粒的顯微照片。
發(fā)明描述迫切希望開發(fā)出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高于現(xiàn)有技術(shù)、且與細(xì)胞、蛋白質(zhì)或其它顆粒呈現(xiàn)特異結(jié)合的雙功能納米顆粒。這些特異的結(jié)合可以通過將能提供特異識別受體等的生物分子偶聯(lián)而實現(xiàn)。此外，當(dāng)希望更特異用途、如捕獲癌細(xì)胞時，生物材料與納米顆粒的偶聯(lián)變得更為重要。
本發(fā)明涉及制備一種多功能納米顆?；颉凹{米球”，它能基本上消除一種或多種由于相關(guān)技術(shù)的限制和弊端而產(chǎn)生的問題。本發(fā)明的任何一個特定實施方案都不可能解決上述相關(guān)技術(shù)中存在的所有問題。
本發(fā)明一方面涉及一種納米顆粒，包括中孔聚合物、附著在該中孔聚合物上的磁性材料、附著在該中孔聚合物上的熒光染料、以及一種或多種與該中孔聚合物偶聯(lián)的生物材料。該納米顆?？梢允乔蛐?，也可以聚集成團。在某些情況下本發(fā)明所述納米顆?？梢孕纬删酆象w，但是懸浮在液體中時一般是分散的。
當(dāng)本發(fā)明生物功能化的納米顆粒(“三功能”或“多功能”納米顆粒)被單一生物材料標(biāo)記時，該納米顆?？梢蕴禺惤Y(jié)合細(xì)胞、或蛋白質(zhì)或生物材料特異結(jié)合的任何其它部分。例如，該生物材料可以是特異結(jié)合細(xì)胞表面受體的小分子配體。
一方面，本發(fā)明提供一種以上結(jié)合雙功能納米顆粒的活性生物材料。本發(fā)明所述的兩種生物劑(bioagent)偶聯(lián)到一個雙功能納米顆粒上的多功能納米顆粒的潛在用途包括利用一種生物劑靶向大分子或細(xì)胞，而利用第二種生物劑改變該大分子或細(xì)胞的功能或特性，例如，利用蛋白質(zhì)靶向細(xì)胞，利用毒素或細(xì)胞死亡蛋白來殺死被靶向的細(xì)胞，或者利用一種化學(xué)物質(zhì)或蛋白質(zhì)來靶向復(fù)合體中的蛋白質(zhì)，而另一種化學(xué)物質(zhì)或蛋白質(zhì)用來改變該復(fù)合體中不同組份的功能。
在一個實施方案中，為將生物材料偶聯(lián)到該納米顆粒上，該中孔聚合物經(jīng)過肼處理，且該生物材料經(jīng)過氧化劑處理。
該生物材料可以是配體，如肽或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的實例可以包括肽，該生物材料優(yōu)選的蛋白質(zhì)的實例是糖蛋白。該生物材料也可以是小分子。該生物材料可以是抗體或特異于所需細(xì)胞受體的配體。該生物材料也可以是碳水化合物。從諸如IgG、抗生物素蛋白、生物素或鏈霉親和素的材料中選擇生物材料，允許本發(fā)明所述TFNs與多種能綴合這些分子的結(jié)合配偶體的物質(zhì)絡(luò)合(complexation)。
為了將該生物材料偶聯(lián)到該納米顆粒上，該中孔聚合物經(jīng)過肼處理，且該生物材料經(jīng)過氧化劑處理。該生物材料可以是配體如肽或糖蛋白。該生物材料也可以是小分子。該生物材料可以是抗體或特異于所需細(xì)胞受體的配體。該生物材料也可以是碳水化合物配體。一般來說，該生物材料可以選自但不限于諸如IgG、抗生物素蛋白、生物素或鏈霉親和素的材料。
該磁性材料可以是Fe2O3。
該熒光染料可以是CdSe或CdSe/ZnS量子點。
該聚合物可以是經(jīng)過肼處理的苯乙烯/丙烯酰胺(H2N-St-Aam)。
本發(fā)明中，該生物材料可以以下述結(jié)構(gòu)偶聯(lián)到納米顆粒上 其中X是該納米顆粒，Y是該生物材料。Y可以是配體、肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、抗體、抗生物素蛋白或鏈霉親和素。也就是說，上述鍵合適于可以被氧化生成醛基的糖蛋白，包括抗體、抗生物素蛋白和鏈霉親和素，也適用于其它包含醛基的生物材料。如果該生物材料Y是生物素，那么該納米顆粒可以具有下述結(jié)構(gòu) 其中X是該納米顆粒，LC是-C＝O(CH2)3-NH-。在本發(fā)明中，Sulfo-NHS-LC-LC-生物素(磺基琥珀酰亞胺基-6’-(生物素酰胺基)-6-己酰氨基己酸酯)具有下述結(jié)構(gòu)
本發(fā)明的一方面涉及一種多功能納米顆粒，具有下述結(jié)構(gòu) 其中n≥1；x是由中孔聚合物，附著在該中孔聚合物上的磁性材料，附著在該中孔聚合物上的熒光染料形成的中孔納米顆粒，Y是蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的一方面涉及一種制備多功能納米顆粒的方法，包括提供中孔聚合物納米顆粒，該納米顆粒具有附著在該中孔聚合物上的磁性材料、附著在該中孔聚合物上的熒光染料；用肼處理該納米顆粒；氧化生物材料；并將氧化的生物材料偶聯(lián)到該納米顆粒上。該生物材料可以用偏過碘酸鈉氧化。也可以使用其它氧化劑，包括但不限于偏過碘酸鉀或任何其它偏過碘酸鹽。
任何蛋白質(zhì)都可偶聯(lián)到納米顆粒上。糖蛋白最容易偶聯(lián)，因為它們可以被氧化生成活性醛基。其它蛋白質(zhì)可以通過其-COOH基團而偶聯(lián)，但是效率較低。然而，本領(lǐng)域其它已知技術(shù)如二酰亞胺試劑也可以用于將無糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)到該納米顆粒上。
在優(yōu)選實施方案中，該生物材料可以是IgG、抗生物素蛋白、生物素或鏈霉親和素。該IgG、抗生物素蛋白、生物素或鏈霉親和素可以進一步綴合到其它分子上，這反過來可以作為所需受體的配體，或者作為功能分子如毒素。
本發(fā)明納米顆粒優(yōu)選不具有磁芯。相反，通過該聚合物納米顆粒與較小的磁性納米顆粒相結(jié)合使本發(fā)明所述納米顆粒具有磁性。
本發(fā)明的一部分涉及一種多功能納米顆粒，具有下述結(jié)構(gòu) 其中n≥1；X是由中孔聚合物，附著在該中孔聚合物上的磁性材料，附著在該中孔聚合物上的熒光染料形成的中孔納米顆粒；PEG是聚乙二醇；FA是葉酸。優(yōu)選n為3。
本發(fā)明納米顆粒也可以用例舉的葉酸和生物素之外的小分子配體來衍生。事實上，任何帶有反應(yīng)基如-COOH、-CHO、-NH2和-SH等的生物劑都可以偶聯(lián)到該表面上。這些帶有-COOH和-CHO的生物劑可以無需交聯(lián)劑而直接偶聯(lián)?？梢再徺I到已經(jīng)改性/活化的、可直接用于偶聯(lián)的生物素。
本發(fā)明還涉及標(biāo)記和收集細(xì)胞或被附在本發(fā)明TFNs上的配體所識別的部分的方法。例如，本發(fā)明提供一種分離細(xì)胞的方法，其中將具有所需受體的細(xì)胞導(dǎo)入多功能納米顆粒，其中Y是配體，能特異地結(jié)合所需的受體，從而通過多功能納米顆粒標(biāo)記出這些細(xì)胞。隨后，將表面上結(jié)合了多功能納米顆粒的細(xì)胞引入固定細(xì)胞的磁場，例如在實驗試管的底部或在多孔板的底部。隨后，可以清洗掉沒有被多功能納米顆粒標(biāo)記的細(xì)胞，隨后移去該磁場，并收集這些細(xì)胞。
上述方法可以擴展至利用該多功能納米顆粒的熒光功能、從樣品中分離具有不同種類受體的細(xì)胞。在該方法中，將具有多種所需受體的細(xì)胞樣品引入不同種類的多功能納米顆粒的混合物中，其中每種多功能納米顆粒具有不同的配體Y，它能特異地結(jié)合樣品中至少一個細(xì)胞上的所需表面受體，進一步地，其中每個配體Y與特定顏色的熒光染料相配對，以獲得與不同顏色的多功能納米顆粒相結(jié)合的細(xì)胞。標(biāo)記細(xì)胞的多功能納米顆粒的不同顏色會反映出這些細(xì)胞上的不同配體Y的不同受體。隨后將被標(biāo)記的細(xì)胞引入磁場以使其固定不動。隨后，清除未被標(biāo)記的細(xì)胞，收集標(biāo)記的細(xì)胞。隨后根據(jù)收集的細(xì)胞表面上多功能納米顆粒的顏色對這些細(xì)胞進行分選，例如通過熒光活化細(xì)胞分選。用這種方式，具有不同所需表面標(biāo)記的細(xì)胞可以被分離和收集或計算。
本發(fā)明的一部分涉及一種分離和/或檢測生物分子的方法，其包括將包含具有所需相互作用位點的生物分子的生物混合物與本發(fā)明上述多功能納米顆粒相接觸，其中Y由配體組成，它特異地結(jié)合所需受體或其它結(jié)合配偶體以獲得與多功能納米顆粒結(jié)合的生物分子；將這些與多功能納米顆粒結(jié)合的生物分子引入磁場，從而使這些生物分子和結(jié)合的分子固定不動；清除未與多功能納米顆粒結(jié)合的分子；將磁場從與多功能納米顆粒結(jié)合的生物分子移去；收集結(jié)合的生物分子。該方法可以進一步包括通過與多功能納米顆粒結(jié)合的生物分子的熒光，來純化所述結(jié)合的生物分子和結(jié)合的分子。進一步純化所述結(jié)合的生物分子的步驟在收集該結(jié)合生物分子步驟之前或之后進行，或者在該生物分子和結(jié)合的分子被固定后進行。此外，該生物分子可以是蛋白質(zhì)，但不限于蛋白質(zhì)。
現(xiàn)在將詳細(xì)介紹本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其實施例將在附圖中予以說明。附圖和優(yōu)選實施方案不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制；本發(fā)明的范圍僅由下述權(quán)利要求限定。
通過將熒光CdSe/ZnS QDs(量子點)和磁性納米-γ-Fe2O3同時嵌入經(jīng)過肼處理的苯乙烯/丙烯酰胺(H2N-St-AAm)共聚物納米球中，以制備雙功能納米顆粒(BFNs)。為了確保QDs和磁性納米顆粒都被嵌入，所述顆粒必須很小、并且在單一溶液如5∶95(V/V)氯仿∶丁醇中能良好地分散。任何極性和表面張力達到適當(dāng)均衡的溶劑都可以作為合適的溶劑。
納米-γ-Fe2O3是通過S.Sun等人在J.Am.Chem.Soc.(2002)vol.124，pp.8204-8205中公開的高溫方法制備的。
單分散性CdSe QDs是如L.H.Qu等人在J.Am.Chem.Soe.(2002)vol.124，pp.2049-2055中所述而獲得的。
苯乙烯/丙烯酰胺納米顆粒是如X.Zhao等人在J.Med.Coll.PLA(1997)vol.12，pp.62-65中所述而獲得的。微球體的直徑為3±0.05μm，表面上羧基的含量為190.5μmol/g(干燥固體)。
圖1A所示為氧化鐵的X射線衍射(XRD)分析，它表明該產(chǎn)物的晶體結(jié)構(gòu)為立方γ-Fe2O3而非Fe3O4。得到該產(chǎn)品是因為合成是在空氣中、沒有可能會還原鐵陽離子的1，2-hexadecanediol存在的情況下進行的。透射電鏡(TEM)結(jié)果示于圖1B，表明氧化鐵顆粒的平均粒度小于20nm，粒度分布狹窄，而且分散良好。
St-AAm共聚物納米顆粒是通過X.Zhao等人在J.Med.Coll.PLA(1997)vol.12，pp.62-65中所述的無乳化劑聚合的改良方法、由苯乙烯和丙烯酰胺合成的。通過調(diào)整原料的濃度和反應(yīng)起始物的劑量，球體的粒徑可以在50-500nm之間變化。掃描電鏡(SEM)圖像表明球體的表面為中孔的，從而為納米顆粒提供了進入通道。由于聚合無乳化劑，因此表面比較清潔、便于與其它分子綴合。
本發(fā)明不受任何理論的束縛，發(fā)明人認(rèn)為由于該納米顆粒是在水溶液中合成的，因而聚合物的親水基團傾向位于朝向納米顆粒的外表面，而疏水基團則存在于其內(nèi)部，導(dǎo)致形成疏水的空腔。將疏水QDs(3-6nm)和納米-γ-Fe2O3(5-20nm)嵌入弱極性有機溶劑中。圖2所示為同時嵌入了CdSe/ZnS和納米-γ-Fe2O3的納米顆粒的透射電鏡(TEM)圖像，插圖所示為H2N-St-Aam納米球的掃描電鏡(SEM)圖像。如圖2所示，該顆粒在納米球中分布廣泛，且表面比較清潔。
進行能散X射線(EDX)微觀分析，以證實該顆粒的分布情況。當(dāng)BFNs分散在極性水溶液中時，即使在一星期的持續(xù)超聲處理后，也沒有發(fā)現(xiàn)可檢測的嵌入的疏水顆粒從疏水腔中泄漏。該結(jié)果表明疏水顆粒按所需嵌入了納米顆粒內(nèi)。
圖3所示為嵌入H2N-St-AAm共聚物中的一些單獨的QDs和γ-Fe2O3納米顆粒的高分辨率TEM(HRTEM)圖像。圖3A是一個QD(CdSe/ZnS QD；A(102方向)，d＝0.25nm；B(111方向)，d＝0.21nm。晶面間角為92°)的圖像。該晶體數(shù)據(jù)幾乎可以適于纖維鋅礦CdSe的結(jié)構(gòu)，其晶胞(unit cell)參數(shù)a＝0.4299，c＝0.7010nm。圖3B所示是俯視不同晶帶軸線的另一個QD(CdSe/ZnS QD；C(111)，d＝0.21nm；D(201)，d＝0.17nm。晶面間角為57°。)圖3C所示為一個QD和一個γ-Fe2O3顆粒，其粒度不同而互相重疊。圖3C中，小晶體E的原子面可以標(biāo)引為CdSe(111)，其d＝0.21nm，大顆粒F可以標(biāo)引為立方γ-Fe2O3(200)，其d＝0.41nm。γ-Fe2O3納米顆粒的另一張圖像如圖3D所示，纓狀(fringes)區(qū)G標(biāo)引為(222)，其d＝0.24nm。還觀察了一些超級結(jié)構(gòu)對應(yīng)的大d間隙。BFNs的磁響應(yīng)充分，而且分散在溶劑中的BFNs易于控制。收集和控制該BFNs和隨后納米球捕獲的細(xì)胞僅需數(shù)十秒。還發(fā)現(xiàn)該BFNs的分散性良好，如圖4A(明視場顯微鏡)和圖4B(熒光顯微鏡)所示。
波長不同，γ-Fe2O3納米顆粒的相對UV/Vis吸收強度也不同。另一方面，QDs的熒光放射波長取決于其粒徑。顆粒越小，該熒光的波長越短。因此，γ-Fe2O3通過吸收熒光而對熒光強度所起的作用會因QDs的粒徑和兩類納米顆粒的相對劑量而不同。雖然該相互作用總是以一定程度存在，但是QDs的熒光很強，足以在所有情況下都可以用熒光顯微鏡直接觀察到(圖4B)。
圖4表明所述發(fā)熒光的顆粒具有均一的性質(zhì)。因此，γ-Fe2O3與QDs的劑量比和該顆粒的濃度都可以相當(dāng)?shù)撵`活。如果需要或希望更多的熒光，就加入更多的QDs。如果需要或希望較少的熒光，則加入較少的QDs。
葉酸是一種配體，可以用于獲得本發(fā)明所述的三功能納米顆粒(TFNs)。TFNs可以通過用葉酸(FA)修飾BFNs的表面而制備，葉酸是一種沿若干代謝途徑進行單碳鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)所需的維生素，而且是生物合成核苷酸堿基所必需的。葉酸基于4-[(蝶啶-6-基甲基)氨基]苯甲酸(蝶酸)，其IUPAC名稱是4-{[(2-氨基-3，4-二氫-4-氧代喋啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酸。其中蝶酸與一個或多個L-谷氨酸分子綴合的化合物名為蝶酰谷氨酸、蝶酰二谷氨酸。四氫葉酸和葉酸分別是蝶酰谷氨酸和蝶酰二谷氨酸的優(yōu)選異名。
FA受體(FR)是一種糖蛋白，它被發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤、特別是上皮癌細(xì)胞中極大地過量表達。FA和FR之間的結(jié)合親和力非常高，解離常數(shù)Kd為約10-9-10-10M。
圖5所示為TFN的制備及其捕獲癌細(xì)胞的示意圖。圖6A-C所示為與TFNs一起培養(yǎng)3小時(B)和6小時(C)的MCF-7細(xì)胞，QDs的最大發(fā)射波長為540nm；(A)明視場(B)，(C)熒光(FL))。圖6D-E所示為與TFNs一起培養(yǎng)4小時的Hela細(xì)胞，QDs的最大發(fā)射波長為595nm，(D)明視場；E)熒光。圖6F-G所示為對照實驗，MRC-5細(xì)胞與TFNs一起培養(yǎng)6小時，QDs的最大發(fā)射波長為595nm，(F)明視場；G)熒光)。磁選后取出上清液觀察。圖6H-I所示為對照實驗，MCF-7細(xì)胞與BFNs一起培養(yǎng)6小時，QDs的最大發(fā)射波長為610nm，(H)明視場；I)熒光；不進行磁選。
利用肼化反應(yīng)以包含-NH-部分，從而提高表面上的NH2基團的反應(yīng)性。用聚氧乙烯-二-胺(PEG-二-胺)作為隔離物。PEG也稱為聚乙二醇。采用戊二醛來活化H2N-St-AAm納米球，以進一步附著FA-PEG-NH2。戊二醛(HCO(CH2)3OCH)是優(yōu)選的活化劑。但是，本發(fā)明并不僅限于戊二醛，任何適合的二醛或甲醛都可以使用。此外，帶有多個醛基的分子也可以使用。
在培養(yǎng)3-4小時后，帶有FA配體的TFNs可以捕獲Hela和MCF-7癌細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時間增加，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面有更多TFNs(圖6A-6E)。對照試驗表明即使在同樣的條件下，將TFNs同MRC-5細(xì)胞(一種缺乏FR的正常人體細(xì)胞)一起培養(yǎng)6小時，也不發(fā)生捕獲(圖6F和6G)。對于無FA的BFNs，即使在培養(yǎng)6小時后，在BFNs和MCF-7之間也沒有明顯的反應(yīng)。因此，在細(xì)胞表面沒有發(fā)現(xiàn)熒光，且BFNs聚集在細(xì)胞培養(yǎng)基中(圖6H和6I)?？桃鈱D6H和圖6I中未結(jié)合的BFNs留下，而不清洗，以表明在培養(yǎng)基中共存時它們不能與該細(xì)胞反應(yīng)。清洗后，在該細(xì)胞上觀察不到熒光BFNs。所有這些結(jié)果表明TFNs可以通過FA和FR之間的特異識別相互作用來捕獲癌細(xì)胞。另一方面，非特異吸收幾乎可以全消除，而這在單獨使用納米顆粒時是不能實現(xiàn)的。
本發(fā)明還允許使用新的結(jié)合機制以將生物材料附著于雙功能納米顆粒。將熒光性和磁性結(jié)合在單一納米球上將極大地增加其在生物醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。本發(fā)明包括通過將量子點和納米-γ-Fe2O3共同嵌入聚(苯乙烯/丙烯酰胺)共聚物納米球中以制備熒光-磁性雙功能納米球。這些納米球(直徑為100-150nm)與免疫球蛋白G(IgG)，抗生物素蛋白，鏈霉親和素或生物素隨后的生物功能化生成了具有廣泛生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的三功能納米球。
本發(fā)明使用的示例性熒光探測(probe)物質(zhì)是CdSe。然而，任何適合的半導(dǎo)體物質(zhì)都可以使用。這些半導(dǎo)體物質(zhì)包括但不限于CdTe、CuInSe2、CdS、InGa、InAs、CdSe/ZnS、PbSe等。
此外，所述磁性物質(zhì)不限于Fe2O3。其它適合的磁性物質(zhì)包括但不限于Co、Co合金、Co鐵氧體、氮化鈷、氧化鈷、CoPd、CoPt、Fe合金、FeAu、FeCr、FeN、Fe3O4、FePd、FePt、FeZrNbB、MnN、NdFeB、NdFeBNdCu、Ni和Ni合金。
用作本發(fā)明所述三功能納米顆粒的基礎(chǔ)的優(yōu)選聚合物為經(jīng)過肼處理的苯乙烯/丙烯酰胺。但是，本發(fā)明并不限于這種聚合物體系，任何適合的聚合物都可以使用。該聚合物體系包括但不限于聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸甲酯、其它適合的丙烯酸或甲基丙烯酸體系的聚合物和共聚物，以及聚乙烯。
例如，苯乙烯和丙烯酰胺可以用于合成苯乙烯/丙烯酰胺共聚物納米球?？梢詫⑺?150ml)、丙烯酰胺(5g)和NaCl(0.3g)混合，在靜止N2氣氛中加熱至70℃，至少15分鐘，苯乙烯(22ml)加入約10分鐘。隨后，將0.1g溶于20ml水的過硫酸鉀，邊攪拌邊加入。在靜止N2氣氛中、于70℃進行7小時聚合。最后，將共聚物納米球從反應(yīng)溶液中分離出來，通過其表面酰胺官能團、使用肼對其改性，以產(chǎn)生活性納米球表面。如果使用其它聚合材料，反應(yīng)條件的細(xì)節(jié)會有所不同。
實施例如L.H.Qu等人在J.Am.Chem.Soc.，(2002)vol.124，pp.2049-2055中所述，為制備CdSe/ZnS QDs，首先獲得單分散性CdSe QDs.前體由hexamethyldisilathiane((TMS)2S)制備，逐滴將乙酰丙酮鋅(Zn(ac)2)加入到新制備的200℃的CdSe溶液中。納米-γ-Fe2O3通過乙酰丙酮鐵、十六烷基胺(HDA)和油酸的反應(yīng)制成。St-AAm共聚物納米球通過St(苯乙烯)和AAm(丙烯酰胺)在水溶液中發(fā)生聚合而制成。H2N-St-AAm通過使用肼對St-AAm進行熱液處理而制成。
通過在氯仿/丁醇溶劑(5∶59 v/v)中使H2N-St-AAm膨脹、以及控制量的CdSe/ZnS QDs和納米-γ-Fe2O3，從而制備BFNs。隨后進行30分鐘超聲處理，離心，用丁醇清洗三次。使用在20kV下運行的Acc.V Spot Maqn SEM、在200kV下運行的JEOL-JEM 2010 TEM、用于EDX的Oxford Link ISIS系統(tǒng)和D/max-RC衍射儀進行樣品表征。
葉酸偶聯(lián)為了合成FA-PEG-NH2，在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC；51mg)存在的情況下，使無水二甲亞砜(4mL)中的FA(90mg)和三乙胺(1mL)與N-羧基琥珀酰亞胺(NHS；50mg)在室溫下反應(yīng)。反應(yīng)混合物在黑暗中攪拌4小時，隨后加入PEG-二-胺(MW～3350，670mg)。隨后將所得的混合物攪拌一夜。通過過濾去除二環(huán)己脲。在含有熟石膏和熒光團(硅膠GF)(75∶36∶6氯仿/甲醇/水)的硅膠上的薄層色譜表明有新的斑點(Rf～0.56)，這是由于形成了產(chǎn)物FA-PEG-NH2。上清液對鹽水(NaHCO3，pH8.0，50mm)和水進行滲析，最后凍干。
FA-偶聯(lián)的TFNs靶向癌細(xì)胞為了說明FA-偶聯(lián)的TFNs在癌細(xì)胞靶向方面的應(yīng)用，按常規(guī)方式在37℃、含有5％CO2(空氣中)的濕潤氣氛、在盛有無FA RPMI-1640培養(yǎng)基、補充10％胎牛血清(是FA的唯一來源)的燒瓶中培養(yǎng)Hela細(xì)胞(一種人類宮頸癌細(xì)胞系)、MCF-7細(xì)胞(一種人類乳腺癌細(xì)胞系)和MRC-5細(xì)胞(一種二倍體人類肺成纖維細(xì)胞系)。為了實施雙功能納米球(FA-PEG-BFN)捕獲細(xì)胞，該細(xì)胞首先在六孔塑料平皿中培養(yǎng)24小時(癌細(xì)胞)和48小時(正常細(xì)胞)，隨后補加已經(jīng)分散了如上述所制備的TFNs的培養(yǎng)基。該細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)固定的時間(3-6小時，見圖5)。用磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4 PBS)清洗該細(xì)胞數(shù)次，以清除非特異吸收的FA-PEG-BFN納米球，用胰蛋白酶-EDTA溶液分離，在培養(yǎng)基中重懸，進行磁選。棄掉上清液，磁選出的細(xì)胞懸浮在pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)中。將該懸浮液(～10mL)滴到載玻片上進行熒光顯微鏡觀察。
免疫球蛋白G偶聯(lián)在琥珀色瓶中使用偏過碘酸鈉(0.1M pH 6.8 PBS中0.1mL，50mmol/L)、在室溫下持續(xù)振蕩30分鐘使羊抗兔IgG(0.4mL，5mg/mL，Sigma)氧化，從而在其Fc片段內(nèi)產(chǎn)生活性醛類。此外，過碘酸鉀或其它過碘酸鹽優(yōu)先產(chǎn)生CHO基團，也可以用來代替偏過碘酸鈉。停止反應(yīng)停止后，使該混合物通過一脫鹽柱(PD10，Amersham Biosciences)，從而去除未反應(yīng)的偏過碘酸鈉。在用PBS對含酰肼的、嵌入了桔紅色量子點的雙功能納米球清洗三遍后，用超聲處理幾分鐘徹底懸浮。將含酰肼的雙功能納米球(在PBS中0.5mL，20mg/mL)的懸浮物與氧化抗體(0.1M pH6.8PBS中0.5mL，ca.4mg/mL)混合，在室溫下溫育至少6小時，同時保持振蕩(圖7，示意圖1A)，隨后用PBS清洗十次。結(jié)果獲得熒光性-磁性-生物靶向三功能IgG-納米球。
為表征它們表面的羊抗兔IgG的生物活性，將三功能納米球(0.2mL，在0.1M pH7.2 PBS)如上所述用兔抗人IgG-FITC(10μL，3.0g/L，北京中山金橋生物科技公司)在4℃下溫育30分鐘，同時輕微振蕩，隨后用PBS清洗十次，以去除未結(jié)合的兔抗人IgG-FITC。fluoroceinyl異硫氰酸鹽(FITC)熒光的顯微術(shù)分析清楚地顯示了在納米球的表面兔抗人IgG與羊抗兔IgG的結(jié)合(圖8A和8B中同時存在綠色和紅色熒光)，表明在偶聯(lián)過程中羊抗兔IgG一直保持著活性。另一方面，當(dāng)使用偶聯(lián)了未氧化羊抗兔IgG抗體的納米球與兔抗人IgG-FITC溫育時(圖8C)，或者，當(dāng)使用兔抗人IgG-FITC與雙功能納米球溫育時(圖8D)，在納米球上沒有檢測到fluoroceinyl異硫氰酸鹽(FITC)熒光。這些結(jié)果表明該三功能納米球通過它們表面羊抗人IgG而特異地識別兔抗人IgG，需要共價偶聯(lián)來產(chǎn)生這些三功能納米球。
抗生物素蛋白偶聯(lián)為了研究雙功能納米球生物功能化的通用性，使用抗生物素蛋白制備三功能納米球。抗生物素蛋白偶聯(lián)到如上所述用于羊抗兔IgG的雙功能納米球。當(dāng)與PBS中的生物素-FITC溫育這些抗生物素蛋白-納米球1小時后，接著用PBS徹底清洗以清除多余的生物素-FITC。
熒光顯微檢驗證實了生物素被該納米球表面的抗生物素蛋白捕獲，然而當(dāng)雙功能納米球未偶聯(lián)抗生物素蛋白、與生物素-FITC溫育時，或者當(dāng)生物素-FITC與曾用未氧化的抗生物素蛋白溫育的納米球溫育時，則沒有發(fā)生捕獲，再一次表明了該三功能納米球的特異性和生物活性。
生物素偶聯(lián)將生物素偶聯(lián)到雙功能納米球。將硫代-NHS-LC-LC-生物素(4.8mg，Pierce)直接加入到含酰肼、嵌入了綠色量子點的雙功能納米球(0.5mL，在PBS中20mg/mL)的懸浮液中，隨后在室溫反應(yīng)3小時，同時振蕩，隨后用PBS清洗十次，以制成帶有表面生物素的三功能納米球(圖7，示意圖1B)。
為了評估它們表面上的生物素的生物活性，將鏈霉親和素-藻紅素(10uL，Sigma)加入到三功能生物素-納米球(0.2mL)中，在室溫下溫育1小時，同時輕微振蕩，隨后用PBS徹底清洗。藻紅素?zé)晒夥治霰砻麈溍褂H和素結(jié)合該生物素-納米球的表面(圖9A和9B中同時存在紅色和綠色熒光)，然而，對于與未改性生物素偶聯(lián)的納米球(圖9C)、或未與生物素偶聯(lián)而且無鏈霉親和素-藻紅素的雙功能納米球(圖9D)來說，則不會發(fā)生結(jié)合。
總之，可以使用一種簡單而便捷的手段來制備新穎的具有良好熒光性、磁性和細(xì)胞識別能力的三功能納米球，該納米球易于控制、跟蹤，可以方便地用于捕獲靶細(xì)胞。而且，根據(jù)生物分析、生物醫(yī)學(xué)圖像、診斷和藥物組合篩選等目的的需要，TFNs表面固定的分子可以任意變換。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然在不脫離本發(fā)明實質(zhì)或保護范圍的情況下，可以對上述發(fā)明內(nèi)容作出眾多改進或改變。如果這些改進和改變在所附權(quán)利要求及其等價語句的范圍內(nèi)，本發(fā)明將包括此發(fā)明的這些改進和改變。
本申請中引用了許多科學(xué)期刊文獻。這些文獻的每一篇在此處全文引用作為參考，且用于所有這類引用的目的。
權(quán)利要求
1.一種納米顆粒，包括中孔聚合物；附著在該中孔聚合物上的磁性材料；附著在該中孔聚合物上的熒光染料；以及與該中孔聚合物偶聯(lián)的生物材料，其中該中孔聚合物經(jīng)過肼處理，該生物材料經(jīng)過氧化劑處理。
2.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中該生物材料選自IgG、抗生物素蛋白、生物素和鏈霉親和素。
3.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中該磁性材料包括Fe2O3。
4.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中該熒光染料包括CdSe或CdSe/ZnS量子點。
5.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中該聚合物包括經(jīng)過肼處理的苯乙烯/丙烯酰胺(H2N-St-Aam)。
6.一種制備多功能納米顆粒的方法，包括提供中孔聚合物納米顆粒，該納米顆粒具有附著在該中孔聚合物上的磁性材料，附著在該中孔聚合物上的熒光染料；用肼處理該納米顆粒；氧化生物材料；以及將該氧化的生物材料偶聯(lián)到該納米顆粒上。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中使用偏過碘酸鈉氧化該生物材料。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述被氧化的生物材料具有活性醛基。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該生物材料選自IgG、抗生物素蛋白、生物素和鏈霉親和素。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該磁性材料包括Fe2O3。
11.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該熒光染料包括CdSe或CdSe/ZnS量子點。
12.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該聚合物包括經(jīng)過肼處理的苯乙烯/丙烯酰胺(H2N-St-Aam)。
13.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中該納米顆粒不具有磁芯。
14.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該納米顆粒不具有磁芯。
15.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中該生物材料通過下述結(jié)構(gòu)偶聯(lián)到納米顆粒上 其中X是該納米顆粒，Y是該生物材料。
16.如權(quán)利要求15所述的納米顆粒，其中Y是抗體、抗生物素蛋白或鏈霉親和素。
17.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該生物材料通過下述化學(xué)式偶聯(lián)到納米顆粒上 其中X是該納米顆粒，Y是該生物材料。
18.如權(quán)利要求15的方法，其中Y是抗體、抗生物素蛋白或鏈霉親和素。
19.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中該生物材料是通過下述結(jié)構(gòu)偶聯(lián)到納米顆粒上的生物素 其中X是該納米顆粒，LC是-C＝O(CH2)3-NH-。
20.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該生物材料是通過下述結(jié)構(gòu)偶聯(lián)到納米顆粒的生物素 其中X是該納米顆粒。
21.一種多功能納米顆粒，包括 其中n≥1；X是中孔納米顆粒，包括中孔聚合物，附著在該中孔聚合物上的磁性材料以及附著在該中孔聚合物上的熒光染料；Y是蛋白質(zhì)。
22.如權(quán)利要求21所述的多功能納米顆粒，其中Y是抗生物素蛋白、鏈霉親和素或抗體。
23.一種多功能納米顆粒，包括 其中n≥1；X是中孔納米顆粒，包括中孔聚合物，附著在該中孔聚合物上的磁性材料以及附著在該中孔聚合物上的熒光染料；PEG是聚乙二醇；和FA是葉酸。
24.如權(quán)利要求23所述的多功能納米顆粒，其中n是3。
25.一種分離細(xì)胞的方法，包括將具有所需受體的細(xì)胞與如權(quán)利要求1所述的多功能納米顆粒相接觸，其中Y是配體，它特異地結(jié)合于該所需受體以獲得與多功能納米顆粒結(jié)合的細(xì)胞；將這些與多功能納米顆粒結(jié)合的細(xì)胞引入磁場，從而固定這些細(xì)胞；清除未與多功能納米顆粒結(jié)合的細(xì)胞；將磁場從與多功能納米顆粒結(jié)合的細(xì)胞移去，收集該細(xì)胞。
26.一種分離和分選具有不同表面受體的細(xì)胞的方法，包括將具有多種所需受體的細(xì)胞樣品與多種權(quán)利要求1所述的多功能納米顆粒相接觸，其中每種多功能納米顆粒具有不同的配體Y，Y特異地結(jié)合樣品中至少一種所述細(xì)胞上的所需表面受體，進一步地，每個配體Y同一種特定顏色的熒光染料相配對，以獲得與多功能納米顆粒相結(jié)合的細(xì)胞；將所述與多功能納米顆粒結(jié)合的細(xì)胞引入磁場，從而固定所述細(xì)胞；清除未與多功能納米顆粒結(jié)合的細(xì)胞；將磁場從與多功能納米顆粒結(jié)合的細(xì)胞移去，收集這些細(xì)胞；隨后根據(jù)與每種配體Y相配對的染料的熒光顏色，對收集的細(xì)胞進行分選。
27.一種分離和/或檢測生物分子的方法，包括將生物混合物與權(quán)利要求1所述多功能納米顆粒相接觸，該生物混合物包括具有所需相互作用位點的生物分子，其中Y包括配體，它特異地結(jié)合所需受體或其它結(jié)合配偶體以獲得與多功能納米顆粒結(jié)合的生物分子；將這些與多功能納米顆粒結(jié)合的生物分子引入磁場，從而固定這些生物分子和相關(guān)聯(lián)的分子；清除未與多功能納米顆粒結(jié)合的分子；將磁場從與多功能納米顆粒結(jié)合的生物分子移去；和收集結(jié)合的生物分子。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中進一步包括通過與多功能納米顆粒結(jié)合的生物分子的熒光，進一步凈化所述結(jié)合的生物分子和相關(guān)聯(lián)的分子。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中進一步凈化所述結(jié)合生物分子的步驟在收集該結(jié)合生物分子步驟之前或之后進行。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中該生物分子包括蛋白質(zhì)。
全文摘要
三功能納米球具有良好的熒光性、磁性和細(xì)胞識別能力，易于控制、跟蹤，可以方便地用于捕獲靶細(xì)胞。根據(jù)生物分析、生物醫(yī)學(xué)成像、診斷和藥物組合篩選等目的的需要，TFNs表面固定的分子可以任意變換。該納米顆粒由中孔聚合物；附著在該中孔聚合物上的磁性材料；附著在該中孔聚合物上的熒光染料；以及偶聯(lián)到該中孔聚合物的生物材料組成，其中該中孔聚合物經(jīng)過肼處理，該生物材料經(jīng)過氧化劑處理。
文檔編號G01N1/28GK1869692SQ20051007922
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月23日
發(fā)明者龐代文, 謝海燕, 王國平, 張志凌, 宋爾群, 石運伯 申請人:武漢大學(xué), 由衛(wèi)生與公眾服務(wù)部代表的美利堅合眾國政府