本發(fā)明屬分析化學領域，涉及適體傳感器，具體涉及一種氧化介孔碳納米球適體傳感器及其制備方法及其在癌癥檢測中的應用。

背景技術：

據(jù)報道，癌癥發(fā)生率和致死率與日俱增，已成為威脅人類健康的重大疾病，因此，發(fā)展有效的腫瘤診斷技術，包括檢測和成像，已刻不容緩。目前腫瘤診斷實踐中，主要有聯(lián)合不同的生化檢測或成像技術，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、蘇木精-伊紅染色法(H&E染色)、電子計算機X射線斷層掃描技術(CT)、磁共振成像(MRI)等，用于不同組織水平的診斷，實踐顯示，所述的檢測診斷技術復雜，難度高，并且其中多數(shù)技術缺乏特異性，容易出現(xiàn)假陽性結果。近年來，基于熒光猝滅-恢復的生物傳感器被認為是一種靈敏度高、可靠的腫瘤檢測工具，然而多數(shù)熒光生物傳感器易于檢測液體組織的腫瘤標志物如核酸、多肽或蛋白，但鮮見用于體內(nèi)腫瘤組織的在體檢測，因此，發(fā)展新型的熒光猝滅材料，制備特異性高的生物傳感器，用于多層面的腫瘤檢測，是該技術領域重要的研究方向。

已知碳納米材料，包括一維碳納米管、二維氧化石墨烯具有特殊功能，如通過與熒光標記單鏈DNA間的非共價π-π相互作用產(chǎn)生優(yōu)良的熒光猝滅能力以及暴露于靶點后的定量熒光恢復能力，已經(jīng)被開發(fā)應用于熒光“Turn-on”生物傳感器的制備；但目前主要仍用于體外液體組織的單一檢測，其中主要原因在于碳納米管或氧化石墨烯毒性較大、易聚集、功能基團主要存在于界面邊緣等，更重要的是，所述的一維和二維結構不利于與固體瘤組織均勻相互作用；相較之下，三維碳納米材料，如介孔碳納米球(MCN)有潛力克服所述一維、二維材料的缺陷，如，(1)三維球形結構中具有均勻介孔，比表面積大，孔體積大，容易通過表面功能基團與生物大分子相互作用；(2)三維納米球，旋轉能低，在體內(nèi)與 實體瘤相互作用后，傳感信號穩(wěn)定，靈敏；(3)MCN生物相容性好，目前已經(jīng)被探索用作腫瘤光熱治療的藥物載體。因此，MCN是一種有潛力的可用于“Turn-on”生物傳感的熒光猝滅劑，有望用于體內(nèi)外腫瘤組織不同水平上的多重檢測。

基于現(xiàn)有技術的現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬提供一種新的適體傳感器，使實現(xiàn)體內(nèi)外的腫瘤多重診斷。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高效靈敏的適體傳感器，具體涉及一種氧化介孔碳納米球適體傳感器及其制備方法。所述的適體傳感器通過特異性結合惡性腫瘤表面高度表達的MUC1，實現(xiàn)體內(nèi)外的腫瘤多重診斷。

本發(fā)明中，合成了一種氧化介孔碳納米球(OMCN)，通過π-π相互作用在其表面非共價連接Cy3熒光標記的單鏈DNA探針(P₀適體)，制備適體傳感器(OMCN/P₀-Cy3)，通過特異性結合惡性腫瘤表面高度表達的標志物——細胞表面黏蛋白1(MUC1)，實現(xiàn)“Turn-on”的生物傳感腫瘤檢測。該新型適體傳感器不僅可以高靈敏定量液體中MUC1分子和乳腺癌MCF-7細胞，還可以實現(xiàn)腫瘤細胞、離體組織和實體瘤的清晰特異性成像，實現(xiàn)體內(nèi)外的腫瘤多重診斷。

具體的，本發(fā)明所述的氧化介孔碳納米球適體傳感器，以氧化介孔碳納米球OMCN為載體，表面通過π-π相互作用非共價連接一種Cy3熒光標記的單鏈DNA探針，制成氧化介孔碳納米球適體傳感器。

本發(fā)明制備氧化介孔碳納米球適體傳感器的方法，包括如下步驟：介孔碳納米球使用強酸混合物處理，超聲，攪拌，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。適量OMCN與P₀-Cy3混合，搖床振搖，制得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，儲存?zhèn)溆谩?/p>

上述制備方法中，合成OMCN時所述強酸混合物為硫酸和硝酸的混合物，體積比為2～4:1；

上述方法中，合成OMCN時，超聲方式為普通超聲和超聲破碎儀超聲；

上述方法中，合成OMCN時，超聲時間為0.5～4h；

上述方法中，合成OMCN時，攪拌溫度為30～70℃；

上述方法中，合成OMCN時，攪拌時間為0.5～4h；

上述方法中，制備OMCN/P₀-Cy3適體傳感器時，OMCN與P₀-Cy3的用量比為：30～780mg：100～300nmol；

上述方法中，制備OMCN/P₀-Cy3適體傳感器時，OMCN與P₀-Cy3的混合方式為搖床振搖；

上述方法中，制備OMCN/P₀-Cy3適體傳感器時，OMCN與P₀-Cy3的振搖混合速率為100～200rpm；

上述方法中，制備OMCN/P₀-Cy3適體傳感器時，OMCN與P₀-Cy3的振搖混合時間為10～30min；

上述方法中，所得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器的適宜儲存溫度為4～25℃。

本發(fā)明使用OMCN/P₀-Cy3適體傳感器檢測的溶液體系為Tris-HCl溶液、含血漿溶液和含腫瘤細胞溶液。

本發(fā)明使用OMCN/P₀-Cy3適體傳感器檢測的目標對象為MUC1分子、腫瘤細胞、離體腫瘤組織和活體腫瘤組織。

本發(fā)明可通過多種方法對所制備的OMCN進行表征，表征方法包括：掃描電鏡、透射電鏡、小角X射線散射(SAXS)、X射線衍射(XRD)和X射線光電子能譜(XPS)。

本發(fā)明使用熒光光譜儀考察OMCN/P₀-Cy3適體傳感器的線性范圍和檢測限。OMCN/P₀-Cy3適體傳感器分別與含有MUC1的不同溶液體系(Tris-HCl溶液或含4％血漿的Tris-HCl溶液)或含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液混合，孵育10min，使用熒光光譜儀檢測溶液熒光，考察線性范圍和檢測限。結果顯示，本發(fā)明所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在Tris-HCl溶液、含4％血漿的Tris-HCl溶液和含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液中的線性范圍分別為1.06–10.6μM、1.06–10.6μM和10⁵–2×10⁶個細胞/mL，檢測限分別為67.8nM、49.5nM和9.3×10⁴個細胞/mL。

本發(fā)明進一步使用Infinite M1000Pro酶標儀考察OMCN/P₀-Cy3適體傳感器的線性范圍和檢測限。OMCN/P₀-Cy3適體傳感器分別與含有MUC1的不同溶液體系(Tris-HCl溶液或含4％血漿的Tris-HCl溶液)或含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液混合，孵育10min，使用Infinite M1000 Pro酶標儀檢測溶液熒 光，考察線性范圍和檢測限。結果顯示，本發(fā)明所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在Tris-HCl溶液、含4％血漿的Tris-HCl溶液和含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液中的線性范圍分別為0.10–2.12μM、0.10–2.12μM和10⁴–2×10⁵個細胞/mL，檢測限分別為7.05nM、6.52nM和8500個細胞/mL。

本發(fā)明使用共聚焦顯微鏡考察OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對腫瘤細胞的選擇特異性。OMCN/P₀-Cy3適體傳感器分別與人乳腺癌MCF-7細胞和乳腺上皮MCF-10A細胞孵育0min、5min、30min和60min，PBS淋洗，共聚焦顯微鏡拍照觀察。結果顯示，MCF-7乳腺癌細胞上的紅色熒光隨著時間逐漸增強，而乳腺上皮MCF-10A細胞幾乎無熒光，表明本發(fā)明所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對乳腺癌細胞有非常好的選擇特異性響應。

本發(fā)明使用倒置熒光顯微鏡觀察OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在離體腫瘤組織切片的響應效果。雌性Balb/c裸鼠皮下接種MCF-7細胞，待瘤體積增大至200mm³可用。荷瘤鼠處死，取腫瘤，冰凍切片，部分切片與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育1h，PBS淋洗，倒置熒光顯微鏡觀察切片。結果顯示，經(jīng)OMCN/P₀-Cy3適體傳感器處理的腫瘤切片可觀察到紅色熒光，而未經(jīng)處理的腫瘤切片沒有熒光，表明本發(fā)明所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對離體腫瘤組織有非常有效的響應。

本發(fā)明使用活體成像系統(tǒng)觀察OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對體內(nèi)腫瘤的響應效果。雌性Balb/c裸鼠皮下接種MCF-7細胞，待瘤體積增大至200mm³可用。正常鼠和荷瘤鼠分別皮下注射或瘤內(nèi)注射P₀-Cy3溶液和OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，分別于0min、5min、15min、30min和60min使用Maestro-2活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠。結果顯示，荷瘤鼠瘤內(nèi)注射P₀-Cy3溶液，熒光信號非常弱，荷瘤鼠瘤內(nèi)注射OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，熒光信號隨著時間延長先增強后減弱，正常鼠皮下注射P₀-Cy3溶液，熒光信號隨著時間延長減弱，正常鼠皮下注射OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，未檢測到熒光信號，表明本發(fā)明所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對活體腫瘤組織有非常有效的響應。

表1顯示了OMCN/P₀-Cy3適體傳感器檢測MUC1或MCF-7細胞的線性范圍和檢測限。

本發(fā)明的突出優(yōu)點及特征在于，提供了一種基于OMCN的高效靈敏的適體 傳感器，通過特異性結合惡性腫瘤表面高度表達的MUC1，可實現(xiàn)體內(nèi)外的腫瘤多重診斷。本發(fā)明所制備的基于OMCN的適體傳感器，與現(xiàn)有的基于氧化石墨烯的適體傳感器相比較，檢測限明顯降低，且可應用于MUC1分子、腫瘤細胞、離體腫瘤組織和活體腫瘤組織不同水平上的檢測，確保診斷真實可靠。

本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟實用簡單的基于OMCN的適體傳感器及其制備方法，該適體傳感器能實現(xiàn)體內(nèi)外的腫瘤多重診斷。

附圖說明

圖1 OMCN的物理表征結果。

其中，A：掃描電鏡圖；

B：透射電鏡圖(插入圖：單個納米球的透射電鏡圖)；

C：小角X射線散射圖(插入圖：X射線衍射圖)；

D：X射線光電子能譜圖(插入圖：相應的C 1s圖)。

圖2共聚焦顯微鏡法考察OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對MCF-7腫瘤細胞的攝取情況，

其中，A：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育0min(200倍放大，bar＝50μm)；

B：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育0min(900倍放大，bar＝10μm)；

C：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育0min(2.5D切面圖)；

D：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育5min(200倍放大，bar＝50μm)；

E：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育5min(900倍放大，bar＝10μm)；

F：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育5min(2.5D切面圖)；

G：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育30min(200倍放大，bar＝50μm)；

H：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育30min(900倍放 大，bar＝10μm)；

I：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育30min(2.5D切面圖)；

J：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育60min(200倍放大，bar＝50μm)；

K：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育60min(900倍放大，bar＝10μm)；

L：MCF-7細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育60min(2.5D切面圖)。

圖3共聚焦顯微鏡法考察OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對正常乳腺上皮MCF-10A細胞的攝取情況，

其中，A：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育0min(200倍放大，bar＝50μm)；

B：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育0min(900倍放大，bar＝10μm)；

C：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育0min(2.5D切面圖)；

D：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育5min(200倍放大，bar＝50μm)；

E：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育5min(900倍放大，bar＝10μm)；

F：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育5min(2.5D切面圖)；

G：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育30min(200倍放大，bar＝50μm)；

H：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育30min(900倍放大，bar＝10μm)；

I：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育30min(2.5D切 面圖)；

J：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育60min(200倍放大，bar＝50μm)；

K：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育60min(900倍放大，bar＝10μm)；

L：MCF-10A細胞與OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育60min(2.5D切面圖)。

圖4倒置熒光顯微鏡觀察OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在離體腫瘤組織切片的響應效果，

其中，A：離體腫瘤組織切片未經(jīng)OMCN/P₀-Cy3適體傳感器處理的明場圖(bar＝200μm)；

B：離體腫瘤組織切片未經(jīng)OMCN/P₀-Cy3適體傳感器處理的熒光圖(bar＝200μm)；

C：離體腫瘤組織切片經(jīng)OMCN/P₀-Cy3適體傳感器處理1h的明場圖(bar＝200μm)；

B：離體腫瘤組織切片經(jīng)OMCN/P₀-Cy3適體傳感器處理1h的熒光圖(bar＝200μm)。

圖5活體成像系統(tǒng)觀察OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對體內(nèi)腫瘤的響應效果，

其中，I組：荷瘤鼠皮下注射或瘤內(nèi)注射P₀-Cy3溶液；

II組：荷瘤鼠瘤內(nèi)注射OMCN/P₀-Cy3適體傳感器；

III組：正常鼠皮下注射P₀-Cy3溶液；

IV組：正常鼠皮下注射OMCN/P₀-Cy3適體傳感器；

A：裸鼠經(jīng)不同處理0min后使用Maestro-2活體成像系統(tǒng)觀察結果；

B：裸鼠經(jīng)不同處理5min后使用Maestro-2活體成像系統(tǒng)觀察結果；

C：裸鼠經(jīng)不同處理15min后使用Maestro-2活體成像系統(tǒng)觀察結果；

D：裸鼠經(jīng)不同處理30min后使用Maestro-2活體成像系統(tǒng)觀察結果；

E：裸鼠經(jīng)不同處理60min后使用Maestro-2活體成像系統(tǒng)觀察結果。

具體實施方式

實施例1.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為2:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例3.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為4:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例4.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲0.5h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例5.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲4h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例6.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h， 30℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例7.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，70℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例8.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，30℃攪拌0.5h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例9.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，30℃攪拌4h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例10.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，超聲破碎2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例11.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(30μg/mL)與P₀-Cy3(100nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例12.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(780μg/mL)與P₀-Cy3(300nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例13.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，100rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例14.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，200rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例15.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖20min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例16.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖30min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例17.

介孔碳納米球使用硫酸和硝酸的混合物(體積比為3:1)處理，普通超聲2h，50℃攪拌2h，離心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳納米球OMCN。OMCN(300μg/mL)與P₀-Cy3(200nmol/L)混合，160rpm搖床振搖10min，即得OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，25℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實施例18.

通過Philips XL-30掃描電鏡觀察實施例2制備的OMCN，結果顯示該OMCN具有均一的尺寸，呈圓整球形，粒徑在100nm左右，請見附圖1A。

實施例19.

通過JEOL-2100F透射電鏡觀察實施例2制備的OMCN，結果顯示該OMCN分散性好，具有有序介孔，孔徑約為3nm，請見附圖1B。

實施例20.

將實施例2制備的OMCN進行小角X射線散射(SAXS)測試和X射線多晶衍射(XRD)分析，結果顯示該OMCN具有高度有序的體心立方Im3m介孔結構，其骨架具有石墨化碳區(qū)域，請見附圖1C。

實施例21.

將實施例2制備的OMCN進行X射線光電子能譜掃描，結果顯示該OMCN的元素組成為74.6at％C和24.8at％O，其結構組成為石墨化碳(C＝C/C-C)和氧化的碳(C-O/C＝O),請見附圖1D。

實施例22.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含有MUC1的Tris-HCl溶液混合，孵育10min，使用熒光光譜儀檢測溶液熒光，考察線性范圍，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在Tris-HCl溶液中的線性范圍為1.06–10.6μM，

表1

實施例23.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含有MUC1的含4％血漿的Tris-HCl溶液混合，孵育10min，使用熒光光譜儀檢測溶液熒光，考察線性范圍。結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在含4％血漿的Tris-HCl溶液中的線性范圍為1.06–10.6μM。

實施例24.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液混合，孵育10min，使用熒光光譜儀檢測溶液熒光，考察線性范圍，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液中的線性范圍為10⁵–2×10⁶個細胞/mL。

實施例25.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含有MUC1的Tris-HCl溶液混合，孵育10min，使用Infinite M1000Pro酶標儀檢測溶液熒光，考察線性范圍，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在Tris-HCl溶液中的線性范圍為0.10–2.12μM。

實施例26.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含有MUC1的含4％血漿的Tris-HCl溶液混合，孵育10min，使用Infinite M1000Pro酶標儀檢測溶液熒光，考察線性范圍，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在含4％血漿的Tris-HCl溶液中的線性范圍為0.10–2.12μM。

實施例27.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液混合，孵育10min，使用Infinite M1000Pro酶標儀檢測溶液熒光，考察線性范圍，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液中的線性范圍為10⁴–2×10⁵個細胞/mL。

實施例28.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含有MUC1的Tris-HCl溶液混合，孵育10min，使用熒光光譜儀檢測溶液熒光，考察檢測限，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在Tris-HCl溶液中的檢測限為 67.8nM。

實施例29.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含有MUC1的含4％血漿的Tris-HCl溶液混合，孵育10min，使用熒光光譜儀檢測溶液熒光，考察檢測限，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在含4％血漿的Tris-HCl溶液中的檢測限為49.5nM。

實施例30.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液混合，孵育10min，使用熒光光譜儀檢測溶液熒光，考察檢測限，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液中的檢測限為9.3×10⁴個細胞/mL。

實施例31.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含有MUC1的Tris-HCl溶液混合，孵育10min，使用Infinite M1000Pro酶標儀檢測溶液熒光，考察檢測限，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在Tris-HCl溶液中的檢測限為7.05nM1。

實施例32.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含有MUC1的含4％血漿的Tris-HCl溶液混合，孵育10min，使用Infinite M1000Pro酶標儀檢測溶液熒光，考察檢測限，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在含4％血漿的Tris-HCl溶液中的檢測限為6.52nM。

實施例33.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液混合，孵育10min，使用Infinite M1000Pro酶標儀檢測溶液熒光，考察檢測限，結果顯示(如表1所示)，所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器在含MCF-7腫瘤細胞的Hank’s緩沖溶液中的檢測限為8500個細胞/mL。

實施例34.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與人乳腺癌MCF-7細胞孵育0min、5min、30min和60min，PBS淋洗，共聚焦顯微鏡拍照觀察，結果顯示， MCF-7乳腺癌細胞上的紅色熒光隨著時間逐漸增強，表明所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對乳腺癌細胞有非常好的響應，請見附圖2。

實施例35.

將實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器與乳腺上皮MCF-10A細胞孵育0min、5min、30min和60min，PBS淋洗，共聚焦顯微鏡拍照觀察。結果顯示，乳腺上皮MCF-10A細胞幾乎無熒光，表明所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對乳腺上皮MCF-10A細胞無響應，請見附圖3。

實施例36.

雌性Balb/c裸鼠皮下接種MCF-7細胞，待瘤體積增大至200mm³可用。荷瘤鼠處死，取腫瘤，冰凍切片，部分切片與實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器孵育1h，PBS淋洗，倒置熒光顯微鏡觀察切片，結果顯示，經(jīng)OMCN/P₀-Cy3適體傳感器處理的腫瘤切片可觀察到紅色熒光，而未經(jīng)處理的腫瘤切片沒有熒光，表明本發(fā)明所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對離體腫瘤組織有非常好的響應，請見附圖4。

實施例37.

雌性Balb/c裸鼠皮下接種MCF-7細胞，待瘤體積增大至200mm³可用。正常鼠和荷瘤鼠分別皮下注射或瘤內(nèi)注射P₀-Cy3溶液和實施例2制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，分別于0min、5min、15min、30min和60min使用Maestro-2活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠，結果顯示，荷瘤鼠瘤內(nèi)注射P₀-Cy3溶液，熒光信號非常弱，荷瘤鼠瘤內(nèi)注射OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，熒光信號隨著時間延長先增強后減弱，正常鼠皮下注射P₀-Cy3溶液，熒光信號隨著時間延長減弱，正常鼠皮下注射OMCN/P₀-Cy3適體傳感器，未檢測到熒光信號，表明本發(fā)明所制備的OMCN/P₀-Cy3適體傳感器對活體腫瘤組織有非常好的響應，請見附圖5。