專利名稱：快速檢測3,5,6－三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于果蔬及原糧類食品中農(nóng)藥殘留檢測試紙及其檢測方法，屬膠體金免疫檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于蔬菜生長期短且病蟲害較為嚴(yán)重，因而，在蔬菜種植過程中常常需要連續(xù)多次施藥。而不少蔬菜需要多次采收，采收與施藥的時(shí)間間隔短，造成采收時(shí)蔬菜中的農(nóng)藥殘留量往往較高，很容易超過國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。而蔬菜中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)會嚴(yán)重影響人類健康水平，已成為不容忽視的食品污染源。政府和各職能部門對食品的農(nóng)藥殘留問題十分關(guān)注。但由于農(nóng)藥的毒性和害蟲的抗藥性形成一個(gè)惡性循環(huán)，因此全面徹底禁止高劇毒農(nóng)藥的使用將有一個(gè)較長的過程，即使是全面使用中、低毒農(nóng)藥，農(nóng)藥惡性中毒事件仍然發(fā)生。因此對分析檢測的對象、種類、數(shù)量、范圍、指標(biāo)等諸多方面都提出了新的要求和更高標(biāo)準(zhǔn)。
3，5，6-三氯二吡啶醇是殺蟲劑毒死蜱的主要降解產(chǎn)物，其無論是物理性質(zhì)還是化學(xué)性質(zhì)都不同于毒死蜱，近三十年來研究者認(rèn)為3，5，6-三氯二吡啶醇是檢測殺蟲劑毒死蜱的標(biāo)志物。毒死蜱(O-O-二乙基O-3，5，6-三氯-2-吡啶基磷酸酯)，是一種當(dāng)前使用廣泛的中等毒性有機(jī)磷農(nóng)藥。由于其可能傷害兒童的神經(jīng)系統(tǒng)，阻止大腦的發(fā)育，美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)2000年6月8日宣布在2000年末停止毒死蜱在住宅(包括住宅草地和花園)、學(xué)校、托兒所、公園、醫(yī)院、私人療養(yǎng)所和購物中心住宅草地和花園內(nèi)的使用。中華人民共和國衛(wèi)生部和中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會于2005年1月25日發(fā)布，2005年10月1日實(shí)施中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量(GB 2763-2005)，標(biāo)準(zhǔn)限定了農(nóng)藥毒死蜱在農(nóng)作物中的最大允許殘留量。
目前，檢測農(nóng)藥殘留的分析方法主要是依靠、氣相色譜法(GC)或氣相色譜與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用法(GC/MS)?！懊敢种坡史?分光光度法”已被列為國家推薦標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 5009.199-2003)。該法快速、靈敏、操作簡便且成本低廉，可實(shí)現(xiàn)快速初篩，但受檢測范圍和精度的限制。而氣相色譜法(GC)可實(shí)現(xiàn)精度的定量分析但速度較慢，檢測成本較高?？傊?，這些方法普遍存在著樣品前處理過程復(fù)雜，靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，耗時(shí)，檢測設(shè)備昂貴，并要求有專業(yè)的技術(shù)人員及較長的分析周期。
因此，利用競爭法原理，在傳統(tǒng)免疫檢測法的基礎(chǔ)上引入了膠體金快速檢測技術(shù)，研制出毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇膠體金競爭法檢測試紙。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員檢測，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)具有保存方便，有效期長的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述存在的一些問題，提供了一種適用于檢測毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇是否超標(biāo)的膠體金測定試紙。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩魴z測試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接(交疊連接部分在1--2毫米范圍)，在毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。關(guān)于底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標(biāo)墊的組合方法按專利CN 2741052Y執(zhí)行。
毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩魴z測試紙的控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，試驗(yàn)線是由毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇合成免疫原包被。把檢測毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙的樣品吸液層端放入果汁、蔬菜浸汁中，由于毛細(xì)管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，當(dāng)移動至毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇單克隆抗體金標(biāo)墊時(shí)，樣品中的毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇與毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇單克隆抗體金標(biāo)探針發(fā)生特異結(jié)合，當(dāng)移動至固定有毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇合成免疫原聯(lián)結(jié)物試驗(yàn)線時(shí)，由于毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體與樣品中毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇優(yōu)先結(jié)合成復(fù)合物而失去其與毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇合成免疫原結(jié)合，因此其膠體金不能滯留于試驗(yàn)線上，試驗(yàn)線處沒有紅色線顯示，即只有一條紅色控制線為陽性；相反如果樣品中沒有毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇，毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體移動到試驗(yàn)線上，毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇單克隆抗體就會與毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇合成免疫原聯(lián)結(jié)物發(fā)生特異結(jié)合，使膠體金滯留于試驗(yàn)線上，即二條紅色線為陰性，這就是免疫競爭法原理。試驗(yàn)線的顏色深淺與樣品中毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇含量高低成反比。從陽性過渡到陰性，由于所測毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇含量不同，試驗(yàn)線的顏色也不同，形成一個(gè)紅色顏色梯度差，以這種原理檢測出OD值，從而推斷出試驗(yàn)線所反應(yīng)實(shí)際毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇的量，從而判斷農(nóng)藥殘留毒死蜱是否超標(biāo)。
試驗(yàn)線的最低檢出量可達(dá)毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇含量為0.5mg/kg。試驗(yàn)線的檢測值設(shè)定為國家頒布的果蔬農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)毒死蜱含量為0.5mg/kg或小粒水果農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)毒死蜱含量為1mg/kg或原糧農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)毒死蜱含量為0.1mg/kg。
用競爭法制成試紙其檢測毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇設(shè)定檢出量以上，觀察窗處出現(xiàn)一條紅線為陽性；設(shè)定檢出量以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；設(shè)定檢出量時(shí)在試驗(yàn)線處為一條模糊陰影線為界限值，從而得出判斷。
當(dāng)移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時(shí)，無論樣品中有無毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇，標(biāo)記的金標(biāo)探針都會與已設(shè)定好的羊抗鼠多克隆抗體結(jié)合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產(chǎn)生則代表操作有誤，檢測時(shí)樣品液面超過MAX線或試紙已經(jīng)過期。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的一種快速檢測毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙具有這樣的有益效果，即特異性強(qiáng)，靈敏度高，易儲存，無須專門技術(shù)人員操作，而且結(jié)果易讀。


圖1為本發(fā)明一種快速檢測毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙的主視結(jié)構(gòu)圖。
圖2為發(fā)明圖一的側(cè)視結(jié)構(gòu)圖。
圖3為檢測顯示陽性結(jié)果圖。
圖4為檢測顯示陰性結(jié)果圖。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗(yàn)線，5、單克隆抗體金標(biāo)墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線。
具體實(shí)施例1.根據(jù)毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇的分子結(jié)構(gòu)，推斷其分子中的抗原決定區(qū)，3，5，6-三氯二吡啶醇農(nóng)藥中間體經(jīng)化學(xué)反應(yīng)合成一種與毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇分子結(jié)構(gòu)相近的且具有羧基或氨基等易于蛋白質(zhì)大分子相連接基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)(半抗原)。在縮合劑作用下使半抗原小分子與蛋白質(zhì)大分子相連接制得毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇免疫抗原。
2.單克隆抗體的制備(1)用合成的免疫原免疫BALB/c小鼠。用SP2/0細(xì)胞融合建立瘤株進(jìn)行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得能與3，5，6-三氯二吡啶醇分子結(jié)合的單克隆抗體用于膠體金標(biāo)記。
3.膠體金的制備及與單克隆抗體的結(jié)合(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到90～95℃，加入適量檸檬酸三納繼續(xù)加熱攪拌至沸騰5分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)把3，5，6-三氯二吡啶醇單克隆抗體標(biāo)記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
4.制膜機(jī)制膜利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合見說明書附圖圖2，同專利CN 2741052Y。
6.使用方法把試紙的樣品吸液層端放入果汁、蔬菜浸汁中(液面不得超過MAX線圖中8)，1分鐘后取出試紙平放，由于毛細(xì)管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，5分鐘時(shí)觀察結(jié)果。
7.結(jié)果判斷檢測3，5，6-三氯二吡啶醇濃度0.5mg/kg以上，觀察窗處出現(xiàn)一條紅線為陽性；0.5mg/kg以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；0.5mg/kg時(shí)在試驗(yàn)線處為一條模糊陰影線為界限值，此界限值為國家頒布的蔬菜農(nóng)藥殘留毒死蜱檢測標(biāo)準(zhǔn)0.5mg/kg。從而得出判斷毒死蜱農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)。
權(quán)利要求1.一種快速檢測3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、毒死蜱降解3，5，6-三氯二吡啶醇單克隆抗體金標(biāo)墊(5)、樣品吸液層(6)、MAX線(8)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙，其特征在于控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙，其特征在于試驗(yàn)線是由毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇合成免疫原包被制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種快速檢測3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙，其特征在于所檢測的是毒死蜱降解物3，5，6-三氯二吡啶醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙，其特征在于金標(biāo)墊是由單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測3，5，6-三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙，其特征在于試驗(yàn)線最低檢出量范圍設(shè)定為0.01～5mg/kg。
專利摘要一種快速檢測3，5，6－三氯二吡啶醇?xì)埩舻哪z體金試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、單克隆抗體金標(biāo)墊、樣品吸液層組成。底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有毒死蜱降解物3，5，6－三氯二吡啶醇合成免疫原試驗(yàn)線和一條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層，通過膠體金免疫競爭方法制成試紙，利用免疫膠體金法來檢測果蔬中的毒死蜱降解物3，5，6－三氯二吡啶醇?xì)埩袅渴欠癯瑯?biāo)，從而判斷毒死蜱農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員檢測，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)具有保存方便，有效期長的特點(diǎn)。
文檔編號G01N33/558GK2844922SQ20052014260
公開日2006年12月6日 申請日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日
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