專利名稱：檢體前處理方法和使用了該方法的免疫測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢體前處理方法和使用了該方法的免疫測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
利用了抗原抗體反應(yīng)的免疫測(cè)定方法由于能夠以高靈敏度檢測(cè)出檢體或試樣中的成分或者物質(zhì)，因此在臨床檢查領(lǐng)域中，以血液(血漿、血清、全血)、尿、脊髓液、糞便等各種檢體等為對(duì)象而被利用。作為利用了抗原抗體反應(yīng)的免疫測(cè)定方法，例如有酶免疫測(cè)定法(EIA法)、熒光免疫測(cè)定法(FIA)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(CLIA)、免疫層析法、免疫比濁法(TIA法)、膠乳免疫比濁法(LTIA)等各種方法。
其中，免疫比濁法、膠乳免疫比濁法、在載玻片上的膠乳凝集法(以下有時(shí)將這3種方法統(tǒng)稱為“免疫凝集法”)由于其原理為不需要將抗原和未反應(yīng)的抗體進(jìn)行分離的B/F(結(jié)合/自由)分離的操作，因此稱為均相免疫測(cè)定。而且，作為簡(jiǎn)便性和迅速性優(yōu)異的方法，適用在例如CRP(C反應(yīng)性蛋白)、ASO(抗鏈球菌溶血素O)、RF(類風(fēng)濕因子)、尿中微量白蛋白、彈性蛋白酶等多個(gè)項(xiàng)目的臨床檢查中。
這些免疫凝集法的測(cè)定對(duì)象檢體通常為血液(血清、血漿、全血)、尿、宮頸粘液等。另一方面，對(duì)于作為鼻腔擤出液、鼻腔吸引液、鼻腔洗滌液等采集的來(lái)自于鼻涕的檢體，作為其測(cè)定的項(xiàng)目，有時(shí)用于判定流感病毒、RS病毒等呼吸器官感染癥。但是，這些項(xiàng)目的測(cè)定方法的原理均為利用了免疫層析法或膜過濾器的EIA法，對(duì)于來(lái)自于鼻涕的檢體，利用免疫凝集法的測(cè)定方法目前還未實(shí)用化(例如參照非專利文獻(xiàn)1～4)。
另外，來(lái)自于鼻涕的檢體根據(jù)個(gè)別檢體的差別而有一定程度的不同，多為具有某種程度的粘性的檢體，由該情況也可知，除了目標(biāo)的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)之外，還非常大量地含有糖蛋白等高分子物質(zhì)。在利用了免疫層析法或膜過濾器的EIA法中，雖然原因物質(zhì)還未確定，但已知有時(shí)會(huì)發(fā)生檢體中的共存物質(zhì)發(fā)生非特異性反應(yīng)、從而導(dǎo)致錯(cuò)誤檢查結(jié)果的情況。由于錯(cuò)誤的檢查結(jié)果導(dǎo)致假陽(yáng)性時(shí)，會(huì)延誤真正病因的確定，而且有時(shí)還會(huì)發(fā)生由于不恰當(dāng)?shù)拇胧┒又夭“Y使其惡化的情況。因此，來(lái)自于鼻涕的檢體例如添加表面活性劑后使粘度降低、或者預(yù)先使用濾紙或?yàn)V器等將來(lái)自于鼻涕檢體中的固體物質(zhì)(共存物質(zhì))除去后進(jìn)行測(cè)定。但是，即便這樣，由于非特異性的反應(yīng)，還是產(chǎn)生很多假陽(yáng)性。
本發(fā)明人等對(duì)與利用了簡(jiǎn)單的免疫層析法或膜過濾器的EIA法同樣地、利用簡(jiǎn)單的免疫凝集法對(duì)來(lái)自于鼻涕的檢體也進(jìn)行測(cè)定，對(duì)此進(jìn)行了研究。但是，在僅添加表面活性劑、或僅預(yù)先進(jìn)行固體成分的除去處理的檢體前處理中，仍然發(fā)生了很多的非特異性反應(yīng)，本來(lái)應(yīng)該為陰性的檢體呈現(xiàn)陽(yáng)性，即產(chǎn)生了假陽(yáng)性。
非專利文獻(xiàn)1日本小兒科學(xué)會(huì)雜志108卷3號(hào)406-411(2004)非專利文獻(xiàn)2感染癥學(xué)雜志第78卷9號(hào)865-871(2004)非專利文獻(xiàn)3感染癥學(xué)雜志第77卷12號(hào)1007-1014(2003)非專利文獻(xiàn)4醫(yī)學(xué)檢查VOL.52NO.2141-144(2003)發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供在免疫測(cè)定方法中防止非特異性反應(yīng)、同時(shí)能夠?qū)?lái)自于鼻涕的檢體進(jìn)行測(cè)定的檢體前處理方法和使用了該方法的免疫測(cè)定方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的檢體前處理方法為免疫測(cè)定方法中的檢體前處理方法，上述檢體為來(lái)自于鼻涕的檢體，是在實(shí)施上述免疫測(cè)定方法之前利用蛋白酶對(duì)上述檢體進(jìn)行處理的檢體前處理方法。
另外，本發(fā)明的免疫測(cè)定方法為利用了免疫反應(yīng)的免疫測(cè)定方法，檢體為來(lái)自于鼻涕的檢體，是對(duì)該檢體通過上述本發(fā)明的檢體前處理方法進(jìn)行前處理之后，實(shí)施上述免疫反應(yīng)的免疫測(cè)定方法。
這樣，如果利用蛋白酶預(yù)先對(duì)來(lái)自于鼻涕的檢體進(jìn)行處理，則即便是免疫測(cè)定方法，也能夠進(jìn)行防止了非特異性反應(yīng)的測(cè)定。結(jié)果，通過本發(fā)明，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便性和迅速性優(yōu)異的來(lái)自于鼻涕的檢體的測(cè)定。
具體實(shí)施例方式
下面，詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明中，上述免疫測(cè)定方法沒有特別限定，例如有下述方法使上述檢體中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)與負(fù)載在不溶性載體上且與上述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)，測(cè)定此時(shí)所產(chǎn)生的上述不溶性載體的凝集程度，由此對(duì)上述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度進(jìn)行測(cè)定(所謂的“免疫凝集法”)。本發(fā)明的檢體前處理方法優(yōu)選用于上述免疫凝集法中。
本發(fā)明中適用的蛋白酶沒有特別限定，例如除了來(lái)自于動(dòng)物、植物的蛋白酶之外，還可以列舉出曲霉菌屬、桿菌屬、鏈霉菌屬、根霉屬、青霉屬等來(lái)自于微生物的蛋白酶。作為具體的酶的名稱，例如可以列舉出半堿性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等。蛋白酶并非僅可使用1種，還可以并用2種以上。
來(lái)自于鼻涕的檢體例如可以使用作為鼻腔擤出液、鼻腔吸引液、鼻腔洗滌液而獲得的物質(zhì)。
另外，本發(fā)明中，當(dāng)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)為流感病毒時(shí)，可以優(yōu)選使用。此時(shí)，如果使用本發(fā)明，則通過對(duì)上述不溶性載體的凝集程度進(jìn)行定量，可以定量地測(cè)定病毒量。通過對(duì)應(yīng)于臨床癥狀進(jìn)行判斷，當(dāng)檢體中的病毒量多時(shí)，則可以預(yù)想該患者的重病程度達(dá)到某種程度，另外，可以預(yù)想該患者對(duì)周圍人的傳染力較強(qiáng)。當(dāng)隨著發(fā)病時(shí)間的推移病毒量減少時(shí)，也可以容易地判斷為感染末期，可以有助于治療方針和對(duì)患者進(jìn)行說(shuō)明。
利用蛋白酶進(jìn)行的來(lái)自于鼻涕的檢體的處理除了使用蛋白酶之外，沒有特別限定，例如與測(cè)定蛋白酶的酶活性的情況相同，在酶活性有效的pH范圍內(nèi)，可以在一般的條件下進(jìn)行。當(dāng)?shù)鞍酌笧榘雺A性蛋白酶時(shí)，例如將酶溶解在50mM的CHES(N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸)緩沖液(pH為9.8、含有1重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺、0.1重量％的EDTA·2Na、0.9重量％的NaCl、0.09重量％的疊氮化鈉)中，將該溶液作為檢體提取液，使其與來(lái)自于鼻涕的檢體發(fā)生反應(yīng)。另外，上述檢體提取液的緩沖液并非限定于上述CHES緩沖液，例如也可以優(yōu)選使用磷酸緩沖液、Tris-鹽酸(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)緩沖液、CAPS(N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸)緩沖液等。另外，緩沖液的pH例如優(yōu)選為pH511，在該pH范圍的情況下，例如緩沖劑的種類也沒有特別限定。當(dāng)?shù)鞍酌笧橐鹊鞍酌?、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶時(shí)，例如可以溶解在50mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH為8.4、含有4.1重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺、0.03重量％的CaCl2、0.9重量％的NaCl、0.09重量％的疊氮化鈉)，然后與來(lái)自于鼻涕的檢體發(fā)生反應(yīng)。
在這些優(yōu)選的蛋白酶中，例如從最不易受到檢體的影響、且與上述不溶性載體的相容性特別良好的觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選使用半堿性蛋白酶(EC3.4.21.63)作為本發(fā)明的蛋白酶。
本發(fā)明中，上述免疫測(cè)定方法如上所述，優(yōu)選為利用使用了不溶性載體的免疫凝集法的方法。作為上述不溶性載體，沒有特別限定，可以列舉出不溶性載體粒子。作為上述不溶性載體粒子，例如通常為聚苯乙烯制的膠乳粒子，但并不限定于聚苯乙烯，還可以使用聚丙烯制粒子、聚乙烯制粒子、明膠粒子、金屬膠體等能夠致敏抗體或抗原的粒子。粒子與抗原或抗體的結(jié)合例如可以適用利用了物理吸附力的物理吸附法，另外，例如還可以是使上述粒子上的羧基與抗原或抗體的氨基發(fā)生共價(jià)鍵合等的化學(xué)結(jié)合法。凝集程度的檢測(cè)方法例如可以使用用于測(cè)定濁度的分光光度計(jì)等自動(dòng)控制的光學(xué)測(cè)定裝置，還可以是使用目測(cè)確認(rèn)在載玻片上等有無(wú)凝集的方法。
本發(fā)明中，當(dāng)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)為流感病毒時(shí)，優(yōu)選鑒別流感病毒的A型和B型。此時(shí)，例如優(yōu)選使用對(duì)流感病毒的核蛋白特異性的抗體。作為流感病毒表面蛋白的血細(xì)胞凝集素等，由于抗原性逐漸變異，因此當(dāng)使用一定的抗血細(xì)胞凝集素抗體時(shí)，根據(jù)流行的病毒的亞型不同而反應(yīng)性有所不同，有些情況下有可能不發(fā)生反應(yīng)。但是，如果使用針對(duì)核蛋白的抗體，則由于核蛋白維持將A型和B型分類時(shí)的基本的抗原性，顯示出與亞型種類無(wú)關(guān)的恒定的反應(yīng)性，因此適于鑒別A型和B型。
核蛋白由于局部存在于由病毒粒子的脂質(zhì)雙層膜構(gòu)成的包膜內(nèi)部、且不存在于病毒表面，因此有必要用某些方法將核蛋白提取出來(lái)。作為該方法，例如有超聲波處理或反復(fù)進(jìn)行冷凍融化的物理的病毒粒子破壞或者利用表面活性劑等的化學(xué)處理方法。在化學(xué)處理方法中，一般來(lái)說(shuō)有利用Tween20(商品名，常用名為聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯)之類的非離子性表面活性劑等的提取劑進(jìn)行提取的方法。在EIA法或免疫層析法等以往的方法中，在抗原的提取中使用作為表面活性劑的Tween20，但如果將Tween20直接用于膠乳免疫比濁法中，則對(duì)抗原的反應(yīng)性顯著降低。此時(shí)，如果使用正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺(商品名MEGA-8)作為表面活性劑，則很少影響到膠乳免疫比濁反應(yīng)的反應(yīng)性，且還具有提取效果，因此優(yōu)選。
下面說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例。但本發(fā)明并不限定于下述實(shí)施例。
實(shí)施例1(實(shí)驗(yàn)1)抗流感A型抗體致敏膠乳的制備將0.5mL的按照抗流感A型小鼠單克隆抗體的濃度達(dá)到0.8mg/mL的方式制備的抗體液(50mM磷酸緩沖液，pH為7.4)和0.5mL的1％(w/v)的聚苯乙烯膠乳粒子(積水化學(xué)公司生產(chǎn)，平均粒徑為0.5μm)進(jìn)行混合，在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)，使抗體致敏于膠乳。在其中添加BSA(Sigma公司生產(chǎn)、牛血清白蛋白)，使其達(dá)到1重量％，在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)后進(jìn)行封閉。利用50mM磷酸緩沖液(pH為7.4)洗滌封閉了的抗體致敏膠乳后，在膠乳分散緩沖液(50mM的Tris-HCl緩沖液，pH為8.4、0.1重量％的BSA、0.1重量％的NaN3)中分散，使其達(dá)到0.1％(w/v)，從而制成抗流感A型抗體致敏膠乳試液。
(實(shí)驗(yàn)2)抗流感B型抗體致敏膠乳的制備將0.5mL的按照抗流感B型小鼠單克隆抗體的濃度達(dá)到0.6mg/mL的方式制備的抗體液(50mM磷酸緩沖液，pH為7.4)和0.5mL的1％(w/v)的聚苯乙烯膠乳粒子(積水化學(xué)公司生產(chǎn)，平均粒徑為0.6μm)進(jìn)行混合，在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)，使抗體致敏于膠乳。封閉之后的操作與(實(shí)驗(yàn)1)同樣地進(jìn)行，從而制成抗流感B型抗體致敏膠乳試液。
以下的一系列實(shí)驗(yàn)為使用半堿性蛋白酶作為蛋白酶所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。
(實(shí)驗(yàn)3)檢體提取液的制備將0.4mg的半堿性蛋白酶(來(lái)自于蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、Amano Enzyme公司生產(chǎn)的半堿性蛋白酶)溶解在1mL的含有1重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺(商品名MEGA-8、以下相同)、0.1重量％的EDTA·2Na、0.9重量％的NaCl、0.09重量％的疊氮化鈉的50mMCHES(N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸)緩沖液(pH為9.8)中，制成檢體提取液A。
另外，將0.4mg的半堿性蛋白酶(來(lái)自于蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)、Amano Enzyme公司生產(chǎn)的半堿性蛋白酶)溶解在1mL的含有1重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺、0.5重量％的BSA、0.9重量％的NaCl、0.1重量％的EDTA·2Na的50mM Tris-HCl緩沖液(pH為8.4)中，制成檢體提取液B。
(實(shí)驗(yàn)4)利用膠乳免疫比濁法測(cè)定流感A型抗原標(biāo)準(zhǔn)液使用精制流感A型病毒A/Kiev/301/94(H3N2)作為抗原，將其利用檢體稀釋液(含有1重量％的BSA和0.1重量％的疊氮化鈉的PBS，pH為7.4)進(jìn)行稀釋，使其達(dá)到規(guī)定的病毒濃度(4μg/mL和20μg/mL)，從而制備了兩種病毒溶液。另外，在剛要測(cè)定前，利用檢體提取液B(含有0.4mg/mL的半堿性蛋白酶、1重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺、0.5重量％的BSA、0.9重量％的NaCl、0.1重量％的EDTA·2Na的50MmTris-HCl緩沖液，pH為8.4)將各濃度的病毒液稀釋10倍，將其作為檢體用于膠乳免疫比濁法的測(cè)定中。作為病毒濃度為零的檢體，使用利用上述檢體提取液B將上述檢體稀釋液稀釋10倍后獲得的溶液。
作為反應(yīng)用緩沖液，使用含有2.1重量％的聚乙二醇20000(NacalaiTesque公司生產(chǎn))、1重量％的BSA、0.9重量％的NaCl、0.1重量％的EDTA·2Na和0.1重量％的疊氮化鈉的200mM的Tris-HCl(pH為8.4)緩沖液。在吸光度的測(cè)定中，使用免疫反應(yīng)測(cè)定裝置SPOTCHEM IM(愛科來(lái)株式會(huì)社生產(chǎn))，按照以下比例在比色杯內(nèi)混合各試劑和檢體，測(cè)定在37℃下處理5分鐘時(shí)的5分鐘的吸光度(測(cè)定波長(zhǎng)為660nm)變化量。所得結(jié)果示于下述表1中。
S(檢體)28μLR1(反應(yīng)用緩沖液)56μLR2(抗體致敏膠乳試液)56μL表1

由上述表1可知，由于吸光度差與A型流感病毒濃度成比例地增加(發(fā)生反應(yīng))，因此通過利用含有半堿性蛋白酶的檢體提取液處理檢體，能夠利用膠乳免疫比濁法定量地測(cè)定A型流感病毒量。
(實(shí)驗(yàn)5)利用膠乳免疫比濁法測(cè)定病毒B型抗原標(biāo)準(zhǔn)液使用精制流感B型病毒B/Victoria/504/00作為抗原，將其利用檢體稀釋液(含有1重量％的BSA和0.1重量％的疊氮化鈉的PBS，pH為7.4)進(jìn)行稀釋，使其達(dá)到規(guī)定的病毒濃度(1μg/mL和5μg/mL)，從而制備了兩種病毒液。另外，在剛要測(cè)定前，利用檢體提取液B(含有0.4mg/mL的半堿性蛋白酶、1重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺、0.5重量％的BSA、0.9重量％的NaCl、0.1重量％的EDTA·2Na的50Mm的Tris-HCl緩沖液，pH為8.4)將各濃度的病毒液稀釋10倍，將其作為檢體用于膠乳免疫比濁法的測(cè)定中。作為病毒濃度為零的檢體，使用利用上述檢體提取液B將上述檢體稀釋液稀釋10倍后獲得的溶液。
作為反應(yīng)用緩沖液，使用含有1.95重量％的聚乙二醇20000(NacalaiTesque公司生產(chǎn))、1重量％的BSA、0.9重量％的NaCl、0.1％的EDTA·2Na和0.1重量％的疊氮化鈉的200mM的Tris-HCl(pH為8.4)緩沖液。在吸光度的測(cè)定中，使用免疫反應(yīng)測(cè)定裝置SPOTCHEM IM(愛科來(lái)株式會(huì)社生產(chǎn))，按照以下比例在比色杯內(nèi)混合各試劑和檢體，測(cè)定在37℃下處理5分鐘時(shí)的5分鐘的吸光度(測(cè)定波長(zhǎng)為730nm)變化量。所得結(jié)果示于下述表2中。
S(檢體)28μLR1(反應(yīng)用緩沖液)56μLR2(抗體致敏膠乳試液)56μL表2

由上述表2可知，由于吸光度差與B型流感病毒濃度成比例地增加(發(fā)生反應(yīng))，因此通過利用含有半堿性蛋白酶的檢體提取液處理檢體，能夠利用膠乳免疫比濁法定量地測(cè)定B型流感病毒量。
(實(shí)驗(yàn)6)流感A型陰性檢體的測(cè)定從通過癥狀明確可知未患流感的人采集鼻腔吸引液，將其中通過以免疫層析法為原理的市售流感病毒檢測(cè)試劑盒(Nippon BectonDickinson公司，商品名為Capolia FluA/B)能夠確認(rèn)為A型陰性的鼻腔吸引液作為檢體使用(14個(gè)檢體)，測(cè)定流感A型病毒。除了將纏繞在棉棒上的鼻腔吸引液混懸在1mL的檢體提取液中之外，基本上利用與實(shí)施4相同的方法進(jìn)行。作為檢體提取液，除了蛋白酶之外，與在上述實(shí)驗(yàn)4中使用的檢體提取液B具有相同的組成，使用不含半堿性蛋白酶的提取液B-1和含有0.4mg/mL半堿性蛋白酶的提取液B-2。使用這些提取液B-1和B-2，比較各自的結(jié)果，研究半堿性蛋白酶對(duì)非特異性反應(yīng)的抑制效果。定性判定結(jié)果為吸光度差在0.0050以上時(shí)為陽(yáng)性(+)、小于0.0050時(shí)為陰性(-)。這些結(jié)果示于下述表3中。需要說(shuō)明的是，使用了提取液B-1的例子為比較例，使用了提取液B-2的例子為實(shí)施例。
表3

由上述表3可知，在利用膠乳免疫比濁法的流感A型病毒的測(cè)定中，當(dāng)利用不含半堿性蛋白酶的提取液B-1進(jìn)行處理時(shí)，14個(gè)檢體中的12個(gè)檢體發(fā)生了非特異性的凝集反應(yīng)，顯示了假陽(yáng)性，但利用含有半堿性蛋白酶的提取液B-2進(jìn)行處理時(shí)，14個(gè)檢體全部為本來(lái)的陰性結(jié)果。
(實(shí)施例7)流感B型陰性檢體的測(cè)定從通過癥狀明確可知未患流感的人采集鼻腔吸引液，將其中通過以免疫層析法為原理的市售流感病毒檢測(cè)試劑盒(Nippon BectonDickinson公司，商品名為Capolia FluA/B)能夠確認(rèn)為B型陰性的鼻腔吸引液作為檢體使用(8個(gè)檢體)，測(cè)定流感B型病毒。除了將纏繞在棉棒上的鼻腔吸引液混懸在1mL的檢體提取液中之外，基本上利用與實(shí)驗(yàn)5相同的方法進(jìn)行。作為檢體提取液，除了蛋白酶之外，與在上述實(shí)驗(yàn)5中使用的檢體提取液B具有相同的組成，使用不含半堿性蛋白酶的提取液B-1和含有0.4mg/mL半堿性蛋白酶的提取液B-2。使用這些提取液B-1和B-2，比較各自的結(jié)果，研究半堿性蛋白酶對(duì)非特異性反應(yīng)的抑制效果。定性判定結(jié)果為吸光度差在0.0050以上時(shí)為陽(yáng)性(+)、小于0.0050時(shí)為陰性(-)。這些結(jié)果示于下述表4中。檢體#15～#19為A型B型均陰性，但#20～#22的3個(gè)檢體為A型陽(yáng)性B型陰性。需要說(shuō)明的是，使用了提取液B-1的例子為比較例，使用了提取液B-2的例子為實(shí)施例。
表4

由上述表4可知，在利用膠乳免疫比濁法的流感B型病毒的測(cè)定中，當(dāng)利用不含半堿性蛋白酶的提取液B-1進(jìn)行處理時(shí)，8個(gè)檢體中的7個(gè)檢體發(fā)生了非特異性的凝集反應(yīng)，顯示了假陽(yáng)性，但利用含有半堿性蛋白酶的提取液B-2進(jìn)行處理時(shí)，8個(gè)檢體全部為本來(lái)的陰性結(jié)果。
(實(shí)驗(yàn)8)流感A型病毒的相關(guān)性試驗(yàn)采集61名臨床上疑似流感感染的患者的鼻腔吸引液，將其作為檢體。根據(jù)本發(fā)明利用含有半堿性蛋白酶的檢體提取液A(通過實(shí)驗(yàn)3制備)處理這些檢體，并利用膠乳免疫比濁法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法利用與上述實(shí)驗(yàn)6相同的方法進(jìn)行。對(duì)于所得吸光度差的數(shù)據(jù)，根據(jù)上述基準(zhǔn)，定性地判定陽(yáng)性(+)、陰性(-)，將該結(jié)果與對(duì)象法的結(jié)果進(jìn)行比較。作為對(duì)照法，實(shí)施使用了MDCK(馬-達(dá)二氏犬腎，Madin-Darby caninekidney)細(xì)胞的病毒分離培養(yǎng)法。將利用兩方法產(chǎn)生的一致結(jié)果示于下述表5中。
表5

由上述表5可知，當(dāng)利用含有半堿性蛋白酶的檢體提取液A對(duì)鼻腔吸引液檢體進(jìn)行前處理、并利用膠乳免疫比濁法測(cè)定流感A型病毒時(shí)，確認(rèn)了與對(duì)照法的病毒分離培養(yǎng)法的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。由此結(jié)果可以說(shuō)，本發(fā)明的免疫測(cè)定方法作為以往的病毒分離培養(yǎng)法的代替法可以充分地利用。
(實(shí)驗(yàn)9)流感B型病毒的相關(guān)性試驗(yàn)采集35名臨床上疑似流感感染的患者的鼻腔吸引液，將其作為檢體。根據(jù)本發(fā)明利用含有半堿性蛋白酶的檢體提取液A(通過實(shí)驗(yàn)3制備)處理這些檢體，并利用膠乳免疫比濁法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法利用與上述實(shí)驗(yàn)7相同的方法進(jìn)行。對(duì)于所得吸光度差的數(shù)據(jù)，根據(jù)上述基準(zhǔn)，定性地判定陽(yáng)性(+)、陰性(-)，將該結(jié)果與對(duì)照法的結(jié)果進(jìn)行比較。作為對(duì)照法，實(shí)施以免疫層析法為原理的市售B型流感病毒檢測(cè)試劑盒(Nippon Becton Dickinson公司，商品名為Capolia FluB)。將利用兩方法產(chǎn)生的一致結(jié)果示于下述表6中。
表6

由上述表6可知，當(dāng)利用含有半堿性蛋白酶的檢體提取液A對(duì)鼻腔吸引液檢體進(jìn)行前處理、并利用膠乳免疫比濁法測(cè)定流感B型病毒時(shí)，確認(rèn)了與對(duì)照法的免疫層析法的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。由此結(jié)果可以說(shuō)，本發(fā)明的免疫測(cè)定方法作為以往的免疫層析法的代替法可以充分地利用。
如上所述，如果使用本發(fā)明的前處理方法，則能夠?qū)嵤┓乐沽朔翘禺愋苑磻?yīng)的來(lái)自于鼻涕的檢體的免疫測(cè)定方法。因此，本發(fā)明的前處理方法可以適用在醫(yī)學(xué)或生物學(xué)等廣泛領(lǐng)域中，特別在臨床檢查的領(lǐng)域中是有用的。
權(quán)利要求
1.檢體前處理方法，其為免疫測(cè)定方法中的檢體前處理方法，其特征在于，所述檢體為來(lái)自于鼻涕的檢體，在實(shí)施所述免疫測(cè)定方法之前用蛋白酶對(duì)所述檢體進(jìn)行處理。
2.權(quán)利要求1所述的檢體前處理方法，其中，所述免疫測(cè)定方法為下述方法使所述檢體中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)與負(fù)載在不溶性載體上且與所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)，測(cè)定此時(shí)產(chǎn)生的所述不溶性載體的凝集程度，由此測(cè)定所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度。
3.權(quán)利要求1所述的檢體前處理方法，其中，所述蛋白酶為半堿性蛋白酶(EC 3.4.21.63)。
4.權(quán)利要求1所述的檢體前處理方法，其中，所述檢體中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)為流感病毒。
5.權(quán)利要求4所述的檢體前處理方法，其中，所述負(fù)載在不溶性載體上的免疫學(xué)物質(zhì)為所述流感病毒的抗體。
6.權(quán)利要求1所述的檢體前處理方法，其中，蛋白酶處理的pH條件為5～11的范圍。
7.免疫測(cè)定方法，其為利用了免疫反應(yīng)的免疫測(cè)定方法，其特征在于，檢體為來(lái)自于鼻涕的檢體，對(duì)該檢體通過權(quán)利要求1所述的檢體前處理方法進(jìn)行前處理，之后實(shí)施所述免疫反應(yīng)。
8.權(quán)利要求7所述的免疫測(cè)定方法，其中，所述免疫測(cè)定方法為下述方法使所述檢體中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)與負(fù)載在不溶性載體上且與所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)，測(cè)定此時(shí)產(chǎn)生的所述不溶性載體的凝集程度，由此測(cè)定所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度。
9.權(quán)利要求7所述的免疫測(cè)定方法，其中，所述檢體中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)為流感病毒。
10.權(quán)利要求8所述的免疫測(cè)定方法，其中，所述負(fù)載在不溶性載體上的免疫學(xué)物質(zhì)為所述流感病毒的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供在免疫測(cè)定方法中防止非特異性反應(yīng)、同時(shí)能夠?qū)?lái)自于鼻涕的檢體進(jìn)行測(cè)定的檢體前處理方法。首先利用蛋白酶處理所述來(lái)自于鼻涕的檢體，之后實(shí)施免疫測(cè)定方法。作為所述蛋白酶，優(yōu)選使用半堿性蛋白酶(EC 3.4.21.63)。另外，本發(fā)明的前處理方法優(yōu)選以來(lái)自于所述鼻涕的檢體中的流感病毒為對(duì)象。作為所述免疫測(cè)定方法，優(yōu)選為免疫凝集法，例如有免疫比濁法、膠乳免疫比濁法、在載玻片上的膠乳凝集法等。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101080636SQ200580042948
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2005年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日
發(fā)明者大代京一, 大宮一, 泉井直子 申請(qǐng)人:愛科來(lái)株式會(huì)社