專利名稱：西尼羅病毒熒光定量rt－pcr檢測試劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以西尼羅病毒基因片段為靶目標(biāo)設(shè)計合成的生物制劑，尤其是能夠?qū)ξ髂崃_病毒進(jìn)行檢測的試劑以及這種試劑的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)病是一種烈性人畜共患傳染病。該病病原與日本腦炎病毒、摩萊河谷腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒同屬黃病毒(Flavivirus)屬的日本腦炎病毒血清群，它們在血清學(xué)反應(yīng)上有交叉。黃病毒科病毒所引起的疾病是能夠?qū)е聡?yán)重的公共衛(wèi)生問題。WNV可以通過蚊或蜱等吸血媒介傳播，大多缺乏有效的治療和預(yù)防措施，給疾病控制提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。西尼羅病毒在近20年之內(nèi)全球范圍人畜間的暴發(fā)流行，特別近年來西尼羅病毒感染在歐洲、中東、西亞和俄羅斯等地區(qū)和國家頻頻發(fā)生，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。最令人矚目的是1999年在美國紐約首次發(fā)生，爾后幾乎擴(kuò)散至全美各州，成為近年來影響美國最大的傳染病，截止2003年10月22日全美已有7386人感染發(fā)病，有155人死亡(CDC)。
西尼羅病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，具有黃病毒成員的典型特征，WNV是有包膜的RNA病毒，為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，約10000～11000bp?；蚪M編碼三個結(jié)構(gòu)蛋白即核衣殼蛋白(C)、包膜蛋白(E)和膜蛋白(prM/M)，編碼七個非結(jié)構(gòu)蛋白。編碼區(qū)含有一個開放讀碼框(ORF)，前1/3區(qū)段編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白，后2/3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。西尼羅病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制繁殖過程中，病毒基因組首先翻譯為一個多聚蛋白，從N端到C端依次為C-prM/M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5，然后經(jīng)病毒自身編碼的蛋白酶和宿主細(xì)胞的蛋白酶切割成為成熟形式的病毒蛋白。核衣殼蛋白(C)，為一個堿性蛋白能夠結(jié)合到病毒基因組并形成二十面體結(jié)構(gòu)；prM是成熟病毒顆粒中M蛋白的前體形式，被蛋白酶切割成pr+M兩段，pr部分被分泌至細(xì)胞外，M部分嵌合在病毒的脂質(zhì)雙分子層中。E蛋白(55kDa)以同源二聚體的形式并通過一定的結(jié)構(gòu)閾錨定在病毒包膜中，是西尼羅病毒的主要抗原性結(jié)構(gòu)蛋白，具有血凝素活性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；E蛋白參與病毒與宿主細(xì)胞親和、吸附以及細(xì)胞融合過程，是病毒親嗜性以及毒力的主要決定蛋白。一般情況根據(jù)E蛋白基因繪制的分子進(jìn)化樹。禽類的病毒分布則有多樣性，包括心臟、腦、腸道都能分離到病毒。從禽類中分離病毒樣本要容易得多。西尼羅病毒可在易感細(xì)胞中生長，如兔腎細(xì)胞(RK-13)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)以及雞胚。近幾次流行的WNV毒株E蛋白基因進(jìn)行序列分析，可將WNV分成I系和II系。大多數(shù)WNV流行株屬于I系，包括1999年和2000年美國株、1996年羅馬尼亞株、1999年俄羅斯株。II系包括在非洲中部流行的大多數(shù)地方流行病毒株。
WNV血清學(xué)診斷方法較多，最重要的是美國疾控中心(CDC)建立的檢測人、馬和禽血清、腦脊液中西尼羅病毒抗體的IgM酶聯(lián)免疫吸附試驗(MAC-ELISA)。ELISA已取代了常規(guī)的血凝抑制試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗和中和試驗。該法所用抗原有兩種，一種是從病毒感染的乳鼠腦中用蔗糖丙酮提取精制的；另一種是C6P36細(xì)胞培養(yǎng)的上清液。但ELISA不是特異診斷方法，只能用于黃病毒抗體的篩檢，不能進(jìn)行確診。在美國，為了鑒別診斷西尼羅病毒與圣路易斯腦炎病毒感染所誘發(fā)的抗體，一般采用特異的蝕斑減少中和試驗(PRNT)來加以區(qū)分。雖然PRNT技術(shù)特異性較好，但由于中和試驗操作較繁，費(fèi)時費(fèi)力，難以應(yīng)用于大規(guī)模普查。
病毒核酸檢測方法主要是RT-PCR，其敏感性和特異性都很高，但用于擴(kuò)增馬腦組織病料時，該方法的敏感性較差，常擴(kuò)增不出特異性條帶。其原因可能是病毒在馬的腦組織中復(fù)制數(shù)量較低，其核酸含量未達(dá)到能被檢出的水平。為此，美國農(nóng)業(yè)部動植物檢疫局于2001年建立了從馬的腦脊髓組織中檢測病毒核酸的巢式RT-PCR。常規(guī)方法提取病毒RNV，然后進(jìn)行2次RT-PCR。PCR擴(kuò)增的區(qū)域是西尼羅河病毒E蛋白基因區(qū)，將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，見到248bp的DNA條帶者判為陽性。用RT-PCR來監(jiān)測組織、蚊蟲血漿混合物中的WNV被證明是非?？煽?。RT-巢式PCR能可靠的從馬腦組織中檢測到WNV的核苷酸，但是，非特異性污染常常使RT-巢式PCR獲得假陽性結(jié)果。
因此，研究建立特異、敏感、可對低含量WNV病毒感染、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測的方法，在檢疫、診斷、分子流行病學(xué)研究具有重要實際應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種利用西尼羅病毒E基因序列設(shè)計合成的西尼羅病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑。
本發(fā)明的另一目的是提供這種檢測試劑的制備方法。
本發(fā)明系選擇西尼羅病毒E基因的保守片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計合成引物和探針。將設(shè)計的多對引物和探針進(jìn)行最佳配對篩選實驗，得到最適合的引物和探針。
本發(fā)明所述的西尼羅病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為71bp，引物和探針序列為引物WNV-E-F5’-CCACACGCCACGAAGCA-3’WNV-E-R5’-CCAGCCAAAGCTTGATGCA-3’探針(FAM)5’-CTGTGATAGCATTGGGCTCACAAGAGGG-3’(TAMRA)。
本發(fā)明所述的西尼羅病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法由以下步驟組成一、選擇WNV E基因的保守片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為CCACACGCCACGAAGCAGTCTGTGATAGCATTGGGCTCACAAGAGGGAGCTCTGCATCAAGCTTTGGCTGG；二、應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針；三、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成；四、探針合成同時進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMAR；五、將設(shè)計合成的多對引物和探針進(jìn)行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物和探針；六、經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，并經(jīng)過大量臨床樣品的檢測應(yīng)用評估，得到如權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增效率和特異性好的引物和探針。
本發(fā)明研制的TaqMan實時熒光定量RT-PCR將PCR與熒光檢測相結(jié)合，克服了RT-PCR費(fèi)時、易污染、擴(kuò)增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數(shù)量少等缺點(diǎn)，可對樣品中的WNV進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測，具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為1、本試劑與常規(guī)的RT-PCR相比較，該方法具有快速、特異、敏感、可定量、可同時檢測大量樣品等優(yōu)點(diǎn)。西尼羅病毒熒光定量RT-PCR可對樣品中低含量的WNV病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，是一種WNV檢測的良好方法。
2、本試劑可對細(xì)胞培養(yǎng)物、分泌物、血液、組織等多種樣品中的WNV進(jìn)行快速檢測，樣品適用范圍廣，沒有生物安全隱患，使用安全的優(yōu)點(diǎn)。
3、本熒光定量RT-PCR試劑除了具有特異性高、敏感性強(qiáng)外，可同時進(jìn)行大量樣品檢測，具有高通量性，可減少RNA、cDNA或PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險。比常規(guī)PCR快速，無需擴(kuò)增后的電泳分析?？朔顺Ｒ?guī)RT-PCR和RT-巢式PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物須電泳檢測、費(fèi)時、不敏感和不能定量的缺點(diǎn)。
4、與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR作出一個定量的、客觀的估計，判定出陽性、陰性和可疑。CT值為30.00可確定為陽性和陰性的臨界值(cut-off)。更重要的是熒光定量RT-PCR特別適用于保存時間長而無法進(jìn)行分離病毒的大批量樣品的檢測。
5、本試劑所組成的試劑盒可在收到樣品后4小時之內(nèi)作出定性、定量檢測結(jié)果。該熒光定量RT-PCR試劑盒是一種檢測臨床樣品中WNV的敏感和可靠的方法。
具體實施例方式
1、WNV E基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照黃培堂等譯《分子克隆實驗指南》(第三版)，中國科學(xué)出版社，2003年1月，第1217頁至第1259頁，進(jìn)行西尼羅病毒E基因克隆和測序，構(gòu)建WNVE基因重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒命名為pBAD-E。
2、設(shè)計引物和探針本發(fā)明選擇WNV E基因的保守片段為靶目標(biāo)，通過對GenBank中報道的WNV各流行毒株病毒基因的DNA序列和上述1克隆和測序的西尼羅病毒W(wǎng)NV基因DNA序列進(jìn)行同源性分析比較，選定WNV基因的保守片段(71bp)，應(yīng)用primerExpress軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針，引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成探針合成同時進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMAR。將設(shè)計合成的多對引物和探針進(jìn)行最佳配對篩選實驗后，確定擴(kuò)增效率和特異性最好的一對引物和一條探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為71bp。
3、RNA提取西尼羅病毒RNA和標(biāo)準(zhǔn)品同時制備。參照黃禎祥主編《醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實驗技術(shù)》，科學(xué)出版社(1990年)第143-146頁，先測定毒價，以Reed和Muench氏法計算TCID50。取100μL病毒原液，參照盧圣棟主編《分子生物學(xué)實驗室常用技術(shù)》，科學(xué)出版社(1999年)第61-62頁，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用無RNA酶的超純水溶解總RNA，稀釋成相當(dāng)于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的每個反應(yīng)管。組織、血液(抗凝血)、血清和細(xì)胞組織等材料直接提取RNA。熒光RT-PCR和常規(guī)RT-PCR試驗用同批次提取的RNA。
4、WNV熒光定量RT-PCRWNV熒光定量RT-PCR采用50μL體積反應(yīng)液，在7000型熒光定量PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行42℃30min反轉(zhuǎn)錄；95℃預(yù)變性5min；95℃變性15sec，60℃1min，擴(kuò)增40個循環(huán)。
引物和探針的濃度進(jìn)行精確篩選，以獲得最低的CT值和較高的熒光強(qiáng)度增加值(ΔRn)。每次檢測時，設(shè)立用水代替病毒RNA樣品的4個陰性對照(或正常組織、細(xì)胞陰性對照)；設(shè)立相當(dāng)于1000、100、10、1TCID50/每反應(yīng)管的FMDV標(biāo)準(zhǔn)各4個對照；每個樣品檢測做3管平行試驗。在4個陰性對照為陰性、陽性對照為陽性時，整個試驗有效，可進(jìn)一步判定結(jié)果。每個樣品須作多個備份，以進(jìn)行穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗。
5、常規(guī)RT-PCR常規(guī)RT-PCR的上游引物和下游引物與熒光定量RT-PCR相同，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為71bp，按常規(guī)方法進(jìn)行擴(kuò)增。檢測用3％瓊脂糖電泳分析，陽性擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)一條71bp特異性條帶。
6、WNV熒光定量RT-PCR的特異性、敏感性用NDV、IBDV、BVD、AKAV以及正常非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)以及雞胚、野外采集雞和馬的組織樣品和血清進(jìn)行特異性比較檢測。對WNV細(xì)胞培養(yǎng)物、動物組織樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，用常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測，比較它們的敏感性。
7、熒光定量RT-PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗在評估WNV熒光定量RT-PCR檢測WNV方法中的組內(nèi)和組間試驗的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性時，用陽性樣品和陰性樣品，在同樣反應(yīng)條件下，反復(fù)進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，每次試驗的每個樣品做6個平行的反應(yīng)管，重復(fù)12次。
8、標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及核酸拷貝數(shù)的計算上述1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBAD-E，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，LB培養(yǎng)基(含Amp100μg/mL)增殖，堿裂解法提取，經(jīng)試劑盒純化，質(zhì)粒濃度用分光光度計測OD260定量。模板濃度的計算在作絕對定量時，首先制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4～10-7稀釋，通過測OD知道質(zhì)粒原液(標(biāo)準(zhǔn)品)的濃度后，可換算出每個PCR管中模板的數(shù)量。例如，已知pBAD/Thio TOPO載體長4436bp，插入的WNV E基因片段長1503bp，每個堿基的平均分子量是330，(每對堿基/bp是660，)質(zhì)粒原液約132μg/mL，阿弗加德羅常數(shù)(每mol的微粒數(shù))是6.02×1023/mol。那么每2μL的絕對模板數(shù)量是(132μg/mL×2μL×6.02×1023/mol)/[(4436+1503)bp×660g/(mol×bp)]＝4×1019。據(jù)此，10-4～10-7質(zhì)粒的模板分子數(shù)是4×1015～1012。做熒光定量RT-PCR檢測，以拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，CT值為Y軸作回歸曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9、引物和探針及其濃度的篩選選擇引物、探針、模板的最佳濃度配比，獲得熒光定量RT-PCR反應(yīng)的最低CT值和最高ΔRn，提高擴(kuò)增效率和敏感性。應(yīng)用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和WNV RNA，經(jīng)系列稀釋，制備DNA和RNA不同含量的檢測樣品。對設(shè)計的二對引物和各自的探針，選用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探針終濃度，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度。
10、對樣品的檢測用熒光定量RT-PCR對WNV細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、NDV、IBDV、BVD、AKAV、正常非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)以及雞胚、野外采集雞和馬的組織樣品和血清進(jìn)行檢測。提取的RNA稀釋后檢測，陽性樣品的CT值均小于或等于28.0，陰性對照樣品的CT值均大于30.0，試驗特異性強(qiáng)。CT值30可作為是陽性和陰性的臨界值。CT值大于30可判為陰性，CT值小于或等于28.0可判為陽性，在28.0-30之間為可疑，須重新試驗。熒光定量RT-PCR檢測WNV的特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性很好。
11、WNV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑和檢測程序11.1試劑盒組成(50μl反應(yīng)×50次)根據(jù)上述1～10試驗結(jié)果，按照反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗確定的反應(yīng)條件，配制如下試劑盒組份

11.2操作方法11.2.1總RNA提取(1)取1ml-1.5ml組織樣品研磨上清液或液體樣品置1.5ml eppendorf管中，12000rpm，4℃，離心5min，棄上清液。
(2)加入1ml溶液I，充分振蕩混勻，置室溫5min，徹底裂解。
(3)加200μl溶液II，小心蓋上帽蓋，用力快速振蕩15sec，室溫放置3min。
(4)12000rpm，4℃，離心15min。
(5)小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml eppendorf管中，加入500μl溶液III，混勻，室溫放置10min。
(6)13000rpm，4℃，離心10min，棄上清液。
(7)加1000μl溶液IV，充分振蕩混勻，12000rpm，4℃，離心5min。小心充上清液。管底部可見有乳白色膠樣RNA沉淀。
(8)小心打開管蓋，室溫自然干燥沉底的RNA。
(9)取11μl溶液IX置入已半干燥的沉底RNA，溶解RNA?？芍苯佑糜诜崔D(zhuǎn)錄或-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 11.2.2反應(yīng)組份配制(1)取一支200μl光學(xué)PCR反應(yīng)管，反應(yīng)總體積為50μl，向反應(yīng)管中加入下列反應(yīng)物 (2)定量按需要對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，至少7個稀釋度。
(3)設(shè)立對照陽性對照和陰性對照各設(shè)2管。
11.2.3擴(kuò)增按下列參數(shù)設(shè)置反應(yīng)條件

11.2.4結(jié)果分析和判定(1)結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果?；€和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。
(2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)——陰性對照無Ct值，并且無擴(kuò)增曲線，一直為水平線。
——陽性對照的Ct值應(yīng)小于28.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，2個陽性對照擴(kuò)增曲線基本重合，特別是在Threshold(熒光臨界值)附近。否則，此次實驗視為無效。
——定量用的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯，7個點(diǎn)具良好的線性范圍，平臺區(qū)匯于一起，相關(guān)系數(shù)在0.99以上。
(3)結(jié)果描述及判定——陰性Ct值應(yīng)大于30.0或無擴(kuò)增曲線，表示樣品中無西尼羅病毒。
——陽性Ct值小于等于28.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在西尼羅病毒。
——有效原則Ct值在28.0～30.0的樣本建議重做。重做結(jié)果Ct值大于30.0或無擴(kuò)增曲線者為陰性，否則為陽性。
——定量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線作出定量。
權(quán)利要求
1.一種西尼羅病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑，其特征在于包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為71bp，引物和探針序列為引物WNV-E-F5’-CCACACGCCACGAAGCA-3’WNV-E-R5’-CCAGCCAAAGCTTGATGCA-3’探針(FAM)5’-CTGTGATAGCATTGGGCTCACAAGAGGG-3’(TAMRA)。
2.按照權(quán)利要求1所述的西尼羅病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法，其特征在于由以下步驟組成(一)、選擇西尼羅病毒特異而各型病毒間比較保守的E基因序列的保守片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為CCACACGCCACGAAGCAGTCTGTGATAGCATTGGGCTCACAAGAGGGAGCTCTGCATCAAGCTTTGGCTGG；(二)、應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計一系列引物和探針；(三)、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成；(四)、探針合成同時進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMAR；(五)、將設(shè)計合成的多對引物和探針進(jìn)行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物和探針；(六)、經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，并經(jīng)過大量臨床樣品的檢測應(yīng)用評估，得到如權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增效率和特異性好的引物和探針。
3.權(quán)利要求1所述的西尼羅病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑在制備WNV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以西尼羅病毒E基因片段為靶目標(biāo)設(shè)計合成的生物制劑，尤其是能夠直接對西尼羅病毒進(jìn)行快速檢測的試劑以及這種試劑的制備方法和在試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明系選擇西尼羅病毒特異而各型病毒間比較保守的E基因片段為靶目標(biāo)，經(jīng)過精心設(shè)計、合成一大批引物和探針。將設(shè)計合成的多對引物和探針進(jìn)行最佳配對篩選實驗，并經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，得到最適合的引物和探針。本發(fā)明所述的西尼羅病毒熒光定量RT－PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為71bp。本試劑可直接對西尼羅病毒核酸進(jìn)行快速檢測。
文檔編號G01N21/64GK1840702SQ20061001061
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者花群義, 周曉黎, 董俊, 楊云慶, 徐自忠, 肖榮海, 尹尚蓮 申請人:云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心