一種st2定量檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種ST2定量檢測方法及試劑盒，屬于臨床診斷和生物科學領域。本發(fā)明的檢測方法為競爭法膠乳增強比濁檢測ST2，該方法使用膠乳偶聯(lián)的ST2與樣本中的ST2競爭結(jié)合ST2抗體從而引起濁度變化，推算ST2含量。本發(fā)明的試劑盒包括試劑1和試劑2，其中，試劑1中的組分包括緩沖液、ST2抗體、促凝劑、防腐劑。試劑2中的組分包括緩沖液、膠乳微球偶聯(lián)的ST2、穩(wěn)定劑、防腐劑。該方法及試劑盒靈敏度高，特異性強，反應速度高，可直接應用于全自動生化分析儀，有利于臨床推廣及應用。
【專利說明】
一種ST2定量檢測方法及試劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于臨床診斷和生物科學技術領域，具體的，本發(fā)明提供了一種ST2定量檢 測試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的方法及試劑盒測定簡便，靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好， 為ST2檢測的一種方便實用的檢測方法。
【背景技術】
[0002] ST2是1989年由Tominaga等作為白介素-1受體家族的新成員被發(fā)現(xiàn)，參與多種病 理生理過程，具有免疫調(diào)節(jié)功能，尤其在各種炎癥性和變態(tài)反應疾病中發(fā)揮重要作用。由于 當時未發(fā)現(xiàn)功能性配體，2005年以前一直認為是孤兒受體，2005年，Schmitz等發(fā)現(xiàn)IL-33作 為ST2的特異性功能配體，實際ST2是一種心肌蛋白，分泌后會阻斷IL-33的作用，IL-33具有 抗心肌肥大和抗心肌纖維化的作用。ST2表達于肥大細胞、激活的輔助性T細胞2、巨噬細胞 和心肌細胞。ST2在心肌受到過度牽拉造成損失的過程中會大量產(chǎn)生，生成的ST2阻斷IL-33 的作用，使心肌缺乏足夠的IL-33的保護，從而加速心肌重構(gòu)和心室功能障礙，最終導致死 亡風險增加。
[0003] ST2包括4種亞型：85了2、5了21^、5了2￥、5了21^。其中，85了2為分泌型5了2，可分泌到細胞 外，為IL-33的誘騙受體，抑制其信號傳導。在PRIDE研究中，208名急性心衰患者sST2水平顯 著增高，回顧分析1年后死亡患者血清sST2水平明顯高于生存者，sST2與心衰患者的一年 后的死亡風險呈劑量依賴的關系，多因素分析sST2預測一年的死亡率價值高。Weinberg進 一步研究探討了非缺血性心衰患者(ΝΥΗΑΙΠ-IV級;EF〈30%)發(fā)現(xiàn)，sST2是心衰兩周后心臟 移植和死亡的獨立預測因子。總之，血清sST2水平升高伴有病死率的升高，是心力衰竭預后 差的標志。
[0004] ST2作為一種新型心衰標志物，目前僅有日本SML公司有一個科研使用的ELISA方 法檢測試劑盒，并未有成型的商品化的檢測試劑應用于臨床并獲得相關藥監(jiān)部門批準。膠 乳免疫比濁法作為近年來發(fā)展迅速的生化檢測方法，由于其操作簡便，耗時較短，靈敏度大 幅度提高而受到各種項目檢測的青睞。采用競爭膠乳比濁法檢測ST2作為一種先進的診斷 方法對于臨床應用有巨大的作用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種簡便、準確、快速的ST2定量檢測方法。
[0006] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個優(yōu)選實施方案，其中樣本先與ST2抗體結(jié)合，與ST2免疫 原偶聯(lián)的膠乳微球形成競爭結(jié)合的關系，隨著樣本中ST2濃度的增加，引起膠乳凝集度降 低。
[0007] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個優(yōu)選實施方案，其中，ST2抗原首先同膠乳微球偶聯(lián)形成 致敏微球，ST2偶聯(lián)的膠乳微球與抗體可形成本底的凝集反應;測定時，樣本中的ST2先與抗 體反應形成復合物，從而競爭ST2歐聯(lián)的膠乳微球與抗體的反應，可造成凝集反應的減少， 凝集度可通過全自動生化分析儀檢測，并以數(shù)字的形式表示為吸光度變化A，可通過凝集度 的變化推算樣本中ST2含量。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一個檢測ST2的定量檢測試劑盒。該試劑盒簡便、靈 敏度高、重復性好、具有很好的臨床應用前景。
[0009] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個優(yōu)選實施方案，其中該試劑盒包含試劑1，試劑2， 其特征在于樣本來源于任何包含水的液態(tài)物質(zhì)，優(yōu)選地，樣本為尿液或血液。
[0010] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個優(yōu)選實施方案，其中試劑1為包含緩沖液、ST2抗體、促凝 劑和防腐劑的混合物。緩沖液為PH7.0-8.0的50mMTRIS緩沖液、甘氨酸緩沖液或磷酸緩沖 液;ST2抗體為ST2免疫獲得的高靈敏度的兔多克隆抗體或單克隆抗體，含量為10-100ug/ ml;促凝劑為含量為0.05%-3%的聚乙二醇6000。
[0011] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個優(yōu)選實施方案，其中試劑2為包含緩沖液、ST2偶聯(lián)的膠 乳微球、穩(wěn)定劑和防腐劑的混合物。緩沖液為PH7.0-8.0的50mMTRI S緩沖液、甘氨酸緩沖液 或磷酸緩沖液;穩(wěn)定劑為含量為〇. 1%_1%的牛血清白蛋白。
[0012] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個優(yōu)選實施方案，其中ST2偶聯(lián)的膠乳微球，選擇的微球為 表面含有羧基的聚苯乙烯微球，粒徑為110nm-200nm;通過碳化二亞胺活化后，加入10-100ug/ml的ST2混合反應3h形成可與ST2抗體形成凝集反應的致敏微球。
[0013] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個優(yōu)選實施方案，其中該試劑盒測定前需使用校準品進行 標定，該試劑盒選用的校準品為添加了 ST2純品的人血清或其它類似血清基質(zhì)的液體。優(yōu)選 地，選擇添加了 ST2純品的牛血清白蛋白基質(zhì)的液體。
【附圖說明】
[0014] 圖1 ST2試劑盒(實施例1)標準曲線； 圖2 ST2試劑盒線性范圍測定曲線。
【具體實施方式】
[0015] 實施實例一:ST2偶聯(lián)的膠乳微球的制備 根據(jù)本發(fā)明目的，首先制備ST2偶聯(lián)的膠乳微球，制備方法如下:a.將以下幾種組分混 合對微球進行活化：1%的150nm羧基聚苯乙烯微球，50mMMES緩沖液，5mM碳化二亞胺，2mM NHS混合均勻，震蕩活化30min; b. lOOOOrpm離心20min，除去活化劑；c. 50mM磷酸緩沖重懸， 并加入100ug/ml ST2蛋白，均勾混合3h;d. lOOOOrpm離心20min，除去未結(jié)合的蛋白；e.按 照終濃度0.1%的致敏顆粒含量加入PH7.4含0.1%牛血清白蛋白的50mM磷酸緩沖液作為穩(wěn)定 劑制備成試劑2。
[0016] 實施實例二:試劑盒組成 本試劑盒包含以下幾部分： 表1:試劑組成成分
實施實例三:測量程序確定 校準品選擇含1%BSA的roS緩沖液稀釋ST2蛋白，將濃度稀釋為0.125、0.25、 1、2、4共5種濃度梯度使用全自動生化分析儀，選擇600nm波長進行檢測，按照試劑1:試 劑2:樣本=180:60:25ul的參數(shù)進行檢測，檢測時，先加入試劑1和樣本混合5分鐘后，加入試 劑2混勻30秒后，讀取吸光度1，4.5分鐘后讀取吸光度2,以這兩點的差值為判斷標準作標準 曲線，見圖1。最終根據(jù)該標準曲線推算樣本中ST2含量。
[0017] 實施實例四：試劑盒分析性能測定 試劑盒線性檢測：另取高于線性范圍的ST2蛋白樣本和低值樣本按照不同比例混合測 定，最終使用測定值與理論值進行曲線擬合，擬合后線性相關系數(shù)大于0.99,則說明線性較 好，具體數(shù)據(jù)見圖2。
[0018] 試劑盒重復性檢測：臨床收集10個樣本，用該試劑盒重復檢測20次，求出均值，并 算出變異系數(shù)。變異系數(shù)小于15%時，則說明試劑盒具有較好的重復性。
[0019] 表2:試劑盒重復性檢測
【主權項】
1. 一種ST2定量檢測方法，樣本先與ST2抗體結(jié)合，與ST2免疫原偶聯(lián)的膠乳微球形成競 爭結(jié)合的關系，隨著樣本中ST2濃度的增加，引起膠乳凝集度降低。2. 根據(jù)權利要求1所述的ST2定量檢測方法，其特征在于ST2偶聯(lián)的膠乳微球與抗體可 形成本底的凝集反應，凝集度可通過全自動生化分析儀檢測。3. 根據(jù)權利要求1所述的ST2定量檢測方法，其特征在于使用時樣本中ST2先與抗體反 應形成復合物，從而競爭ST2歐聯(lián)的膠乳微球與抗體的反應，可造成凝集反應的減少，可通 過凝集度的變化推算樣本中ST2含量。4. 一種ST2定量檢測試劑盒，包含試劑1，試劑2。5. 根據(jù)權利要求4所述的ST2定量檢測試劑盒，其特征在于試劑1為包含緩沖液、ST2抗 體、促凝劑和防腐劑的混合物。6. 根據(jù)權利要求5所述的ST2定量檢測試劑盒試劑1，其特征在于緩沖液為提供抗原抗 體反應最適條件的緩沖液，可以為TRIS緩沖液、甘氨酸緩沖液或磷酸緩沖液；優(yōu)選地， PH7.0-8.0的50mM磷酸緩沖液。7. 根據(jù)權利要求5所述的ST2定量檢測試劑盒試劑1，其特征在于ST2抗體為ST2免疫獲 得的高靈敏度的兔多克隆抗體或單克隆抗體，含量為l〇-l〇〇ug/ml，其含量低于可結(jié)合的 ST2含量。8. 根據(jù)權利要求5所述的ST2定量檢測試劑盒試劑1，其特征在于促凝劑為促進免疫反 應的物質(zhì)，為不同分子量聚乙二醇，優(yōu)選地，聚乙二醇6000，含量為0.05%-3%。9. 根據(jù)權利要求4所述的ST2定量檢測試劑盒，其特征在于試劑2為包含緩沖液、ST2偶 聯(lián)的膠乳微球、穩(wěn)定劑和防腐劑的混合物。10. 根據(jù)權利要求9所述的ST2定量檢測試劑盒試劑2，其特征在于緩沖液為提供抗原抗 體反應最適條件的緩沖液，可以為TRIS緩沖液、甘氨酸緩沖液或磷酸緩沖液；優(yōu)選地， PH7.0-8.0的50mM磷酸緩沖液。11. 根據(jù)權利要求9所述的ST2定量檢測試劑盒試劑2,其特征在于ST2偶聯(lián)的膠乳微球， 選擇的微球為表面含有羧基的聚苯乙稀微球，粒徑為1 l〇nm-200nm;通過碳化二亞胺活化 后，加入10-100ug/ml的ST2混合反應3h形成可與ST2抗體形成凝集反應的致敏微球。12. 根據(jù)權利要求9所述的ST2定量檢測試劑盒試劑2,其特征在于穩(wěn)定劑為BSA，含量為 0.1%-1%〇13. 根據(jù)權利要求4所述的ST2定量檢測試劑盒，其特征在于，測定前需使用校準品進行 標定，該試劑盒選用的校準品為添加了 ST2純品的人血清或其它類似血清基質(zhì)的液體;優(yōu)選 地，選擇添加了 ST2純品的牛血清白蛋白基質(zhì)的液體。
【文檔編號】G01N33/543GK106018789SQ201610627067
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月3日
【發(fā)明人】周建平
【申請人】北京德奧平生物技術有限公司