Ⅲ型前膠原n端肽定量測(cè)定試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法Ⅲ型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒及其制備方法。試劑盒由測(cè)PⅢNP磁微粒、測(cè)PⅢNP示蹤結(jié)合物、質(zhì)控品組成，本發(fā)明還提供了一種該定量測(cè)定試劑盒的制備方法，其采用的是微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，可以借助全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，減少操作時(shí)間，降低人為操作誤差，提高檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確性，適合于臨床肝纖維化早期的輔助診斷。
【專利說明】
m型前膠原n端肽定量測(cè)定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種定量測(cè)定試劑盒，具體涉及一種用于測(cè) 定m型前膠原n端肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方 法，以及使用該試劑盒來測(cè)定m型前膠原n端肽濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞 外基質(zhì)過度沉淀的病理過程，它不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，許多慢性肝臟疾病均可引起肝纖維 化，其病因大致可分為感染性(慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎，血汲蟲病等），先天性代 謝缺陷(肝豆?fàn)詈俗冃?、血色病、al_抗胰蛋白酶缺乏癥等)及化學(xué)代謝缺陷(慢性酒精性肝 病、慢性藥物性肝病)及自身免疫性肝炎、原發(fā)性肝汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎等。 肝纖維化肝臟遭到各種致病原侵襲時(shí)，引起肝臟損害與炎癥反應(yīng)，肝組織免疫系統(tǒng)同時(shí)被 激活，進(jìn)行組織修復(fù)。肝纖維化是指這種組織修復(fù)過程、過度及失控時(shí)，肝組織內(nèi)細(xì)胞外基 質(zhì)過度增生與異常沉積所致肝臟結(jié)構(gòu)和肝功能異常改變的一種病理過程。
[0003] HI型前膠原N端肽（ProcollagenHIN-terminal Peptide，PIIINP)是HI型前膠原在 細(xì)胞外形成原膠原前被內(nèi)切酶切下后進(jìn)入血循環(huán)的氨基端尾肽。完整的m型膠原肽主要由 肝臟通過竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被清除，而小片段則主要由腎臟排泄清除， 故膠原代謝活躍及肝功能損傷時(shí)，血液PHINP增高。PmNP在肝纖維化病人血液中水平的上 升與纖維化的活動(dòng)程度有伴隨關(guān)系，因此，pmNP被視為肝纖維化生成的血清學(xué)指標(biāo)。
[0004]傳統(tǒng)的pmNP檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法等。但酶聯(lián)免疫 法和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)時(shí)間長，主要依靠純手工加樣等系列繁瑣操作，效率低，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果 易誤差大，而酶促反應(yīng)不夠徹底，且易受外部干擾因素影響，如溫度、時(shí)間及材料濃度等，因 此檢測(cè)時(shí)特異性低、靈敏度差、檢測(cè)范圍窄。放射免疫法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏、特異、簡便易行、用 樣量少等，但試劑的半衰期段費(fèi)用較高，需要用閃爍計(jì)數(shù)儀等專門的設(shè)備，放射性核素對(duì)人 體存在著一定潛在的危害性，試驗(yàn)廢物處理困難，放射性核素標(biāo)記有時(shí)會(huì)改變某些生物物 質(zhì)的生理活性。因此，本領(lǐng)域亟需一種在保證靈敏度高、穩(wěn)定性好的同時(shí)操作更加簡便、迅 速，能夠借助分析儀器實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程全自動(dòng)化的測(cè)定試劑盒。
[0005] 專利200810102020.4公開了一種m型前膠原N端肽(PHINP)化學(xué)發(fā)光免疫分析定 量測(cè)定試劑盒及其制備方法。其包括:i)m型前膠原N端肽質(zhì)控品；2)包被有m型前膠原N端 肽的單克隆抗體的固相載體;3)m型前膠原N端肽的單克隆抗體酶標(biāo)記物;4)化學(xué)發(fā)光底 物；以及5)濃縮洗滌液。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟：1)以m 型前膠原N端肽純品配制m型前膠原N端肽質(zhì)控品；2)以m型前膠原N端肽的單克隆抗體包 被載體;3)以酶標(biāo)記m型前膠原N端肽的單克隆抗體;4)配制化學(xué)發(fā)光底物;5)配制濃縮洗 滌液;6)分裝上述m型前膠原N端肽質(zhì)控品、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物和濃縮洗滌液；以及7) 組裝為成品。該試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種具有高靈敏度和特異性，適合于臨床輔助診斷的微粒子 化學(xué)發(fā)光法m型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒及其制備方法。本發(fā)明是在酶免疫分析基礎(chǔ) 上結(jié)合高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)和磁性微粒分離技術(shù)，較其他方法有許多獨(dú)特的優(yōu) 點(diǎn)，首先它用順磁性微粒作為固相載體，由于顆粒體積小，表面積大，擴(kuò)大了反應(yīng)面積，大大 提高了靈敏度，其次由于使用全自動(dòng)儀器及配套試劑，使人為因素減至最低，提高了方法的 穩(wěn)定性和結(jié)果的重復(fù)性，同時(shí)也使得批內(nèi)差異與批間差異都較小。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 一種m型前膠原n端肽定量測(cè)定試劑盒，包括測(cè)pmNP磁微粒、測(cè)pmNP示蹤結(jié)合 物、質(zhì)控品，所述測(cè)pmNP磁微粒為標(biāo)記有m型前膠原n端肽單克隆抗體的磁性微球和磁微 粒保存液;測(cè)pmNP示蹤結(jié)合物為標(biāo)記有m型前膠原n端肽抗體的示蹤標(biāo)記物和示蹤結(jié)合物 稀釋液;質(zhì)控品為一低含量m型前膠原n端肽的溶液和一高含量m型前膠原n端肽的溶液， 用于測(cè)定儀內(nèi)儲(chǔ)存主曲線的校正。
[0009] 本發(fā)明是利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)定量測(cè)定人血漿中m型前膠原n端肽 的含量。在磁性微粒子上共價(jià)標(biāo)記m型前膠原n端肽抗體，加入待測(cè)樣本，第一步反應(yīng)形成 磁微粒標(biāo)記抗體-抗原結(jié)合物，與第二步反應(yīng)加入的示蹤標(biāo)記的m型前膠原n端肽抗體，形 成磁微粒標(biāo)記抗體-抗原-示蹤標(biāo)記抗體復(fù)合物，充分洗滌后，加入激發(fā)液，催化發(fā)光，相對(duì) 發(fā)光強(qiáng)度(RLU)與人血漿中pmNP含量呈正相關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出樣本中pmNP的 含量。
[0010]所述磁性微球?yàn)镕e2〇3或Fe3〇4磁性納米粒子與有機(jī)高分子材料的復(fù)合體。
[0011] 所述磁性微球通過表面改性而帶有一種或多種活性功能基團(tuán)，包括但不限于-OH，-C00H，-NH2，-CH0，-S0 3H 〇
[0012] 所述抗體為一種或多種單克隆抗體和/或多克隆抗體。
[0013] 所述示蹤標(biāo)記物為魯米諾和/或異魯米諾及其衍生物。
[0014] 所述質(zhì)控品中m型前膠原N端肽濃度為0. l-600ng/mL。
[0015] 所述磁微粒保存液和示蹤物稀釋液包括穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑，包含但不限 于TBS緩沖系統(tǒng)、HAC-NAC緩沖系統(tǒng)、PBS緩沖液系統(tǒng)、MES緩沖系統(tǒng)、HEPES緩沖系統(tǒng)，緩沖能 力為調(diào)節(jié)pH值6 ? 0-8 ? 5，濃度范圍為0 ? 01-0 ? 2mol/L。
[0016]所述穩(wěn)定劑為新生牛血清(NBS)、牛血清白蛋白（BSA)、酪蛋白（CS)、山梨醇、乙二 胺四乙酸(EDTA)中的至少一種；
[0017] 優(yōu)選所述穩(wěn)定劑包括0 ? 5-30 % NBS和/或BSA〇
[0018] 所述表面活性劑為吐溫系列、Triton X-100、CTAC中的至少一種；
[0019] 所述吐溫系列包括吐溫20(TWEEN-20)、吐溫21(TWEEN-21)、吐溫40(TWEEN-40)、吐 溫 60(TWEEN-60)、吐溫61(TWEEN-61)、吐溫 80(TWEEN-80)、吐溫 81(TWEEN-81)、吐溫 85 (TffEEN-85)〇
[0020] 優(yōu)選所述表面活性劑為濃度范圍為0.1-1 %的吐溫20。
[0021] 所述防腐劑選自硫柳汞、疊氮鈉、抗生素類、proclin中的至少一種;所述硫柳汞的 濃度不大于1%〇;所述疊氮鈉的濃度不大于1%〇;所述抗生素類包括慶大霉素等；所述 proclin的濃度不大于2%〇。
[0022] 穩(wěn)定劑可以提供良好穩(wěn)定反應(yīng)環(huán)境，使抗原/抗體保持天然構(gòu)象，可以選擇上述穩(wěn) 定劑其中一種。
[0023] 表面活性劑能夠在試劑加入到反應(yīng)體系時(shí)，降低表面張力，提高分散性和穩(wěn)定性。
[0024] -種所述m型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒的制備方法，具體步驟如下：
[0025] 1)磁微粒標(biāo)記PmNP抗體的制備
[0026] 將帶羧基的磁微粒與EDC分別按照1:1、1: 2、1:3的重量比例進(jìn)行混合后，按照每毫 克磁微粒分別加入PIIINP單抗15yg、20yg、25yg、30yg，分別在20 °C、23 °C、26 °C反應(yīng)1小時(shí)，加 入甘氨酸，使甘氨酸濃度達(dá)到25mM，反應(yīng)0.5小時(shí)，將標(biāo)記好的磁微粒保存在含1 %牛血清白 蛋白的0.01M PBS中，于2-8°C貯存；
[0027] 2)異魯米諾標(biāo)記PIIINP抗體的制備
[0028] 將異魯米諾加入PmNP抗體中標(biāo)記，戊二醛使用濃度分別為0.75%、1.0%、 1.25%、1.5%，按照每毫克抗體分別加入異魯米諾0.05mg、0.10mg、0.15mg、0.20mg，抗體與 異魯米諾的最佳標(biāo)記比例為1 〇 : 1，分別在20 °C、23 °C、26 °C反應(yīng)1.5小時(shí)，用PH7.2-7.4的 0.01M PBS透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放；
[0029] 3)測(cè)PmNP磁微粒的制備
[0030] 采用方陣滴定法確定磁微粒標(biāo)記pmNP抗體的最適工作濃度，用磁微粒保存液進(jìn) 行稀釋，混勻即得到測(cè)P mNP磁微粒，置2-8 °c存放；
[0031] 4)測(cè)PmNP示蹤結(jié)合物的制備
[0032] 采用方陣滴定法確定異魯米諾標(biāo)記PmNP抗體的最適工作濃度，用示蹤結(jié)合物稀 釋液進(jìn)行稀釋，混勻即得到測(cè)pmNP示蹤結(jié)合物，置2-8°c存放；
[0033] 5)質(zhì)控品的制備
[0034] 用質(zhì)控品稀釋液將PmNP純品稀釋成工作濃度，配成測(cè)定值為1.76-2.12ng/mL的 質(zhì)控品1和測(cè)定值為354.53-423.08ng/mL的質(zhì)控品2。
[0035] 進(jìn)一步的，所述m型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒的制備方法，具體步驟如下：
[0036] 1)磁微粒標(biāo)記PmNP抗體的制備
[0037] 將帶羧基的磁微粒與EDC 1:1、1: 2、1:3的重量比例，進(jìn)行混合后，分別按照每毫克 磁微粒加入PIIINP單抗15邱、20邱、25辟、30邱，分別在20°(：、23°(：、26°(：反應(yīng)1小時(shí)，加入甘氨 酸封閉EDC的多余的位點(diǎn)，使甘氨酸濃度達(dá)到25mM，分別在20°C、23°C、26°C反應(yīng)0.5小時(shí)，將 標(biāo)記好的磁微粒保存在含1 %牛血清白蛋白的0.01M PBS中，于2-8°C貯存；
[0038] 2)異魯米諾標(biāo)記PmNP抗體的制備
[0039] 將異魯米諾加入PmNP抗體中標(biāo)記，戊二醛使用濃度分別為0.75%、1.0%、 1.25%、1.5%，按照每毫克抗體分別加入異魯米諾0.05mg、0.10mg、0.15mg、0.20mg，抗體與 異魯米諾的最佳標(biāo)記比例為1 〇: 1，分別在20 °C、23 °C、26°C反應(yīng)1.5小時(shí)，用PH 7.2-7.4的 0.01M PBS透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放；
[0040] 3)測(cè)PmNP磁微粒的制備
[0041 ]采用方陣滴定法確定磁微粒標(biāo)記PmNP抗體的最適工作濃度，用磁微粒保存液進(jìn) 行稀釋，混勻即得到測(cè)P mNP磁微粒，置2-8 °c存放，
[0042] 磁微粒保存液的組成為:磷酸氫二鈉2.68g/L，磷酸二氫鈉0.39g/L，氯化鈉8.5g/ L，硫柳汞1. Og/L，牛血清白蛋白1 Og/L;
[0043] 4)測(cè)PmNP示蹤結(jié)合物的制備
[0044] 采用方陣滴定法確定異魯米諾標(biāo)記PIIINP抗體的最適工作濃度，用示蹤結(jié)合物稀 釋液進(jìn)行稀釋，混勻即得到測(cè)PmNP示蹤結(jié)合物，置2_8°C存放；
[0045] 示蹤結(jié)合物稀釋液組成為：磷酸氫二鈉2.68g/L，磷酸二氫鈉0.39g/L，氯化鈉 8 ? 5g/L，硫柳萊 1 ? Og/L，Tween-20 lmL/L，小牛血清200mL/L;
[0046] 5)質(zhì)控品的制備
[0047] 用質(zhì)控品稀釋液將PmNP純品稀釋成工作濃度，配成測(cè)定值為1.76-2.12ng/mL的 質(zhì)控品1和測(cè)定值為354.53-423.08ng/mL的質(zhì)控品2，
[0048]質(zhì)控品稀釋液配方為:磷酸氫二鈉2.68g/L，磷酸二氫鈉0.39g/L，氯化鈉8.5g/L， 硫柳汞1. Og/L，牛血清白蛋白10.0 g/L。
[0049] 本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是采用了微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，排除了人為和環(huán)境 的影響，提高了試劑精密度;用微粒子做固相載體，擴(kuò)大了反應(yīng)表面積，線性范圍更寬;全自 動(dòng)化，其操作更加簡便易行，同時(shí)本發(fā)明的試劑盒能夠與化學(xué)發(fā)光免疫分析儀尤其是系列 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(AutolumiS 500、AutolumiS 1000、AutolumiS 2000、AutolumiS 3000 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀)配套使用，在樣本測(cè)定過程中實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)化，使得濃度的檢測(cè)可 以簡單、方便、快速、批量地進(jìn)行，同時(shí)保證檢測(cè)的系統(tǒng)誤差較小。
【附圖說明】
[0050] 圖1為本發(fā)明試劑盒和北方生物試劑盒上的測(cè)定值進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果
【具體實(shí)施方式】 [0051 ] 實(shí)施例1
[0052] 1)磁微粒標(biāo)記PmNP抗體的制備
[0053] 將帶羧基的磁微粒與EDC 1:1、1: 2、1:3的重量比例，進(jìn)行混合后，分別按照每毫克 磁微粒加入PIIINP單抗15噸、20邱、25噸、30邱，分別在20°(：、23°(：、26°(：反應(yīng)1小時(shí)，加入一定 量甘氨酸封閉EDC的多余的位點(diǎn)，使之濃度達(dá)到25mM，分別在20°C、23°C、26°C反應(yīng)0.5小時(shí)。 將標(biāo)記好的磁微粒保存在含1 %牛血清白蛋白的0.01M PBS中，于2-8°C貯存；
[0054] 2)異魯米諾標(biāo)記PmNP抗體的制備
[0055] 將異魯米諾加入PmNP抗體中標(biāo)記，戊二醛使用濃度分別為0.75%、1.0%、 1.25%、1.5%，按照每毫克抗體分別加入異魯米諾0.05mg、0.10mg、0.15mg、0.20mg，抗體與 異魯米諾的最佳標(biāo)記比例為1 〇 : 1，分別在20 °C、23 °C、26 °C反應(yīng)1.5小時(shí)，用PH7.2-7.4的 0.01M PBS透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放；
[0056] 3)測(cè)PmNP磁微粒的制備
[0057] 采用方陣滴定法確定磁微粒標(biāo)記PmNP抗體的最適工作濃度，用磁微粒保存液進(jìn) 行稀釋，混勻即得到測(cè)P MNP磁微粒，置2-8 °C存放；
[0058] 磁微粒保存液的主要組成為：磷酸氫二鈉2.68g/L，磷酸二氫鈉0.39g/L，氯化鈉 8.5g/L，硫柳汞1.0g/L，牛血清白蛋白10g/L;
[0059] 4)測(cè)PIIINP示蹤結(jié)合物的制備
[0060]采用方陣滴定法確定異魯米諾標(biāo)記pmNP抗體的最適工作濃度，用示蹤結(jié)合物稀 釋液進(jìn)行稀釋，混勻即得到測(cè)pmNP示蹤結(jié)合物，置2-8°c存放；
[00611示蹤結(jié)合物稀釋液主要組成為:磷酸氫二鈉2.68g/L，磷酸二氫鈉0.39g/L，氯化鈉 8 ? 5g/L，硫柳萊 1 ? Og/L，Tween-20 lmL/L，小牛血清200mL/L;
[0062] 5)質(zhì)控品的制備
[0063]用質(zhì)控品稀釋液將PIIINP純品稀釋成工作濃度，配成質(zhì)控品1(低值質(zhì)控品）和質(zhì)控 品2(高值質(zhì)控品）。質(zhì)控品測(cè)定值應(yīng)在范圍之內(nèi)（質(zhì)控品1:1.76-2.12ng/mL;質(zhì)控品2 : 354.53-423.08ng/mL)；
[0064]質(zhì)控品稀釋液配方:磷酸氫二鈉2.68g/L，磷酸二氫鈉0.39g/L，氯化鈉8.5g/L，硫 柳萊1 .Og/L，牛血清白蛋白10.0g/L。
[0065] 本發(fā)明上述各種原材料的選擇要求如下：
[0066] 磁微粒標(biāo)記用m型前膠原N端肽抗體的選擇
[0067] 首先就抗體的外觀、濃度、純度、效價(jià)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果抗體為微帶乳光的澄清液體， 無肉眼可見異物，無搖不散的沉淀，用紫外吸收法檢測(cè)其蛋白含量應(yīng)不低于2.Omg/mL，效價(jià) 應(yīng)不低于標(biāo)示效價(jià)且不低于1:10000，SDS-PAGE檢測(cè)純度應(yīng)主帶清晰，無明顯雜帶。
[0068] 異魯米諾標(biāo)記用m型前膠原N端肽單克隆抗體的選擇
[0069]首先仍就抗體的外觀、濃度、純度、效價(jià)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果抗體為微帶乳光的澄清液 體，無肉眼可見異物，無搖不散的沉淀，用紫外吸收法檢測(cè)其蛋白含量應(yīng)不低于2.0mg/mL， 效價(jià)應(yīng)不低于標(biāo)示效價(jià)且不低于l:l〇〇〇〇，SDS-PAGE檢測(cè)純度應(yīng)主帶清晰，無明顯雜帶，研 究結(jié)果表明另一株m型前膠原N端肽單克隆抗體也完全可用于本發(fā)明試劑盒的制備。
[0070]磁微粒的選擇
[0071 ]通過對(duì)磁微粒的外觀，標(biāo)記蛋白的比率，磁響應(yīng)性，磁微粒吸附一致性等方面進(jìn)行 分析，經(jīng)過多次分析研究，將磁微?；靹?，在燈光下觀察，易分散，無聚集，無異物;將蛋白采 用不同的方法進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記率應(yīng)大于90 % ;將磁微粒置370-380特斯拉的磁鐵上，觀察磁 微粒的聚集速度，分散均勻的磁微粒在10秒鐘內(nèi)完全聚集;磁微粒吸附一致性CVS 10%。研 究結(jié)果表明直徑為0.90-1. lOwii的磁微粒，含有羧基基團(tuán)，標(biāo)記率最高，可用于本發(fā)明診斷 試劑盒的制備。
[0072]異魯米諾的選擇
[0073] 將異魯米諾用DMS0(二甲基亞砜)進(jìn)行溶解，用純化水進(jìn)行稀釋至1.2X10-5M/L的 量，加入1〇此異魯米諾液體，各加入200yL激發(fā)液，測(cè)定其發(fā)光值，發(fā)光值應(yīng)多160000，經(jīng)過 研究，采用Sigma Aldrich提供的異魯米諾作為發(fā)光的原料。
[0074]清洗液、激發(fā)A液、激發(fā)B液的配制
[0075]清洗液的主要成分為：磷酸氫二鈉28.6g/L、磷酸二氫鈉3.9g/L、氯化鈉160g/L、 Tween20 10mL/L，用純化水按照10倍稀釋使用。激發(fā)A液為含有0 ? 35mol/L NaOH的溶液（其 中含有ImM的鐵氰化鉀），激發(fā)B液為含有1.32%w/v H2〇2的的緩沖液。
[0076] 反應(yīng)體系的選擇
[0077] 采用一步法和兩步法對(duì)比不同樣本用量和試劑用量檢測(cè)結(jié)果的差異，以確定試劑 盒的反應(yīng)體系。樣本為高Ph、中Pm、低值樣本Pl以及陰性樣本N。一步法加入樣本50-150yL、示 蹤結(jié)合物50-150此和磁微粒20yL，溫育10分鐘，洗滌后，加入激發(fā)液進(jìn)行測(cè)定;兩步法先加 入樣本50-150yL和磁微粒20此，溫育10分鐘，再加入測(cè)PmNP示蹤結(jié)合物50-150此，再溫育 10分鐘，經(jīng)清洗液洗滌后，加入激發(fā)A液和激發(fā)B液進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次試驗(yàn)，計(jì)算P/N，選擇 P/N值最大者為佳。
[0078]表1樣本和示蹤結(jié)合物用量
[0081 ] 表2反應(yīng)模式
[0083]由表1、表2可以得到，具體加樣方法如下：100yL樣本、20yL測(cè)PmNP磁微粒、100yL 測(cè)PmNP示蹤結(jié)合物，37 °C孵育10分鐘，再用稀釋后的清洗液洗滌3次，最終分別加入200yL 激發(fā)A液和激發(fā)B液，測(cè)定發(fā)光值。
[0084]本試劑盒的方法學(xué)評(píng)價(jià)方法
[0086]相關(guān)性分析
[0087]本發(fā)明試劑盒臨床考核結(jié)果:河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、河南中醫(yī)學(xué)院第三附 屬醫(yī)院兩家醫(yī)院臨床考核，檢測(cè)結(jié)果如表5、表6所不：
[0088] 表5:河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院PIIINP檢測(cè)結(jié)果
[0090] 表6:河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院PmNP檢測(cè)結(jié)果
[0093]河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兩試劑盒對(duì)128例臨床樣本檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r = 0.9894，從相關(guān)系數(shù)及檢驗(yàn)結(jié)果來看，本發(fā)明試劑盒與北方生物的試劑盒相關(guān)性良好。 [0094]河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院兩試劑盒對(duì)120例臨床樣本檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r = 0.9888，從相關(guān)系數(shù)及檢驗(yàn)結(jié)果來看，本發(fā)明試劑盒與北方生物的試劑盒相關(guān)性良好。
[0095]對(duì)248份臨床樣本在本發(fā)明試劑盒和北方生物試劑盒上的測(cè)定值進(jìn)行相關(guān)性分 析，分別以北方生物檢測(cè)值和威高檢測(cè)值為X/Y坐標(biāo)，繪制坐標(biāo)圖1所示。
[0096] 采用線性回歸對(duì)兩試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，回歸方程為y=1.2891x+ 7.0539，相關(guān)系數(shù)r = 0.9770;從相關(guān)系數(shù)及回歸方程來看，本發(fā)明試劑盒與北方生物試劑 盒相關(guān)性良好。
[0097] 本實(shí)例的工作過程:m型前膠原n端肽定量測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品中m型前膠原N端 肽的檢測(cè)方法是:首先取出清洗液，用純化水按照10倍進(jìn)行稀釋。而后取出激發(fā)A液和B液， 放置全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀合適的位置。然后將試劑盒從冰箱中取出后，放于儀器試劑區(qū) 至少混勻30分鐘后方可使用，并嚴(yán)格按照設(shè)定的程序進(jìn)行加樣和溫育。
[0098] 以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例， 不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請(qǐng)范圍所作的均等變化與改進(jìn)等， 均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種m型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒，包括測(cè)ΡΙΠΝΡ磁微粒、測(cè)ΡΙΠΝΡ示蹤結(jié)合物、 質(zhì)控品，其特征在于:所述測(cè)ΡΙΠΝΡ磁微粒為標(biāo)記有m型前膠原Ν端肽單克隆抗體的磁性微 球和磁微粒保存液;測(cè)ΡΙΠΝΡ示蹤結(jié)合物為標(biāo)記有m型前膠原N端肽抗體的示蹤標(biāo)記物和示 蹤結(jié)合物稀釋液;質(zhì)控品為一低含量m型前膠原N端肽的溶液和一高含量m型前膠原N端肽 的溶液，用于測(cè)定儀內(nèi)儲(chǔ)存主曲線的校正。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種m型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒，其特征在于:所述磁 性微球?yàn)镕e2〇3或Fe3〇4磁性納米粒子與有機(jī)高分子材料的復(fù)合體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種m型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒，其特征在于:所述磁 性微球通過表面改性而帶有一種或多種活性功能基團(tuán)，包括但不限于-oh，-cooh，-nh 2，-cho，-s〇3h〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種m型前膠原Ν端肽定量測(cè)定試劑盒，其特征在于:所述抗 體為一種或多種單克隆抗體和/或多克隆抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的一種m型前膠原Ν端肽定量測(cè)定試劑盒，其特征在 于:所述示蹤標(biāo)記物為魯米諾和/或異魯米諾及其衍生物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種m型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒，其特征在于:所述磁 微粒保存液和示蹤物稀釋液包括穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑，包含但不限于TBS緩沖系統(tǒng)、 HAC-NAC緩沖系統(tǒng)、PBS緩沖液系統(tǒng)、MES緩沖系統(tǒng)、HEPES緩沖系統(tǒng)，其緩沖能力為調(diào)節(jié)pH值 6.0-8.5、濃度范圍為0.01-0.2111〇1/1。7. -種權(quán)利要求5所述m型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒的制備方法，其特征在于：具 體步驟如下： 1) 磁微粒標(biāo)記ΡΙΠΝΡ抗體的制備 將帶羧基的磁微粒與EDC分別按照1:1、1:2、1:3的重量比例進(jìn)行混合后，按照每毫克磁 微粒分別加入ΡΙΠΝΡ單抗15yg、20yg、25yg、30yg，分別在20 °C、23 °C、26 °C反應(yīng)1小時(shí)，加入甘 氨酸，使甘氨酸濃度達(dá)到25mM，反應(yīng)0.5小時(shí)，將標(biāo)記好的磁微粒保存在含1 %牛血清白蛋白 的0.01M PBS中，于2-8°C貯存； 2) 異魯米諾標(biāo)記ΡΙΠΝΡ抗體的制備 將異魯米諾加入ΡΙΠΝΡ抗體中標(biāo)記，戊二醛使用濃度分別為0.75 %、1.0 %、1.25 %、 1.5 %，按照每毫克抗體分別加入異魯米諾0.05mg、0.10mg、0.15mg、0.20mg，抗體與異魯米 諾的最佳標(biāo)記比例為10:1，分別在20°C、23°C、26°C反應(yīng)1.5小時(shí)，用PH7.2-7.4的0.01M PBS 透析，透析后加入等體積甘油-20 °C存放； 3) 測(cè)ΡΙΠΝΡ磁微粒的制備 采用方陣滴定法確定磁微粒標(biāo)記ΡΙΠΝΡ抗體的最適工作濃度，用磁微粒保存液進(jìn)行稀 釋，混勻即得到測(cè)ΡΙΠΝΡ磁微粒，置2-8 °C存放； 4) 測(cè)ΡΙΠΝΡ示蹤結(jié)合物的制備 采用方陣滴定法確定異魯米諾標(biāo)記ΡΙΠΝΡ抗體的最適工作濃度，用示蹤結(jié)合物稀釋液 進(jìn)行稀釋，混勻即得到測(cè)ΡΙΠΝΡ示蹤結(jié)合物，置2-8°C存放； 5) 質(zhì)控品的制備 用質(zhì)控品稀釋液將ΡΙΠΝΡ純品稀釋成工作濃度，配成測(cè)定值為1.76-2.12ng/mL的質(zhì)控 品1和測(cè)定值為354.53-423.08ng/mL的質(zhì)控品2。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述m型前膠原N端肽定量測(cè)定試劑盒的制備方法，其特征在于：具 體步驟如下： 1) 磁微粒標(biāo)記ΡΙΠΝΡ抗體的制備 將帶羧基的磁微粒與EDC 1:1、1:2、1:3的重量比例，進(jìn)行混合后，分別按照每毫克磁微 粒加入ΡΙΠΝΡ單抗15以8、2(^8、25以8、3(^8，分別在20°(：、23°(：、26°(：反應(yīng)1小時(shí)，加入甘氨酸封 閉H)C的多余的位點(diǎn)，使甘氨酸濃度達(dá)到25mM，分別在20°C、23°C、26°C反應(yīng)0.5小時(shí)，將標(biāo)記 好的磁微粒保存在含1 %牛血清白蛋白的0.01M PBS中，于2-8°C貯存； 2) 異魯米諾標(biāo)記ΡΙΠΝΡ抗體的制備 將異魯米諾加入ΡΙΠΝΡ抗體中標(biāo)記，戊二醛使用濃度分別為0.75 %、1.0 %、1.25 %、 1.5 %，按照每毫克抗體分別加入異魯米諾0.05mg、0.10mg、0.15mg、0.20mg，抗體與異魯米 諾的最佳標(biāo)記比例為10:1，分別在2 0 °C、2 3 °C、2 6 °C反應(yīng)1.5小時(shí)，用Ρ Η 7.2 - 7.4的0.01Μ PBS透析，透析后加入等體積甘油-20 °C存放； 3) 測(cè)ΡΙΠΝΡ磁微粒的制備 采用方陣滴定法確定磁微粒標(biāo)記ΡΙΠΝΡ抗體的最適工作濃度，用磁微粒保存液進(jìn)行稀 釋，混勻即得到測(cè)ΡΙΠΝΡ磁微粒，置2-8 °C存放， 磁微粒保存液的組成為:磷酸氫二鈉2.68g/L，磷酸二氫鈉0.39g/L，氯化鈉8.5g/L，硫 柳汞1. Og/L，牛血清白蛋白1 Og/L; 4) 測(cè)ΡΙΠΝΡ示蹤結(jié)合物的制備 采用方陣滴定法確定異魯米諾標(biāo)記ΡΙΠΝΡ抗體的最適工作濃度，用示蹤結(jié)合物稀釋液 進(jìn)行稀釋，混勻即得到測(cè)ΡΙΠΝΡ示蹤結(jié)合物，置2-8°C存放； 示蹤結(jié)合物稀釋液組成為:磷酸氫二鈉2.68g/L，磷酸二氫鈉0.39g/L，氯化鈉8.5g/L， 硫柳萊 1 .Og/L，Tween-20 lmL/L，小牛血清200mL/L; 5) 質(zhì)控品的制備 用質(zhì)控品稀釋液將ΡΙΠΝΡ純品稀釋成工作濃度，配成測(cè)定值為1.76-2.12ng/mL的質(zhì)控 品1和測(cè)定值為354.53-423.08ng/mL的質(zhì)控品2， 質(zhì)控品稀釋液配方為:磷酸氫二鈉2.68g/L，磷酸二氫鈉0.39g/L，氯化鈉8.5g/L，硫柳 萊1.0g/L，牛血清白蛋白10.0g/L。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK106053826SQ201610319249
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】蒙紅勝, 喬文革, 吳晗琪, 王凌凌, 王文艷
【申請(qǐng)人】威海威高生物科技有限公司