專利名稱：配對(duì)基因表達(dá)比值測定法及熒光比值測定儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)上的配對(duì)基因表達(dá)比值檢測方法及與此相配的檢測儀。直接用配對(duì)基因表達(dá)比值數(shù)據(jù)提供臨床，研究相對(duì)應(yīng)基因表達(dá)調(diào)節(jié)水平比值和疾病的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究和實(shí)踐中，檢測基因表達(dá)水平越來越運(yùn)用廣泛?；虮磉_(dá)是基因所貯存遺傳信息的表達(dá)，包括基因被激活后轉(zhuǎn)錄成信使RNA，再翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程。基因表達(dá)有其特定的規(guī)律，并受到機(jī)體各種因素的調(diào)節(jié)和控制，基因表達(dá)異常和失衡，常和一些疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。由于蛋白質(zhì)檢測方法復(fù)雜，儀器昂貴以及檢測敏感性的限制，轉(zhuǎn)而作基因RNA檢測同樣也能反應(yīng)其蛋白質(zhì)表達(dá)水平。雖然現(xiàn)有基因芯片檢測技術(shù)是當(dāng)今科學(xué)界研究基因表達(dá)水平最為強(qiáng)有力的工具之一。然而常規(guī)高通量基因芯片需要復(fù)雜的制作工藝和昂貴的儀器，操作復(fù)雜，檢測結(jié)果一般只能定性，因而大大限制了基因芯片技術(shù)在臨床診治中的應(yīng)用?，F(xiàn)臨床上常應(yīng)用RT-PCR定量進(jìn)行基因診斷，已經(jīng)商品化的基因定量方法首推實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time PCR)法。方法簡易精確，并具有高靈敏度和特異性。常用的有Taqman探針技術(shù)以及其他探針標(biāo)記及熒光染料滲和等各種檢測方法。檢測機(jī)體細(xì)胞的某種基因表達(dá)水平和檢測某種病原菌特異性基因不同，由于檢測細(xì)胞基因表達(dá)受采集的細(xì)胞數(shù)量，RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄的效果等諸多因素影響，因此需要用另一表達(dá)恒定，細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的，幾乎在所有的組織細(xì)胞內(nèi)或發(fā)育階段均表達(dá)，很少受外界環(huán)境影響的看家基因作為平行對(duì)照。該方法有以下不足①看家基因也會(huì)受某些因素影響，表達(dá)不一定恒定。②各自建立標(biāo)準(zhǔn)，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)誤差大。某些疾病的發(fā)生，發(fā)展和多個(gè)基因表達(dá)水平相關(guān)，往往是某些基因表達(dá)水平為上調(diào)，而某些基因表達(dá)水平為下調(diào)，并且這二種相對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)水平的比例和疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將提供一種直接檢測基因表達(dá)比值的測定方法及與此相配的檢測儀，直接提供比值數(shù)據(jù)于臨床。將傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR由檢測某目的基因和看家基因二者定量拷貝數(shù)之比作為目的基因表達(dá)水平方式改變?yōu)橹苯佑媚康幕虮戎禐闃?biāo)準(zhǔn)，通過熒光信號(hào)強(qiáng)度之比，計(jì)算二種基因比值；以二種及二種以上目的基因比值作為報(bào)告方式。該方法由于用同一種模板作基因擴(kuò)增，不用看家基因，根據(jù)檢測儀熒光信號(hào)強(qiáng)弱，直接報(bào)告二種基因之比值。檢測數(shù)據(jù)不受細(xì)胞數(shù)量，RNA提取濃度及逆轉(zhuǎn)錄的效果等諸多因素影響，從而解決檢測基因RNA表達(dá)水平，始終找不到精確的標(biāo)準(zhǔn)方法之困惑。開創(chuàng)出運(yùn)用基因表達(dá)比值對(duì)各種疾病診治的一種新理念，研究某一疾病二個(gè)相對(duì)應(yīng)或多個(gè)相對(duì)應(yīng)基因表達(dá)比值變化，去觀察和揭示疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律。檢測儀具有能根據(jù)檢測配對(duì)目的基因cDNA不同比例系列標(biāo)準(zhǔn)之間的熒光信號(hào)強(qiáng)度之比，對(duì)樣本配對(duì)目的基因cDNA的比值進(jìn)行分析，直接報(bào)告的功能。
具體實(shí)施例方式完成上述發(fā)明任務(wù)的方案如下①相對(duì)應(yīng)基因表達(dá)比值的測定方法選擇已確定有臨床意義相對(duì)應(yīng)基因比值(如CD4和CD8可分別代表CD4陽性T細(xì)胞和CD8陽性T細(xì)胞)及理論和相關(guān)實(shí)驗(yàn)確定為相對(duì)應(yīng)基因，但尚無比值變化數(shù)據(jù)(比例失衡與臨床疾病相關(guān)，如IL2和IL4可分別代表Th1T細(xì)胞和Th2T細(xì)胞)或理論上成立而無相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定，尚有待于證實(shí)的基因進(jìn)行配對(duì)，作其比值變化研究。其方法為細(xì)胞RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法作基因擴(kuò)增，用相對(duì)應(yīng)的目的基因cDNA不同比例系列比值作標(biāo)準(zhǔn)，通過本發(fā)明相配套的具備有實(shí)時(shí)檢測各熒光信號(hào)強(qiáng)度作比值處理功能的熒光比值測定儀，直接計(jì)算出配對(duì)基因表達(dá)比值。②熒光比值測定儀將現(xiàn)有的熒光定量測定儀進(jìn)行設(shè)計(jì)改進(jìn)，除能提供波長調(diào)節(jié)，能對(duì)一個(gè)反應(yīng)體系作多種熒光及二種及二種以上反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)功能外，尚有對(duì)多種熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱作比值處理，直接報(bào)告比值；并對(duì)配對(duì)目的基因cDNA比值進(jìn)行分析的功能；有建立和貯存各種配對(duì)基因比值在各種免疫性疾病、腫瘤、傳染病、內(nèi)分泌等疾病中診斷、治療的臨床數(shù)據(jù)資料庫，并將此數(shù)據(jù)提供臨床的功能。繼而開創(chuàng)出運(yùn)用基因表達(dá)比值對(duì)各種疾病診治的一種新理念，從而進(jìn)一步推動(dòng)醫(yī)學(xué)向前發(fā)展。
權(quán)利要求
1.配對(duì)基因表達(dá)比值測定法及熒光比值測定儀其方法為細(xì)胞RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，不用看家基因，以二種目的基因比值為標(biāo)準(zhǔn)，用熒光比值測定儀檢測，通過熒光信號(hào)強(qiáng)度之比，計(jì)算二種及二種以上基因比值；以目的基因比值作為報(bào)告方式。(該儀器除有的熒光定量測定儀能提供波長調(diào)節(jié)，對(duì)一個(gè)反應(yīng)體系作多種熒光及二種及二種以上反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)功能外，尚有對(duì)多種熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱作比值處理，直接報(bào)告比值；并對(duì)配對(duì)目的基因cDNA比值進(jìn)行分析的功能；有建立和貯存各種配對(duì)基因比值在各種疾病中診斷、治療的臨床數(shù)據(jù)資料庫，并將此數(shù)據(jù)提供臨床的功能。)
2.按照權(quán)利要求1所述，配對(duì)基因表達(dá)比值測定法其特點(diǎn)是不用看家基因，以二種目的基因比值為標(biāo)準(zhǔn)，檢測RNA基因表達(dá)以二種及二種以上基因比值作為檢測報(bào)告方式。
3.按照權(quán)利要求1所述，熒光比值測定儀其特點(diǎn)是比實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測儀多二種及二種以上基因比值檢測、報(bào)告、分析、貯存功能。
全文摘要
配對(duì)基因表達(dá)比值測定法及熒光比值測定儀，該方法是用同一種模板作基因擴(kuò)增，不用看家基因，以二種目的基因比值為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)檢測儀熒光信號(hào)強(qiáng)弱，直接報(bào)告二種基因之比值。熒光比值測定儀除能對(duì)一個(gè)反應(yīng)體系作多種熒光及二種及二種以上反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)功能外，尚有對(duì)多種熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱作比值處理，直接報(bào)告比值的功能，有配對(duì)目的基因cDNA比值進(jìn)行分析的功能；有建立和貯存各種配對(duì)基因比值在各種免疫性疾病中診斷、治療的臨床數(shù)據(jù)資料庫。研究某一疾病二個(gè)相對(duì)應(yīng)或多個(gè)相對(duì)應(yīng)基因表達(dá)比值變化，去觀察和揭示疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律，開創(chuàng)一種運(yùn)用基因表達(dá)比值對(duì)各種疾病診治的新理念。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1865452SQ20061003793
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2006年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月23日
發(fā)明者王禮文 申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)院