專利名稱：電泳選擇林木植物抗病細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬林木遺傳育種領(lǐng)域林木遺傳育種按傳統(tǒng)方法主要是進行雜交和選擇，這是一種系統(tǒng)工程，要耗費大量的人力、物力、財力和時間。林木抗病育種也主要在林地間進行選擇抗病單株，由于林地間選擇常受年份、氣候、病發(fā)率、癥狀、親本的變異性、交叉感染等各種復(fù)雜因素的影響，選育抗病品系也是十分困難的。油茶是中國亞熱帶地區(qū)主要的木本油料樹種，炭疽病是危害油茶的主要病害，一般年份病害減產(chǎn)20～30％，嚴(yán)重病發(fā)年份往往造成油茶林木大面積毀滅，以往雖然在林地間選擇了不少抗病單株并擴繁成抗病品系，由于抗病性狀不穩(wěn)定，實際在生產(chǎn)中保存下來的很少。
本發(fā)明在林木植物抗病生理生化機制研究的基礎(chǔ)上，利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)操作在時間和空間上的優(yōu)勢，電泳選擇抗病單細(xì)胞，建立抗病單細(xì)胞克隆，進一步分化再生抗病植株，為林木抗病育種提供了快速有效地新技術(shù)方法。
本發(fā)明是利用細(xì)胞電泳技術(shù)選擇抗病細(xì)胞系，許多木本植物是自花不育、異花受粉的，從林地間采取幼嫩組織作外植體進行組織培養(yǎng)，由愈傷組織制備的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物其中有各種基因細(xì)胞，選擇幾率是較高的，能夠選擇出抗病表型細(xì)胞。
本發(fā)明利用寄主懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的病原菌毒素模擬寄主與病原菌的相互作用，在其相互作用下，抗病表型細(xì)胞均表現(xiàn)為pH改變酸性pH，pH緩沖能力顯著增強，堿滴度增高，而感病型細(xì)胞pH基本無改變，既有差別就可以進行分離和選擇出抗病型細(xì)胞系。
本發(fā)明目的是選擇林木抗病細(xì)胞系，建立抗病單細(xì)胞克隆，再進一步分化再生抗病植株。本發(fā)明主要包括四部分內(nèi)容。1、分離純化病原菌，進行病原菌純培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生病原菌毒素，將病原菌毒素進行分離和純化，貯存?zhèn)溆谩?、林地間采集寄主幼嫩組織作外植體進行組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化愈傷組織，由愈傷組織制備懸浮細(xì)胞，建立單細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。3、將病原菌毒素加入寄主單細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，誘發(fā)寄主細(xì)胞抗病表型，抗病型細(xì)胞pH由中堿性pH轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝詐H。4、在電泳池進行細(xì)胞電泳，分離和選擇具有酸性pH的抗病表型細(xì)胞。酸性pH抗病表型細(xì)胞攜帶的電荷多，在電泳池中遷移速率大，快速泳向陰極。感病型細(xì)胞為中堿性pH，攜帶的電荷少，在電泳池中遷移速率小。根據(jù)遷移速率把抗病表型細(xì)胞分離選擇出來，放入新鮮培養(yǎng)基中，經(jīng)稀釋脫去病原菌毒素后，再進行單細(xì)胞培養(yǎng)，建立抗病單細(xì)胞克隆。
實例1油茶炭疽病菌Collefortrichum camelliae Massee單孢子系分離自油茶林病株上的病枝梭狀皰，分離出的C.camelliae在10％(w/v)油茶籽煎煮液培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后收集分生孢子，然后把孢子懸液(6×105個/ml)接種在改良的Czapek-Dox培養(yǎng)液(NaNO30.3％、K2HPO40.1％、KCl 0.05％、MgSO4.7H2O0.05％、FeSO4.7H2O 0.01％、蔗糖2％、pH6.5)中，24～28℃振蕩(90次/分鐘)培養(yǎng)14天，離心或過濾收集培養(yǎng)濾液于4℃冰箱中。取500ml培養(yǎng)濾液加入1000ml-15℃冰凍丙酮，4000rpm離心15分鐘，棄去沉淀，上清液繼續(xù)加入1500ml冰凍丙酮，4000rpm離心15分鐘，收集沉淀，丙酮洗滌2～3次。將沉淀溶于少量水中使?jié)舛认喈?dāng)于10mg/ml葡萄糖，上強堿性陰離子交換樹脂(強堿201)柱(28×2.4cm)，洗脫液經(jīng)PEG10000吸水濃縮，調(diào)整濃度相當(dāng)于10mg/ml葡萄糖，再上強酸性陽離子交換樹脂(強酸732)柱，蒸餾水洗脫，洗脫液濃縮至相當(dāng)于1mg/ml葡萄糖，上預(yù)先以50mM NaCl平衡過的Sephadex G-50柱(55×2cm)，50mM NaCl洗脫，分部收集，合并Molish反應(yīng)陽性部分，PEGl0000吸收濃縮至小體積，透析脫鹽，60℃空氣干燥，即得純化的C.camelliae毒素備用。實例2林地間采集油茶新發(fā)的嫩枝，去掉葉片，嫩枝截成1～1.5cm切段，經(jīng)消毒滅菌后接種在MS培養(yǎng)基上，MS含2.4-D2mg/L、NAA 1mg/L、肌醇100mg/L、煙酸0.5mg/L、Vit.B10.5ml/L、Vit.B60.5ml/L、甘氨酸2ml/L、蔗糖30000mg/L，pH調(diào)到6.5，25℃中培養(yǎng)，2周后切段兩端形成愈傷組織，4周后轉(zhuǎn)移到新鮮MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長。取旺盛生長的愈傷組織團塊放入懸浮細(xì)胞制備液中。該制備液由MS培養(yǎng)液和果膠酶1％組成，pH調(diào)至4.5，并經(jīng)過超濾滅菌。制備液在35℃保溫2～4小時，并不停振蕩，然后經(jīng)200目尼龍布過濾，濾液經(jīng)5000rpm離心，分離沉淀單細(xì)胞，并用無菌MS培養(yǎng)液洗滌2～3次，然后重新懸浮于MS培養(yǎng)液中，顯微鏡檢查單細(xì)胞率在95％以上。實例3制作細(xì)胞電泳裝置，玻璃電泳槽100×10×10mm銀電極插入鹽橋?qū)Ч苤?，左端裝上陽極，右端裝上陰極，連接直流穩(wěn)壓電源固定在顯微鏡載物臺上。電泳槽中裝約10ml MS培養(yǎng)液，另外加蔗糖使?jié)舛葹?.3～0.5M，防止細(xì)胞沉降槽底，使細(xì)胞接近質(zhì)壁分離狀態(tài)。
將實例2中制備的懸浮細(xì)胞制備液細(xì)胞數(shù)調(diào)整到106～108個/ml，加入實例1制備的C.camelliae病原菌毒素，使其濃度為10～100μg/ml，用染色法顯微鏡檢測細(xì)胞對毒素發(fā)生反應(yīng)的時間進程和最低濃度范圍。在毒素濃度40～250μg/ml范圍內(nèi)施加毒素14～16小時后約有2～6‰的細(xì)胞pH改變?yōu)樗嵝?，在毒素濃?00～650μg/ml范圍內(nèi)施加毒素4～6小時后即有12～20％的細(xì)胞死亡。懸浮細(xì)胞制備液中加入適量病源菌毒素，并進行了一段反應(yīng)時間后，離心沉降，用毛細(xì)管移入電泳池陽極近處，進行電泳分離電泳電壓110～660V約50～60分鐘后顯微鏡視野中有細(xì)胞出現(xiàn)，再繼續(xù)電泳20～40分鐘收集早先泳向陰極的細(xì)胞，選擇出抗病細(xì)胞系。分離選擇抗病細(xì)胞系的全部操作都是無菌狀態(tài)下進行的。實例4將電泳選擇出來的細(xì)胞系按通常的平板法、懸浮法或看護法進行單細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有2.4-D 1mg/L、NAA 0.5mg/L、BA 0.5g/mL、清蛋白1％的MS培養(yǎng)基，盡可能增加細(xì)胞密度，25℃弱光下保溫培養(yǎng)，48小時后可啟動分裂增殖，繼續(xù)培養(yǎng)建立單細(xì)胞克隆。實例5將油茶炭疽病菌毒素加入實例4培養(yǎng)基中，使?jié)舛葹?00μg/ml，48小時后用染色法檢查，細(xì)胞pH轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝詐H(5.2～5.6)，測定β-糖苷酶和苯丙氨酸解氨酶活性，這兩種酶的活性分別提高了4～6倍和3～5倍，顯示了抗病的生化特征。
本發(fā)明用電泳技術(shù)分離選擇林木抗病表型細(xì)胞，建立抗病單細(xì)胞克隆，再進一步分化再生抗病植株，這就克服了傳統(tǒng)的抗病育種方法所遇到的種種困難，在短時間內(nèi)可獲得抗病新品系，大大節(jié)省了時間、人力、物力和財力。
權(quán)利要求
1.林木植物抗病育種新方法，分離選擇抗病細(xì)胞系，建立抗病單細(xì)胞克隆，誘導(dǎo)再生抗病植株，其特征在于(1)不是以病原菌毒素作為選擇壓力，而是利用病原菌毒素刺激誘導(dǎo)細(xì)胞抗病表型，分離和選擇具抗病表型的細(xì)胞；(2)病原菌毒素刺激誘導(dǎo)的抗病細(xì)胞表型是細(xì)胞pH改變?yōu)樗嵝詐H范圍；(3)電泳法分離選擇抗病表型細(xì)胞，酸性pH的抗病表型細(xì)胞攜帶電荷多遷移速率大，率先泳向陰極而與非抗病表型細(xì)胞分離開，而選擇出抗病表型細(xì)胞；(4)選擇出的抗病表型細(xì)胞經(jīng)微型細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)建立抗病單細(xì)胞克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法其特征在于所說的林木病害包括真菌病、細(xì)菌病和病毒等產(chǎn)生毒素的病害。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的林木細(xì)胞抗病表型為細(xì)胞pH改變?yōu)樗嵝詐H或堿性pH。
4.根據(jù)權(quán)利求1所述的方法，其特征在于能夠用電泳技術(shù)分離和選擇抗病表型細(xì)胞的林木抗病育種方法。
全文摘要
本發(fā)明屬林木植物抗病育種新技術(shù)。本發(fā)明提供一種分離和選擇林木抗病細(xì)胞的新方法，它不是以病原菌毒素作為選擇壓力，選擇耐受毒素的存活細(xì)胞。本發(fā)明提供的林木植物抗病育種新方法包括:1.分離和培養(yǎng)林木病原菌，制備病原菌毒素。2.由林木植物愈傷組織制備懸浮單細(xì)胞系統(tǒng)中加入低濃度病原菌毒素，誘導(dǎo)抗病細(xì)胞表型，抗病型細(xì)胞在毒素作用下改變?yōu)樗嵝詐H。4.進行電泳分離和選擇酸性pH細(xì)胞，酸性pH細(xì)胞攜帶電荷多，遷移速率大，率先泳向陰極。5.對入選細(xì)胞系進行單細(xì)胞培養(yǎng)，建立抗病單細(xì)胞克隆。
文檔編號G01N27/26GK1420168SQ0114057
公開日2003年5月28日 申請日期2001年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月19日
發(fā)明者王敬文 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所