專利名稱：一種檢測赭曲霉毒素a的酶聯免疫分析試劑盒及其檢測方法
技術領域：
一種檢測赭曲霉毒素A的酶聯免疫分析試劑盒及其檢測方法，屬于酶聯免疫分析(ELISA)技術領域，用于對糧食，飼料及其食品中赭曲霉毒素A(簡稱OTA)含量的檢測。
背景技術：
赭曲霉毒素A(OTA)是真菌曲霉ochraceous和幾種Penicillium真菌產生的一種毒素。OTA已經被證明對動物及人的腎產生損害，也是一種致癌物質，霉菌毒素引起的中毒大多通過被霉菌污染的糧食，油料作物以及發(fā)酵食品等引起，而且霉菌毒素中毒往往表現為明顯的地方性和季節(jié)性，臨床表現較為復雜，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突變等。OTA在大多數谷物中均可分離到，包括大麥、小麥、燕麥、玉米、咖啡豆等，以這些谷物作為飼料的家禽也會受到污染，因此為了保障人們的健康，開展食品中OTA的衛(wèi)生檢測研究是很有必要的。
第56次FAO/WHO食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)會議對OTA進行了危險性評價，得出的結論是體內和體外試驗顯示OTA都具有遺傳毒性，考慮到小麥、大麥和黑麥等谷物是攝入OTA主要的食物品種，決定制定這些食物中OTA的限量標準，會議認為這些食物及其制品中OTA限量為5μg/kg。到目前為止，已有11個國家制定了食品(1-50μg/kg)和飼料(100-1000μg/kg)中的OTA的限量標準，主要是歐洲國家，我國尚無糧食中的OTA限量標準。
因而作為國際食品安全評價機構的JECFA很少能得到我國的污染監(jiān)測和暴露量評估數據，使我們始終處于被動地位。另外對于食品、農副土特產品、保健品等出口到歐盟市場，其檢驗檢疫必須符合有關OTA、黃曲霉、污染農藥等食品安全規(guī)定的要求，在這方面我國產品的出口已遭受了很多的損失，而且進口方面，也迫切要求建立一個完善、方便的檢測手段。因此，盡快建立高靈敏的OTA的檢測，積極開展OTA的研究是當務之急。
目前赭曲霉毒素A的測定方法有多種，如薄層色譜法TLC(靈敏度為10μg/ml)，高效液相色譜法HPLC(靈敏度為10μg/ml)，免疫熒光染色法(靈敏度0.025μg/ml)，但由于費時，靈敏度低，儀器設備昂貴，操作復雜且不適用于大批量樣品的檢測等缺點，已被逐步淘汰。酶聯免疫分析法(ELISA)，由于其特異性強，靈敏度高，操作簡便，不需直接接觸毒素，且特別適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點而越來越被人們所重視和采用。盡管如此，國內在OTA-ELISA方法到試劑盒的轉化中技術不成熟，檢測的靈敏度和試劑的穩(wěn)定性還無法達到要求，致使無法實際應用，所以目前為止沒有一個國產的OTA-ELISA試劑盒面市。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測赭曲霉毒素A的酶聯免疫分析試劑盒及其檢測方法，用于對糧食，飼料及其食品中OTA含量的檢測。
本發(fā)明的技術方案該檢測OTA的試劑盒是由1、96或48孔包被板，2、赭曲霉毒素A標準品，3、赭曲霉毒素A的抗體凍干品，4、酶標記的羊抗兔抗體凍干品，5、洗滌液，6、顯色液A，7、顯色液B，8、終止液所組成。
所述的酶標記的羊抗兔抗體凍干品為辣根過氧化物酶-羊抗兔抗體凍干品，洗滌液為含有吐溫的Tris-HCl緩沖溶液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，顯色液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液，終止液為硫酸溶液。
本發(fā)明主要采用酶聯免疫分析法(ELISA)來檢測OTA。采用ELISA的技術主要有兩個方面第一，特異性多克隆抗體的制備，利用抗原免疫家兔，獲得含有抗體的血清，經過生化提純分離免疫球蛋白；第二，OTA-ELISA試劑盒的制備。
檢測赭曲霉毒素A的酶聯免疫分析試劑盒的制備詳見實施例1。
測定方法為測定的基礎是標記免疫反應。取包被有OTA-BSA的微孔包被板，加入OTA標準或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入OTA抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加酶標記的羊抗兔抗體，進行標記免疫反應，洗滌液洗滌，加顯色液A和顯色液B，暗處靜置后加終止液，在450nm處測量吸光度，對照標準曲線計算樣品中的OTA含量。
本發(fā)明的有益效果該試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到1ng/ml以上。


圖1檢測赭曲霉毒素A的試劑盒示意圖。1、96或48孔包被板，2、赭曲霉毒素A標準品，3、赭曲霉毒素A的抗體凍干品，4、酶標記的羊抗兔抗體凍干品，5、洗滌液，6、顯色液A，7、顯色液B，8、終止液。
圖2OTA-ELISA標準曲線圖。
具體實施例方式
實施例1制備試劑盒和檢測玉米樣品OTA是典型的半抗原，故在免疫反應中具有反應原性，但需與大分子物質結合后才有免疫原性，OTA中的羧基為活性基團，可與蛋白質的氨基結合。因此可用碳二亞胺法，使OTA與大分子蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)結合，以合成的OTA-KLH作為人工合成的免疫抗原進行動物免疫。
OTA-KLH抗原的制備1用1ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解1-2mg OTA；2用1ml的0.13mol/L NaHCO3偶聯緩沖液溶解1-2mg KLH載體蛋白；3.取0.4-0.8mg OTA的溶液加到KLH的溶液中；4.溶解2-4mg碳二亞胺(EDC)于1mL雙蒸水，并取50-100μl加入到上述混合液中，室溫作用2小時(避光)；5.離心后取上清液上柱(Sephadex G-25)分離，進行紫外掃描檢測。
多克隆赭曲霉毒素A抗體凍干品的制備1.選取4周大的，體重約1.5Kg的健康新西蘭大白兔。OTA是一種半抗原，將OTA和KLH相連接作為抗原。
2.油包水抗原乳化劑的制備用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2ml混合2mgOTA-KLH，用勻漿器混合2小時。將制好的乳化劑滴入盛有冷水的燒杯中，以油滴狀態(tài)能完整地停留在水面上，而不擴散，表明是穩(wěn)定的。
3.免疫兔子及抗赭曲霉毒素A抗體凍干品的制備先將兔子背部的毛小心剪去，然后取600μL制備好的油包水抗原乳化劑，多位點地進行皮下注射，使抗原能緩慢擴散，每隔1～2周免疫一次，共需六次，在免疫3～4次后，從兔子的耳緣靜脈抽血約1ml，離心10min后，得血清可進行鑒定。合格后稀釋至適當濃度，按需分裝，凍干備用。
包被板固相抗原制備將OTA-BSA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH9.6緩沖液稀釋至10mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100μl，4℃放置過夜。棄去包被液，沖洗三次，加150μl含3g/L BSA的上述緩沖液封閉，4℃放置過夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存。
試劑的配制(1)標準品赭曲霉毒素A(0ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，)，從OTA純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇∶水體積比為3.5∶6.5。
(2)抗赭曲霉毒素A抗體凍干品的制備見上述。
(3)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體凍干品(HRP-羊抗兔抗體)市售，珠海百奧生物科技有限公司生產。
(4)洗滌液14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN3的50mmol/LTris-HCl pH7.8。
(5)顯色液A0.2MNa2HPO425.7ml，0.1M檸檬酸24.3ml和30％的H2O250ml。
(6)顯色液B稱取5mg四甲基聯苯二胺(TMB)加入2.5ml無水酒精中，可加熱至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
(7)終止液2mol/L的H2SO4。
每一個盒中的試劑足夠進行96個測量，盒中的材料如下(1)1×96孔板(8條×12孔，可以拆分為單孔)包被有OTA-BSA。
(2)6×OTA標準液，1.0ml/瓶，標準液濃度為0，0.5，1，5，20，50ng/ml。
(3)1×OTA抗體凍干品，用時5ml蒸餾水溶解。
(4)1×HRP-羊抗兔抗體凍干品，用時10ml蒸餾水溶解。
(5)1×洗滌液30ml，用時以蒸餾水1∶25稀釋。
(6)1×顯色液A10ml。
(7)1×顯色液B10ml。
(8)1×終止液10ml。
實驗室應自備的試劑甲醇。
70％甲醇溶液30ml蒸餾水或去離子水和70ml純甲醇混合制備70％甲醇溶液。
蒸餾水或去離子水。
測定之前注意事項1.使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30℃)。
2.使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3.如果樣品量大建議使用多通道移液器。
4.在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。
5.取出需用數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8℃。
具體檢測步驟如下先將樣品進行處理將玉米樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液12.5ml(甲醇∶水體積比為7∶3)。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙。取1ml濾液用1ml蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用，稀釋后的樣品中的甲醇與水的實際體積比為3.5∶6.5，與標準品赭曲霉毒素A中甲醇與水的體積比相同。
取OTA-BSA板條，加入50μl的OTA標準或處理好的樣品到各自的微孔中，每個標準和樣品必須使用新的吸頭，加50μl OTA抗體，移液器管尖千萬不要接觸到放進孔中的液體，37℃振蕩0.5小時，洗滌液洗三次，加100μl HRP-羊抗兔抗體，37℃振蕩0.5小時，用洗滌液洗六次，加50μl顯色液A、50μl顯色液B，暗處靜置15分鐘后加終止液測量吸光度，從標準曲線計算樣品中的OTA含量。見表1，該例的樣品濃度為0.5ng/ml。
表1

實施例2試劑盒提供的試劑與實施例1相同，用于檢測大麥樣品。
具體檢測步驟如下先將大麥樣品進行處理將大麥樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液12.5ml(甲醇∶水＝7∶3)。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙。取1ml濾液用1ml蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。
取OTA-BSA板條，加入50μl的OTA標準或處理好的樣品到各自的微孔中，每個標準和樣品必須使用新的吸頭，加50μl OTA抗體，移液器管尖千萬不要接觸到放進孔中的液體，37℃振蕩0.5小時，洗滌液洗三次，加100μl HRP-羊抗兔抗體，37℃振蕩0.5小時，用洗滌液洗六次，加50μl顯色液A、50μl顯色液B，暗處靜置15分鐘后加終止液測量吸光度，從標準曲線計算樣品中的OTA含量。見表2，該例的樣品濃度為1.0ng/ml。
表2

權利要求
1.一種檢測赭曲霉毒素A的酶聯免疫分析試劑盒，其特征是由96或48孔包被板(1)，赭曲霉毒素A標準品(2)，抗赭曲霉毒素A的抗體凍干品(3)，酶標記的羊抗兔抗體凍干品(4)，洗滌液(5)，顯色液A(6)，顯色液B(7)和終止液(8)所組成；所述的酶標記的羊抗兔抗體凍干品為辣根過氧化物酶-羊抗兔抗體凍干品，洗滌液為含有吐溫的Tris-HCl緩沖溶液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，顯色液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液，終止液為硫酸溶液。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6 Na2CO3-NaHCO3的緩沖液將OTA-BSA稀釋至10mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加100μl，4℃放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加150μl含3g/L BSA的上述Na2CO3-NaHCO3緩沖液封閉，4℃放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的赭曲霉毒素A標準品(2)，從OTA純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇∶水體積比為3.5∶6.5，共6瓶，OTA濃度分別為0ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，20ng/ml，50ng/ml。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的赭曲霉毒素A的抗體凍干品(3)，用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2ml混合2mgOTA-KLH，用勻漿器混合2小時，制得油包水抗原乳化劑，取600μl制備好的油包水抗原乳化劑，在新西蘭大白兔身上多位點地進行皮下注射，在免疫3～4次后，可進行鑒定，血清合格后稀釋、分裝、凍干備用。
5.一種用權利要求1所述的試劑盒檢測赭曲霉毒素A的方法，其特征是取包被有OTA-BSA的微孔包被板，加入OTA標準或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入OTA抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加酶標記的羊抗兔抗體，進行標記免疫反應，洗滌液洗滌，加顯色液A和顯色液B，暗處靜置后加終止液，在450nm處測量吸光度，對照標準曲線計算樣品中的OTA含量。
6.根據權利要求5所述的檢測赭曲霉毒素A的方法，其操作為取包被有OTA-BSA的微孔包被板，加入50μl的OTA標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加50μl抗OTA抗體，37℃振蕩0.5小時，洗滌液洗三次，加100μl HRP-羊抗兔抗體，37℃振蕩0.5小時，用洗滌液洗六次，加50μl顯色液A和50μl顯色液B，暗處靜置15分鐘后加終止液，在450nm處測其吸光度，從標準曲線計算樣品中的OTA含量。
7.根據權利要求6所述的檢測赭曲霉毒素A的方法，其中的樣品處理方法為將谷物樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液12.5ml，提取液為甲醇∶水體積比為7∶3，加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙，取1ml濾液用1ml蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。
全文摘要
一種檢測赭曲霉毒素A的酶聯免疫分析試劑盒及其檢測方法，屬于酶聯免疫分析(ELISA)技術領域，用于對糧食，飼料及其食品中赭曲霉毒素A(OTA)含量的檢測。本試劑盒采用ELISA檢測OTA，測定的基礎是標記免疫反應。微孔板包被有OTA－BSA，加入OTA標準或樣品，再加入OTA抗體。游離的OTA與微孔板上的OTA－BSA競爭OTA抗體，沒有連接的OTA抗體被洗滌除去，加入HRP－羊抗兔抗體，標記免疫反應后沒有連接的HRP－羊抗兔抗體被洗滌除去。加顯色液、終止液后，用酶標儀測定其吸光度，吸光度的值與樣品中的OTA濃度成反比，對照標準曲線即可確定被測樣品中OTA的含量。本試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到1ng/ml以上。
文檔編號G01N33/543GK1877332SQ20061008826
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月6日 優(yōu)先權日2006年7月6日
發(fā)明者張蓮芬, 金堅, 許贛榮, 許泓瑜 申請人:江南大學