一種用于赭曲霉毒素a富集凈化的免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及赭曲霉毒素 A樣本的富集凈化處理工藝，具體涉及一種用于赭曲霉毒 素 A富集凈化的免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 赭曲霉毒素是赭曲霉及青霉菌中某些產(chǎn)毒菌株侵染糧食、食品、飼料及其他農(nóng)副 廣品后所廣生的有毒代謝廣物。赫曲霉毒素 A是赫曲霉毒素中毒性最強、廣量最尚的一種， 對人和動物有強烈的毒害作用，可以導(dǎo)致動物的腎萎縮、胎兒畸形、流產(chǎn)、死亡，并且具有高 度的致癌性。赭曲霉毒素 A在大麥、小麥、燕麥、玉米等大多數(shù)谷物中存在。用受赭曲霉毒 素 A污染的谷物飼養(yǎng)的家禽也會受到污染，赭曲霉毒素 A直接或間接危及人體健康。因此， 赭曲霉毒素 A是繼黃曲霉毒素后又一個引起世界關(guān)注的毒素。1993年，國際癌癥研究院 (The International Agency for Researchon Cancer)將赫曲霉毒素 A 定為 213組致癌物 質(zhì)（可能是人類致癌物）。各國紛紛制定了谷物中赭曲霉毒素 A的限量標準，第56次FAO/ WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會會議對赭曲霉毒素 A進行了危險性評價并制定了谷物食品 中赭曲霉毒素 A最大殘留量標準為5 μ g/kg，我國和歐盟及其成員國也規(guī)定在谷物中最大 殘留量為5 μ g/kg。
[0003] 目前食品中赭曲霉毒素 A的主要提取方法包括有機溶劑萃取法、免疫親和層析法 等。有機溶劑萃取法是目前最普遍的提取方法，但有機溶劑的萃取存在過程復(fù)雜、毒性大、 所需時間長等缺點，而且由于最終提取物中可能存在其他熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物，從 而對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾；免疫親和層析提高了試樣的凈化效果，同時可顯著減少有毒有害 試劑的使用，但樣品前處理較復(fù)雜，所用設(shè)備價格昂貴，對操作人員的技術(shù)要求也比較高， 不適合于大批量樣本檢測及大范圍推廣的應(yīng)用。
[0004] 免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic bead-based separation，IMS)是近年來發(fā) 展起來的一項新的免疫學技術(shù)。免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB)既可結(jié)合活性蛋白 質(zhì)抗體，又可被磁鐵吸引，經(jīng)過處理后，可將抗體結(jié)合在磁珠上，使之成為抗體的載體，磁珠 上抗體與特異性抗原物質(zhì)結(jié)合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物在磁力 作用下發(fā)生力學移動，使復(fù)合物與其它物質(zhì)分離，而達到分離特異性抗原的目的。免疫磁珠 (Hffi)是一個平臺，凡是利用抗原抗體結(jié)合原理進行工作的領(lǐng)域都可以應(yīng)用，并且已在醫(yī)學 和生物學的骨髓移植、分離干細胞、細胞器、癌細胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了顯 著成績。近年來以其高度的敏感性和特異性被廣泛應(yīng)用于食品、水、生物樣品、環(huán)境等 標本中真菌毒素的分離和檢測工作中，顯示出良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
[0005] 在分離真菌毒素方面，頂B可有效地收集、濃縮大量樣品中的少量真菌毒素，可避 免有機溶劑萃取法、免疫親和層析法提取時存在的缺點。對目的毒素的富集具有高分離 率、高特異性、高穩(wěn)定性、無污染、無毒性、操作簡便、樣品用量少且不會破壞毒素結(jié)構(gòu)等優(yōu) 點，與常規(guī)方法相比，不需要多加純化步驟去除雜質(zhì)，可直接對真菌毒素產(chǎn)生富集分離純化 的效果，并可在2-5h內(nèi)完成。并且磁珠上偶聯(lián)的抗體可準確識別真菌毒素上的特征基團， 從而減少漏檢，減少安全隱患。
[0006] 目前，雖有利用免疫磁珠富集分離黃曲霉毒素、T-2毒素的報道，但是免疫磁珠在 赭曲霉毒素 A上的應(yīng)用卻未見報道。本發(fā)明利用磁珠與抗體的偶聯(lián)原理對可富集赭曲霉毒 素 A的免疫磁珠的制備工藝及應(yīng)用條件進行了優(yōu)化，大大提高了對赭曲霉毒素 A的富集能 力和檢測靈敏度，同時憑借免疫磁珠自身的快速方便、價格低廉的特點，將其應(yīng)用于谷物及 飼料中赭曲霉毒素 A的分離與富集，可以進一步提高快速檢測赭曲霉毒素 A的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了彌補現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種用于赭曲霉毒素 A富集 凈化的免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用，以解決赭曲霉毒素 A樣品凈化分離操作復(fù)雜、分離 效率低、存在較大安全隱患的技術(shù)問題。
[0008] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：提供一種用于赭曲霉毒素 A富 集凈化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶聯(lián)有赭曲霉毒素 A單克隆抗體；所述赭曲霉毒素 A單 克隆抗體是用赭曲霉毒素 A人工抗原免疫白鼠所得到的；所述赭曲霉毒素 A人工抗原是赭 曲霉毒素 A半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，其分子結(jié)構(gòu)式如式I所示：
[0010] 所述赭曲霉毒素 A人工抗原是按照如下方法制備得到的：
[0011] 18mg赭曲霉毒素 A半抗原溶于ImL N, N-二甲基甲酰胺（DMF)中，50mg載體蛋白 溶于3. 75mL0. lmol/L的CB緩沖液（pH 9.6)中，將半抗原溶液加入到蛋白溶液中，4°C攪拌 反應(yīng)24h ;再加入0. 25mL lmol/L的賴氨酸溶液（pH7. 0)，4°C反應(yīng)2h，將得到的產(chǎn)物透析， 得到所述赭曲霉毒素 A人工抗原。
[0012] 所述赭曲霉毒素 A半抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式II所示：
[0014] 所述赭曲霉毒素 A半抗原是按照如下方法制備得到的：I、將IOOmg赭曲霉毒素 A溶于5mL丙酮中，再加入50 μ L 3-溴丙縮醛和40mg碳酸鉀，回流反應(yīng)5h，停止反應(yīng)，加 水-乙酸乙酯萃取，分去水相，加無水硫酸鈉干燥蒸干，得到粗產(chǎn)物，加石油醚洗滌結(jié)晶，得 到中間產(chǎn)物；II、將中間產(chǎn)物加乙醇溶解后，再加入2mL稀鹽酸和5mL蒸餾水，60°C反應(yīng)4h， 停止反應(yīng)，加氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH到6,加二氯甲烷萃取，蒸干，加乙醚重結(jié)晶，得到赭曲 霉毒素 A半抗原。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種上述免疫磁珠的制備方法，是以粒徑2. 8 μπι的羧基磁珠為 載體，羧基磁珠末端具有反應(yīng)活性的羧基基團，在經(jīng)活化劑H)C-NHS組合處理后，活化磁珠 可與赭曲霉毒素 A單克隆抗體進行偶聯(lián)，制備成能夠富集凈化赭曲霉毒素 A的免疫磁珠；
[0016] 上述免疫磁珠的制備方法具體描述如下：
[0017] (1)清洗：取IOOyL羧基磁珠于離心管中，用IOOyL含0.05%吐溫-20的PH5.0、 25mmol/L的MES溶液洗滌2次，磁分離后移除上清；
[0018] (2)活化：用 4°C貯存的 pH5. 0、25mmol/L MES 溶液分別配制 50mmol/L 的 EDC、NHS 溶液；分別加入50 μ L新配制的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勾，室溫活 化30min，磁分離后移除上清，同（I)MES溶液洗滌2-3次；
[0019] (3)偶聯(lián)：將赭曲霉毒素 A單克隆抗體溶解到60 yL pH5. 0、25mmol/L MES溶液中， 用所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ L，輕柔加入到已活化磁珠中，室溫偶聯(lián)30min或4°C偶 聯(lián)2h，期間使磁珠保持混勻狀態(tài)；
[0020] ⑷封閉：磁分離后移除上清，加入100 μ L ρΗ7· 4的TRIS溶液反應(yīng)15min封閉磁 珠；
[0021] (5)保存：磁分離后移除上清，用IOOyL含0. 1 %-0.3 %牛血清白蛋白（BSA)、 0. 1 %吐溫-20的TRIS溶液洗滌封閉好的磁珠3-5次，磁分離后移除上清，將磁珠復(fù)溶于含 0· 1% -0· 5% BSA、0. 01% -0· 1%吐溫-20、0· 02% NaN3的 TRIS 溶液中，2-8°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022] 本發(fā)明同時提供了上述免疫磁珠在富集凈化赭曲霉毒素 A中的應(yīng)用。
[0023] 實驗證明，本發(fā)明用于赭曲霉毒素 A富集凈化的免疫磁珠對赭曲霉毒素 A有很高 的富集率和回收率，對赭曲霉毒素 A的富集率為20ng/mg (每毫克免疫磁珠可以捕獲20ng 赭曲霉毒素 A)，對赭曲霉毒素 A的回收率達到85%以上。本發(fā)明用于赭