專利名稱：一種赭曲霉毒素b的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從赭曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物中分離純化赭曲霉毒素B(OTB) 的方法。
背景技術(shù)：
赭曲霉毒素(Ochratoxins)是ー類對人和動物健康有害的真菌代謝產(chǎn)物，主要由赭曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生，基本結(jié)構(gòu)為異香豆素連接到β -苯丙氨酸上的衍生物，有Α、B、C、D等7種類型。目前，赭曲霉毒素污染食品和中藥材的問題日趨嚴重，為了保證檢測分析所需赭曲霉毒素標準品的供給，獲得大量、高純度的赭曲霉毒素，我們選擇了高產(chǎn)的赭曲霉進行大米培養(yǎng)，從中分離純化出高純度的赭曲霉毒素B，為該真菌毒素的深入研究提供了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供從赭曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物中分離純化赭曲霉毒素B的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案依次包含如下方法步驟1.篩選高產(chǎn)菌株2.分離純化赭曲霉毒素B
具體實施例方式下面所實施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。1.篩選高產(chǎn)菌株根據(jù)我們前期的工作基礎(chǔ)，考察培養(yǎng)條件(溫度、濕度、光照、PH值、碳源、氮源等) 對產(chǎn)毒菌株生長及產(chǎn)毒量的影響，優(yōu)化培養(yǎng)條件，篩選產(chǎn)赭曲霉毒素的高產(chǎn)菌株，通過大米培養(yǎng)，得到培養(yǎng)物。2.分離純化赭曲霉毒素B應(yīng)用反相中壓制備色譜、凝膠LH-20柱色譜和反相高壓制備色譜等技術(shù)對該培養(yǎng)物中的赭曲霉毒素進行分離和純化，建立赭曲霉毒素B的制備方法。對赭曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物Qkg)進行粉碎，用80%的乙醇溶液加熱回流提取4次，每次提取時間為2小吋，合并提取液減壓濃縮至無醇味時，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，采用等體積乙酸乙酯進行萃取，萃取四次后，合并萃取液，減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物。將該萃取物溶于甲醇中，過濾除去不溶物，濾液濃縮后，采用反相中壓制備色譜進行分離，依次以30%、50%、70%和100%甲醇/水溶液梯度洗脫，薄層檢查各流份，對含有藍色熒光的流份進行合井，合并后的流份濃縮過濾后，采用凝膠LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到含毒素的粗品，對該粗品進行反相高效液相制備色譜分離，薄層檢查各流份，回收溶剤，得到白色固體，經(jīng)甲醇重結(jié)晶后，得到無色晶體ang。赭曲霉毒素B(0chratoxin B)[1]，分子式為 C2tlH19NO6,分子量為 369。ESI-MS :m/ ζ 370 [M+H]392 [M+Na]761 [2M+Na]+ ； 1H NMR(CDCl3,600MHz) δ :8. 32 (1H, d, J = 7. 8Hz, H-7) ,7. 21-7. 29 (5H, m, H-17 21)，6·83(1Η，d, J = 8. 4Hz, H-6) ,4. 99 (1H, m, H_3)， 4. 76 (1H, td, J = 6. 0，4. 2Hz，H-14)，3. 32 (1H, dd, J = 14. 4，5. 4Hz, H_15b)，3. 19 (1H, J =13. 8，6· 6Hz，H-15a)，2· 99(1H，m，H-4b)，2· 97(1H，m，H-4a)，1. 55(3H，d, J = 6. OHz, H-ll) ； 13C NMR(CDCl3,150MHz) δ 173. 6 (C-22), 170. 3 (C-I), 164. 2 (C-12), 160. 4 (C-9), 143. 9(C-5)，138. 9(C-16)，136. 4(C_7)，129. 5(C-17,21)，128. 6 (C-18,20)，127.1 (C-19)， 119. 2 (C-6), 118. 7 (C_8)，108. 8 (C-IO)，76. 4 (C_3)，54. 3 (C-14)，37. 7 (C-15)，34. 7 (C_4)， 20. 7(C-Il)。儀器和試劑Bruker AV-600型超導核磁共振儀；LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀；德國LUMTECH液相色譜儀K-1001 ；薄層板GF254 (青島海洋化工廠廠品)；試劑為分析純(北京化工廠)。薄層條件展開劑氯仿/甲醇/甲酸10 1 0. 05 (ν ν ν)；檢測波長254nm和365nm。色譜條件色譜柱=Kromasil MZ-C18 (10 μ m，250 X I(Mim)；流動相甲醇/水，梯度洗脫；流速 2ml/min ；柱溫常溫；檢測波長333nm。參考文獻[1]M. W. Bredenkamp, J. L. Μ. Dillen, P. H. van Rooyen, P. S. Steyn. Crystal Structures and Conformational Analysis of Ochratoxin A and B :Probing the Chemical Structure causing Toxicity. J. CHEM. S0C. PERKIN TRANS. II，1989，1835-1839.


圖1-赭曲霉毒素B的結(jié)構(gòu)圖2-分離流程圖3-赭曲霉毒素B的氫譜圖4-赭曲霉毒素B的碳譜
權(quán)利要求
1. ー種赭曲霉毒素B的制備方法，其特征在于對赭曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物進行粉碎，用80%乙醇溶液加熱回流提取4次，每次提取時間為2小吋，合并提取液減壓濃縮至無醇味，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，等體積乙酸乙酯進行萃取，萃取四次后，合并萃取液，減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物，將該萃取物溶于甲醇中，過濾除去不溶物，濾液濃縮后，采用反相中壓制備色譜進行分離，依次以30 %、50 %、70 %和100 %甲醇/水溶液梯度洗脫，薄層檢查各流份，對含有藍色熒光的流份進行合井，合并后的流份濃縮過濾后，采用凝膠色譜分離， 甲醇洗脫，得到含毒素的粗品，對該粗品進行反相高壓制備色譜分離，薄層檢查各流份，合并后回收溶剤，得到白色固體，經(jīng)甲醇重結(jié)晶后，得到赭曲霉毒素B (OTB)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種赭曲霉毒素B的制備方法，所說赭曲霉毒素B是從赭曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物中，應(yīng)用反相中壓制備色譜、凝膠LH-20柱色譜和反相高壓制備色譜等技術(shù)分離純化獲得的，該工藝簡單，收率提高，成本降低，極有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07D311/76GK102584772SQ20111000080
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者吳海峰, 楊美華, 許旭東, 高微微 申請人:中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所