專利名稱：檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)和病毒學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒試紙條，同時(shí)還涉及紙條的制備方法。本發(fā)明主要對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害病原檢測技術(shù)的改進(jìn)，主要是針對(duì)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV，White Spot Syndrome Virus)現(xiàn)場檢測的試紙條及其制備、使用方法。
背景技術(shù)：
90年代以來，世界許多國家和地區(qū)的主要對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)蝦病爆發(fā)性流行，對(duì)蝦產(chǎn)量銳減，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。在眾多的對(duì)蝦病毒中，對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的危害最為嚴(yán)重，是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的頭號(hào)殺手。
養(yǎng)殖蝦感染對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)后會(huì)出現(xiàn)厭食、攝食減少或停止攝食，行動(dòng)遲鈍，彈跳無力，靜臥不動(dòng)或游動(dòng)異常，直到最后無力活動(dòng)，典型癥狀是病蝦甲殼內(nèi)側(cè)出現(xiàn)0.5～2mm大小不等的白色斑點(diǎn)，此病病程短，死亡率高。迄今，對(duì)蝦白斑綜合癥還沒有效的治療方法，因此快速準(zhǔn)確的病毒分離以及病毒檢測診斷技術(shù)已成為各國學(xué)者研究的焦點(diǎn)之一。
目前對(duì)于對(duì)蝦病毒的檢測方法主要包括以下幾種1、肉眼觀察法肉眼觀察法是通過了解養(yǎng)殖過程中對(duì)蝦急慢性死亡的情況，結(jié)合是否出現(xiàn)如頭胸甲出現(xiàn)白斑、甲殼變軟易剝離等典型癥狀進(jìn)行判斷。這種方法可在現(xiàn)場緊急情況下且沒有其他診斷方法時(shí)應(yīng)用，以便采取搶收措施，減少損失，但準(zhǔn)確性較差，且需要有豐富的經(jīng)驗(yàn)。
2、傳統(tǒng)組織學(xué)方法從蝦池中取對(duì)蝦或?qū)ξr糞便直接作濕標(biāo)本檢查，結(jié)合TE或H-E染色法，在光鏡下進(jìn)行檢測?；疾〗M織通過組織切片和染色可觀察到組織細(xì)胞具有典型的核腫大，核內(nèi)著色特征由嗜酸性逐步轉(zhuǎn)為嗜堿性的兩性著染病變。整個(gè)制樣過程需1臺(tái)光學(xué)顯微鏡，且這種方法需要操作者具有較豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。
3、電子顯微技術(shù)自1993年以來，有關(guān)WSSV的很多研究結(jié)果是憑借組織病理學(xué)和電子顯微鏡的方法來獲得的。這類方法可精確地定位WSSV的復(fù)制位置，揭示W(wǎng)SSV的病變特征；展示和比較不同WSSV分離株的病毒粒子及核衣殼的大小形態(tài)，證實(shí)WSSV的致病性，確定病毒的宿主和傳播途徑。電鏡觀察法是最為直觀的檢測病毒性病原的方法，在電鏡下可以直接觀察到病毒的形態(tài)和大小。但電鏡觀察法具有操作復(fù)雜、需要較嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件和較高超的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、樣品處理時(shí)間過長等缺點(diǎn)，不能用于生產(chǎn)實(shí)踐中WSSV的快速診斷以及大量樣品的檢測，僅適用于實(shí)驗(yàn)室研究。
4、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是根據(jù)酶免疫測定原理發(fā)展的一種固相免疫酶技術(shù)，由于具有靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，是應(yīng)用最廣的免疫學(xué)技術(shù)。對(duì)于從宿主組織純化的病毒抗原制備的多克隆抗體(抗血清)用于檢測時(shí)，由于多克隆抗體專一性不強(qiáng)，容易造成WSSV免疫檢測中的假陽性。其最佳方案是制備高效價(jià)單克隆抗體。WSSV的單克隆抗體免疫檢測，其特異性、靈敏性和可重復(fù)性大大提高。中國科學(xué)院水生生物研究所的戴和平等的專利——對(duì)蝦白斑桿狀病毒的診斷試劑盒及其檢測方法(申請(qǐng)?zhí)朇N00131230.8)即是一種基于單克隆抗體酶聯(lián)免疫技術(shù)的病毒檢測方法。但是酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測WSSV必須實(shí)驗(yàn)室中完成，對(duì)人員和設(shè)備有較高地要求，檢測時(shí)間較長，不適合現(xiàn)場的快速診斷，難于在基層推廣使用。
5、核酸探針法核酸探針是指被某種物質(zhì)標(biāo)記了的從而可以被探測到的核酸片段，它能特異性地與待檢測的核酸結(jié)合、雜交。所謂核酸雜交就是在DNA變性的條件下將標(biāo)記的DNA探針與被檢測核酸共存于一個(gè)系統(tǒng)內(nèi)，這樣當(dāng)復(fù)性時(shí)探針DNA的單鏈就可能與被檢測DNA的單鏈互補(bǔ)形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。常用的方法有斑點(diǎn)雜交和原位雜交。
1)斑點(diǎn)雜交法斑點(diǎn)雜交是最常用的一種較快捷的基因檢測方法，根據(jù)雜交膜上點(diǎn)樣斑點(diǎn)的有無或強(qiáng)弱就能推測樣品是否含有待檢物質(zhì)。即將少量的被檢樣品DNA固定在硝酸纖維素濾膜上，再用標(biāo)記探針(如生物素標(biāo)記探針)雜交，雜交后通過顯色反應(yīng)顯色，只有當(dāng)檢測樣品中含有病毒DNA，才能出現(xiàn)點(diǎn)狀或線狀有色區(qū)即陽性結(jié)果。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所的史成銀等利用此種方法來檢測WSSV，并申請(qǐng)了專利——對(duì)蝦流行病病原檢測試劑盒及其檢測方法(申請(qǐng)?zhí)朇N00111336.4)，中國科學(xué)院武漢病毒研究所的石正麗等也申請(qǐng)了專利——對(duì)蝦病毒核酸復(fù)合點(diǎn)雜交檢測的方法(申請(qǐng)?zhí)朇N03119088.X)。由于未感染病毒的細(xì)胞數(shù)量大大多于已感染病毒細(xì)胞，因此采用斑點(diǎn)雜交法檢測標(biāo)本是否存在病毒核酸時(shí)，病毒核酸DNA被大量的細(xì)胞核酸DNA所稀釋，使得檢測的敏感性降低。
2)原位雜交法原位雜交技術(shù)最早應(yīng)用于60年代末期，由于核酸雜交能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行，可更為方便的研究那些數(shù)量少且散在于組織中的細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA；且由于原位雜交不需要從組織提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整的保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確的反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)，可以直觀定位是病毒感染的靶組織及靶組織中對(duì)病毒敏感的細(xì)胞類型。但此法耗時(shí)長，操作繁瑣，需要專業(yè)技術(shù)人員，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求很高，檢測成本高，不適合在基層使用。
6、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是1985年美國Cetus公司的一項(xiàng)專利技術(shù)，被譽(yù)為八十年代分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性突破。PCR技術(shù)的原理是根據(jù)已克隆的病毒DNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物，然后利用該引物直接擴(kuò)增樣品中待檢測病毒的DNA片段，從而通過電泳、染色把它顯示出來。與傳統(tǒng)診斷方法相比，它具有敏感性及特異性高、簡單、快速等特點(diǎn)。目前，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于WSSV的檢測，國內(nèi)外均已開發(fā)出商品化的WSSV的PCR檢測試劑盒。一些學(xué)者還對(duì)PCR技術(shù)做了不同的改進(jìn)，使檢測結(jié)果更快速、準(zhǔn)確。如中山大學(xué)何建國等的專利——對(duì)蝦白斑綜合癥病毒基因診斷試劑盒及檢測方法(申請(qǐng)?zhí)朇N03114366.0)，國家海洋局第三海洋研究所王瑋等的專利——對(duì)蝦白斑桿狀病毒快速檢測方法(申請(qǐng)?zhí)朇N97112049.8)，中國科學(xué)院武漢病毒研究所的石正麗等的專利——復(fù)合多聚酶鏈—酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測對(duì)蝦病毒的方法(申請(qǐng)?zhí)朇N03125202.8)。
PCR方法的高度靈敏性是其他檢驗(yàn)方法無法匹敵的，但是目前PCR技術(shù)仍有一些問題需要解決。如病毒DNA提取過程不當(dāng)所造成樣品品質(zhì)不好，無法有效地進(jìn)行PCR反應(yīng)而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果；因樣品交互污染或因PCR終產(chǎn)物的污染而產(chǎn)生的假陽性結(jié)果；因樣品采集部位的錯(cuò)誤而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失??；因病毒的突變而導(dǎo)致原始設(shè)計(jì)不再能有效檢測突變病毒的基因序列等等。而且PCR及其產(chǎn)物的檢測需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，不適合在現(xiàn)場進(jìn)行檢測，難于在基層推廣使用。
以上技術(shù)對(duì)于廣大蝦農(nóng)而言掌握難度很大，難以推廣，限制了這些技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。因此研制一種適用于WSSV的快速、準(zhǔn)確、簡便、現(xiàn)場、無假陽性的檢測方法就具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，以期達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的。
免疫膠體金技術(shù)是60年代繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。最初該方法僅用于免疫電鏡技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到被動(dòng)凝集試驗(yàn)、光鏡染色、免疫印跡、免疫斑點(diǎn)滲濾法以及免疫層析技術(shù)等。膠體金免疫層析法(GICA)是利用膠體金本身的顯色特點(diǎn)結(jié)合免疫層析技術(shù)診斷特異性的待測物。該方法最大特點(diǎn)是單份測定、簡單快速、特異敏感，不需任何儀器設(shè)備和試劑，幾分鐘就可用觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特別適合于廣大基層單位、醫(yī)院、野外作業(yè)人員使用。目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床診斷、違禁藥物檢測、藥物監(jiān)測等許多領(lǐng)域，如菲力普·許等的專利——艾滋病病毒快速檢測試紙及其制備方法(申請(qǐng)?zhí)朇N01135100.4)，李克生等的專利——結(jié)核抗體金標(biāo)測試條及其制備方法(申請(qǐng)?zhí)朇N01131834.1)，劉劍等的專利——一種快速檢測甲基安非他明的試劑盒及其制備工藝(申請(qǐng)?zhí)朇N02145333.0)，林祥等的專利——黃曲霉毒素快速檢測裝置及其制造方法(申請(qǐng)?zhí)朇N02101951.7)，李君文等的專利——免疫紙層析條及用其快速檢測食品中致病菌和毒素的方法(申請(qǐng)?zhí)朇N03142652.2)。
膠體金免疫層析法基本原理是將特異的抗體或抗原先固定于硝酸纖維素(NC)膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體或抗原的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原或抗體即與該抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合，再通過膠體金標(biāo)記技術(shù)使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。根據(jù)所使用的膠體金標(biāo)記物的不同可以將膠體金免疫層析法分為間接法、競爭法和雙抗夾心法等不同種類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的試紙條，使用方便，操作簡便，檢測快速、準(zhǔn)確。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供制備對(duì)蝦白斑綜合癥病毒試紙條的方法，方法易行，操作簡便，成本低廉，使用方便。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，研制了一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒現(xiàn)場檢測試紙條，共包括適當(dāng)尺寸的PVC襯墊，兔源抗WSSV VP19+VP28多克隆抗體IgG(簡稱抗WSSV抗體)、膠體金標(biāo)記的兔源抗WSV VP19+VP28多克隆抗體IgG(簡稱金標(biāo)抗體)和羊抗兔IgG。在該P(yáng)VC襯墊的兩端部，分別設(shè)有樣品墊和吸收墊；在該P(yáng)VC襯墊中部段設(shè)有硝酸纖維膜檢測層，在硝酸纖維膜檢測層與樣品墊交界處，設(shè)有載有金標(biāo)抗體的結(jié)合墊，該結(jié)合墊一端部分設(shè)置在樣品墊之下，其另一端部分設(shè)置在該檢測層之上；在與結(jié)合墊延續(xù)的檢測層上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，該檢測線和質(zhì)控線處分別包被有抗WSSV抗體和羊抗兔IgG。
一種檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的試紙條，它包括下列步驟A、所述的抗WSSV抗體，其制備方法如下(1)用基因工程大腸桿菌菌株表達(dá)并純化的WSSV VP19、VP28，按質(zhì)量比1∶1比例混勻，作為抗原免疫家兔，制備抗WSSV抗血清；(2)將抗WSSV抗血清用Protein A親合層析柱純化，得到抗WSSV抗體。
B、所述的膠體金標(biāo)抗體，其制備方法如下(1)膠體金的制備取0.01％的氯金酸溶液100ml，加熱至沸，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1％的檸檬酸三鈉水溶液2.0ml(Marc&Jacqueline 1977)，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)槌壬?，繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以去離子水恢復(fù)到原體積，用0.1M K2CO3調(diào)pH為9.0。制備的膠體金經(jīng)一次性滅菌濾器過濾，裝入潔凈玻璃瓶中4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 制備好的膠體金溶液用透射電鏡檢測其顆粒大小及分散性。同時(shí)用分光光度計(jì)進(jìn)行400-600nm全波段掃描，確定最大吸收峰。
(2)金標(biāo)抗體的制備將抗WSSV抗體加入到上述(1)步的膠體金溶液中，加入牛血清白蛋白，離心后的沉淀用含有牛血清白蛋白、疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液懸起，制成金標(biāo)抗體溶液；(3)載有金標(biāo)抗體的結(jié)合墊的制備將玻璃纖維膜完全浸沒于上述(2)步制成的金標(biāo)抗體溶液中，30分鐘后取出，干燥后4℃保存?zhèn)溆茫愕玫揭环N檢測試紙條。
本對(duì)蝦白斑綜合癥病毒現(xiàn)場檢測試紙條的檢測方法首先快速地從被檢測的蝦中提取WSSV，制備檢測樣品；然后，手持該試紙的手持端，將該試紙的樣品墊插入該檢測樣品或在樣品墊上滴加該檢測樣品，5分鐘內(nèi)在位于檢測層下端的檢測線和在位于檢測層上端的質(zhì)控線處顯示紅色。檢測線顯示紅色表示W(wǎng)SSV陽性；檢測線不顯示紅色，表示W(wǎng)SSV陰性，即檢測樣品中不含WSSV或是WSSV含量極低；質(zhì)控線顯示紅色，表示試紙有效；質(zhì)控線處不顯示紅色，說明試紙失效，檢測結(jié)果無效。
本發(fā)明的特點(diǎn)是(1)本發(fā)明的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒現(xiàn)場檢測試紙條，具有簡便、快速、現(xiàn)場、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，無需專門設(shè)施和操作技術(shù)，適于普通養(yǎng)殖戶池邊檢測。(2)本發(fā)明的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒現(xiàn)場檢測試紙條，在使用過程中只需將蝦鰓搗碎即可，與傳統(tǒng)病毒提取研磨、離心等方法相比，此法方法方便、簡單、快速，適合現(xiàn)場檢測使用。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為一種檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒試紙條的示意圖。
1、PVC襯墊；2、樣品墊；3、結(jié)合墊；4、檢測層；5、檢測線；6、質(zhì)控線；7、吸收墊。
圖2為一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒試紙條的檢測結(jié)果示意圖。
2、樣品墊；3、結(jié)合墊；4、檢測層；5、檢測線；6、質(zhì)控線；7、吸收墊；8、加樣最高指示線。
圖3目的基因的獲得與重組質(zhì)粒的酶切鑒定1，DL2000 Marker；2，PCR product of vp19；3，pGET-vp19/BamHI+Hind III；4，pET32b-vp19/BamH I+Hind III；5，Lambda DNA/Hind III Marker.
圖4WSSV VP19表達(dá)產(chǎn)物的時(shí)相分析1，pET32b-VP19 uninduced；2，pET32b-VP19 induced with IPTGfor 1h；3，pET32b-VP19 induced with IPTG for 2h；4，pET32b-VP19induced with IPTG for 3h；5，pET32b-VP19 induced with IPTG for 4h；M，molecular weight standard；The arrow indicated the location ofrecombinant WSSV VP19.
圖5表達(dá)產(chǎn)物的純化和檢測1，pET32b uninduced；2，pET32b induced with IPTG for 4h；3，Purified Trx；4，pET32b-VP19 uninduced；5，pET32b-VP19 induced withfor 4h；6，Purified WSSV VP19；M，molecular weight standard；7，Supernatants of the induced recombinant strains with IPTG for 4h；8，Pellets of the induced recombinant strains with IPTG for 4h；9，Western-blot of purified WSSV VP19；The arrow indicated the locationof recombinant WSSV VP19.
圖6重組質(zhì)粒pET-vp28酶切鑒定圖1.PCR marker；2.PCR回收產(chǎn)物；3.pET-vp28質(zhì)粒；4.EcoR1/Xho1雙酶切pET-vp28；5.EcoR1/HindIII雙酶切marker圖7重組表達(dá)載體pET-VP28的構(gòu)建過程8WSSV VP28在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)圖1.BL21(DE3)-p ET-vp28誘導(dǎo)前；2-4.BL21(DE3)-pET-vp28誘導(dǎo)4h，5h，6h的沉淀；5.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；6-8BL21(DE3)-pET-vp28誘導(dǎo)4h，5h，6h；9.BL21(DE3)-p ET-vp28未誘導(dǎo)10-12BL21(DE3)-pET-vp28誘導(dǎo)4h，5h，6h的上清圖9western bloting結(jié)果圖M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1BL21(DE3)-p ET-vp28誘導(dǎo)5h；2BL21(DE3)-p ET-vp28未誘導(dǎo)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1根據(jù)圖1可知本發(fā)明對(duì)蝦白斑綜合癥病毒現(xiàn)場檢測試紙條，其包括適當(dāng)尺寸的PVC襯墊1；在該P(yáng)VC襯墊1的兩端，分別設(shè)有樣品墊2和吸收墊7；在該P(yáng)VC襯墊1中部段設(shè)有硝酸纖維膜檢測層4，在硝酸纖維膜檢測層4與樣品墊2交界處，設(shè)有載有金標(biāo)抗體的結(jié)合墊3，在結(jié)合墊3一端部分設(shè)置在樣品墊之下，其另一端部分設(shè)置在該檢測層4之上；在與結(jié)合墊3延續(xù)的檢測層4上設(shè)有檢測線5和質(zhì)控線6，該檢測線5和質(zhì)控線6處分別包被有抗WSSV抗體和羊抗兔IgG。
實(shí)施例2WSSV VP19蛋白的制備1.WSSV vp19的擴(kuò)增、重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定(1)WSSV vp19的擴(kuò)增根據(jù)Genebank登錄的WSSV基因組，利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6.0設(shè)計(jì)vp19引物，上游引物5’ggatcctatggccacgactaac 3’(劃線處為BamH I)，下游引物5’aagcttctgcctcctcctggggtaagac 3’(劃線處為HindIII)，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
WSSV病毒基因組的制備于冰上取感染對(duì)蝦白斑病蝦的肺、胃和心臟，加入10倍體積的TN緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，0.4mmol/LNaCl，pH7.4)于勻漿器中，冰浴勻漿，8000r/min離心5min，取上清液，加入蛋白酶K(100μg/ml)，DS(50mmol/L KCl；10mmol/L Tris-Cl PH8.3；明膠0.1mg/ml；NP-40，0.45％；T ween 20，0.45％)，于沸水中煮15min左右，立即冰浴5min，12,000r/min離心10min，4℃保存。
以WSSV病毒基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)體系10×reactionbuffer 5uL，MgCl2 3uL(1.5mM)，dNTP 1uL(0.2mM)，上下游引物各1uL(30pmol)，Taq DNA聚合酶1uL(5U)，模板4uL，加無菌水至終體積為50uL。PCR擴(kuò)增目的基因vp19，PCR反應(yīng)條件95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s(29個(gè)循環(huán))，72℃10min。
(2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建A、PCR產(chǎn)物的回收、純化與克隆將以上PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳(1×TAE)，用紫外燈觀察電泳情況，當(dāng)要回收的DNA帶與其他帶完全分離時(shí)，停止電泳，在紫外燈下用刀片切下欲回收帶，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。
PCR產(chǎn)物的純化(1)將切下的凝膠放入1.5ml Eppendorf管中，加入4倍凝膠毫克數(shù)的Binding Buffer，65℃水浴7min，其間每2min輕搖Eppendorf管一次使凝膠完全熔化。
(2)取750μl溶有凝膠的溶液加到柱子上，12000rpm，室溫(20-25℃，以下室溫相同)，離心1min，棄去液體。
(3)加入300μl Binding Buffer，同上離心棄去液體。
(4)加入750μl Washing Buffer，同上離心棄去液體，重復(fù)該步驟一次。
(5)空柱子12000rpm離心1min以甩干液體。
(6)將柱子放于1.5ml Eppendorf管，加入30μl Elution Buffer，37℃保溫2min，12000rpm離心1min。
(7)將得到的PCR產(chǎn)物取2μl電泳檢測定量，其余貯于-20℃?zhèn)溆谩?br> PCR產(chǎn)物的克隆
將純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(購自Promega公司)連接。連接體系如下10×Ligation Buffer 1μlpGEM-T載體1μl純化后的PCR產(chǎn)物5μlddH2O 2μlT4 DNA Ligase 1μl總反應(yīng)體積10μl連接反應(yīng)液16℃水浴放置過夜后，存于-20℃?zhèn)溆谩?br> B、重組T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 pGEM-T(購自Promega公司)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞1)以無菌牙簽挑取固體LB平板上的新復(fù)蘇的大腸桿菌單菌落，接種到5ml LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm搖床活化過夜。
2)取10-20μl上述活化大腸桿菌，接種到5ml新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)2-3h，至OD600值為0.4-0.6。
3)取1.5ml步驟2的菌液加入無菌的Eppendorf離心管中，4000rpm，4℃離心10min，用移液槍吸干上清。
4)加入800μl冰預(yù)冷的0.1M氯化鈣，輕輕振蕩重懸菌體沉淀，冰浴30min，4000rpm，4℃離心10min，用移液槍吸干上清。
5)加入100μl冰預(yù)冷的0.1M氯化鈣溶液重懸沉淀，得到制備好的感受態(tài)細(xì)胞。置于4℃保存，2天內(nèi)使用。
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞1)取連接反應(yīng)液(不超過10μl體積)，加入到100μl上述制備的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。
2)42℃水浴中熱激90s，迅速移至冰中冰浴2min。
3)加入390μl新鮮LB液體培養(yǎng)基，37℃，150rpm輕搖，使細(xì)胞復(fù)蘇50min。
4)4000rpm離心5min，吸棄400μl上清，將剩余的菌液用移液槍輕輕混勻。
5)取100μl細(xì)菌懸液，均勻涂在含IPTG、X-gal、Amp的LB平板上，正向放置1-2h，直至液體被充分吸收，倒置平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，利用α-互補(bǔ)作用篩選陽性克隆。
C、陽性重組子的PCR檢測從LB平板上挑取單菌落，接種于0.5ml加有Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)4h，取2μl菌液作為模板用于菌落PCR鑒定。反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)如本節(jié)2.2.1所述。
D、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA1)分別用無菌牙簽挑取生長在含有氨芐青霉素的LB平板上的單菌落，接種到3ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)過夜。
2)次日將培養(yǎng)的菌液4℃，12000rpm離心30sec，吸棄上清，收集菌體沉淀，加入100μl冰預(yù)冷的溶液I(50mmol/l葡萄糖，25mmol/l Tris·HCl(pH8.0)，10mmol/l EDTA(pH8.0)，8磅滅菌15min后置于4℃?zhèn)溆谩?，劇烈振蕩使沉淀完全懸浮。
3)加入200μl溶液II(0.2mol/l NaOH，1％SDS，使用時(shí)新鮮配制。)，溫和顛倒數(shù)次混勻，冰浴靜置5min，待整個(gè)溶液澄清。
4)加入150μl冰預(yù)冷的溶液III(5mol/l乙酸鉀60ml，濃乙酸11.5ml，ddH2O 28.5ml。
)，輕微振蕩均勻，冰浴10min，溶液會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
5)12000rpm，4℃離心10-15min，轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)無菌Eppendorf管中。
6)加入等體積的苯酚，充分混勻，12000rpm，4℃離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一支無菌的Eppendorf管中，再依次用等體積的苯酚/氯仿(1/1)、苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)同上抽提。
7)離心后取上清，加入800μl預(yù)冷的無水乙醇，-20℃沉淀2h。
8)12000rpm，4℃離心15min，去上清，吸棄液體，將Eppendorf管倒置于無菌濾紙上待其干燥。
9)加入室溫放置的70％醇1ml，12000rpm，4℃離心10min，吸棄液體，將Eppendorf管倒置于無菌濾紙上37℃溫箱內(nèi)干燥。
10)將DNA沉淀溶于50μl含RNase A(20μg/ml)的TE溶液中，-20℃存放。
(3)重組表達(dá)載體的鑒定A、陽性重組子pGEM-vp19的酶切鑒定用BamH I和Hind III對(duì)所提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下質(zhì)粒DNA 8μlBamH I 0.5μlHind III0.5μl10×H buffer1μl總反應(yīng)體積 10μl以上酶切反應(yīng)條件均為37℃，反應(yīng)時(shí)間4h。酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析。
用BamH I和Hind III對(duì)重組質(zhì)粒pGEM-vp19和表達(dá)載體pET32b同時(shí)進(jìn)行雙酶切，膠回收試劑盒回收目的條帶，將酶切得到vp19與相應(yīng)的載體片斷連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，小量提取質(zhì)粒，用BamH I/Hind III雙酶切鑒定陽性重組子，重組質(zhì)粒命名為pET32b-vp19。
B、DNA序列分析隨機(jī)選擇3個(gè)經(jīng)酶切鑒定插入方向正確的陽性重組菌落送上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA序列測定，并將測序結(jié)果與GenBank已經(jīng)登錄的序列進(jìn)行比較。
取10μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外燈下觀察表明擴(kuò)增得到一條370bp的條帶(圖3.1)，與目的基因vp19大小相符。將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T載體中，經(jīng)BamH I/Hind III雙酶切鑒定，獲得了陽性克隆(圖3)，DNA序列測定結(jié)果表明vp19的基因序列完全正確。通過BamH I和Hind III雙酶切將vp19基因定向插入表達(dá)載體pET32b，BamH I和Hind III雙酶切鑒定pET32b-vp19質(zhì)粒，在1％瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)兩個(gè)條帶，大小分別為5900bp和370bp(圖3)，分別對(duì)應(yīng)于表達(dá)載體pET32b和vp19基因，表明該質(zhì)粒已正確插入表達(dá)載體pET32b中。
2.融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化(1)Trx蛋白和融合蛋白(WSSV VP19)的誘導(dǎo)表達(dá)1)將經(jīng)測序表明vp19正確插入pET32b載體的重組質(zhì)粒和pET32b空載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami(DE3)pLysS感受態(tài)，從平板上挑取攜帶有重組質(zhì)粒和空載體的大腸桿菌單菌落，接種于20mLLB液體培養(yǎng)基(含終濃度為100mg/L氨芐青霉素，34mg/L氯霉素，15mg/L卡拉霉素)中，在37℃下，250rpm振蕩培養(yǎng)8-12h。
2)次日按4％接種到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約2小時(shí)。
3)至菌液OD600值為0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為0.8mM，在22℃-35℃下誘導(dǎo)表達(dá)4h。
菌液在4℃下12,000離心1min，收集菌體。
(2)大腸桿菌基因工程蛋白的粗提取1)向收集的菌體加入適量1×Binding Buffer(可進(jìn)一步用于鎳柱純化)或PBS重懸，-20℃反復(fù)凍融幾次后，再進(jìn)行超聲波破碎菌處理(冰水混合物中，處理3次，每次10秒，間隔30秒)。
2)待菌液變清亮，絕大部分菌體破裂后，4,000rpm離心菌液15-20分鐘。
3)分別收集得到菌體殘?jiān)蜕锨逡?上清在4℃下12,000rpm繼續(xù)離心15分鐘。
4)收集兩次離心所得上清和沉淀，分別取其1/100加入2×SDS-PAGE加樣緩沖液(100mM Tris-Cl、200mMβ-巰基乙醇、4％SDS、0.2％溴酚藍(lán)、20％甘油)，經(jīng)沸水浴10分鐘后，用SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測。
(3)Ni2+柱親和層析法純化帶6×His標(biāo)記的蛋白1)Ni2+柱用柱內(nèi)介質(zhì)體積10倍的1×Binding Buffer(0.5mM咪唑，0.5mM NaCl，2mM Tris-HCl)10倍體積的無菌水洗柱床，用10倍體積的1×Charge Buffer(50mMNiSO4)補(bǔ)充Ni2+，再用10倍體積的1×Binding Buffer清洗柱床，準(zhǔn)備開始親和層析。
2)蛋白溶液用蠕動(dòng)泵以循環(huán)方式加入到平衡好的親和層析柱中，使帶有6×His的樣品充分Ni2+結(jié)合，過夜后從Ni2+柱出口收集與Ni2+反應(yīng)后的樣品(即穿漏液)。
3)使20倍體積的1×Binding Buffer洗柱，以沖洗下留在柱內(nèi)的少量未與Ni2+結(jié)合的樣品。
4)用10mM～100mM的咪唑溶液洗脫Ni2+柱上非目的蛋白(洗脫液體積與濃度視總蛋白含量及非目的蛋白與Ni2+結(jié)合能力靈活變化)。
5)用1×Elute Buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)洗脫Ni2+柱，目的蛋白洗脫下來，以2mL為單位收集洗脫液。
6)取收集的每一管蛋白進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白在洗脫液中的分布。
7)Ni2+柱用1×Elute Buffer繼續(xù)洗脫，洗掉柱床中的全部剩余蛋白，再用1×StripBuffer(100mM EDTA，0.5M NaCl，20mMTris-HCl)洗去柱子上的Ni2+離子。
8)組氨酸親和層析柱的洗滌，再生和保存。
一般來說，Ni2+親和層析柱可以反復(fù)使用3-4次，在再次使用前須洗滌而不需再生，若反復(fù)多次使用則需再生。
(1)用2倍體積的6M鹽酸胍、0.2M的乙酸溶液洗組氨酸親和層析柱；(2)用2倍體積的去離子水洗柱；(3)用1倍體積2％SDS洗柱；(4)用1倍體積25％乙醇洗柱；(5)用1倍體積50％乙醇洗柱；(6)用1倍體積75％乙醇洗柱；(7)用5倍體積100％乙醇洗柱；(8)依次重復(fù)步驟6、5、4各一次；(9)用1倍體積的去離子水漂洗柱一次；(10)用5倍體積100mM EDTA(pH8.0)洗柱，徹底去除層析柱上的Ni2+離子；(11)將再生的層析柱置于含0.1％疊氮鈉的20％乙醇溶液中，4℃保存.
(4)純化后的重組蛋白WSSV VP19 western blotting鑒定(1)當(dāng)SDS-PAGE將要結(jié)束時(shí)，用雙蒸水淋洗石墨板后用紙巾揩干電極板上黏附的液滴。
(2)戴一次性手套裁切六張濾紙和一張纖維素濾膜，其大小應(yīng)與凝膠大小完全吻合，用軟鉛筆在濾膜的一角做好標(biāo)記。
①濾膜漂浮于裝有去離子水的平皿中，借毛細(xì)作用使之從下往上濕潤，在水中至少浸泡5min，以驅(qū)除留于濾膜上的氣泡。
②將剪好的濾紙浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，時(shí)間為15-30min(3)戴一次性手套按如下步驟安裝轉(zhuǎn)移裝置①平放半干電轉(zhuǎn)儀的底部電極，石墨一邊朝上。
②其上放置三張浸泡好的濾紙，精確對(duì)齊，用玻璃棒趕走氣泡。
③把潤濕后的濾膜放于濾紙之上，標(biāo)記面朝上，精確對(duì)齊，用玻璃棒趕走氣泡。
④將用于轉(zhuǎn)膜的凝膠在盛有去離子水的平皿中略微漂洗一下，放于NC膜上，把凝膠的左下角置于NC膜的標(biāo)記角上，精確對(duì)齊，輕輕趕走氣泡。
⑤再在凝膠上放三張浸泡好的三張濾紙，對(duì)齊并趕走氣泡。
(4)放上另一半電極，用膠布將兩部分電極固定。連接電源，將電轉(zhuǎn)儀置4℃冰柜，電轉(zhuǎn)1.5-2h。
(5)從上到下拆卸轉(zhuǎn)移裝置，逐一掀去各層，將膜放入裝有10mL封閉液的小平皿中，在搖擺床上室溫?fù)u動(dòng)60min，凝膠銀染以檢測轉(zhuǎn)膜效率。
(6)將膜用鑷子取出，用TBST沖洗后，轉(zhuǎn)入20mL TBST稀釋的抗VP(19+28)IgGs(1∶1000)溶液室溫?fù)u動(dòng)30min。
(7)室溫用50mL TBST中沖洗膜，連續(xù)洗四次，每次15min。
(8)將膜轉(zhuǎn)入20mL TBST稀釋辣根過氧化物酶交聯(lián)的羊抗兔IgGs(1∶10000)溶液中室溫?fù)u動(dòng)30min。
(9)重復(fù)步驟(7)(10)室溫以PBS洗膜15min以去除過量的磷酸鹽和吐溫20。
(11)將膜浸泡于10mL DAB顯色液中10-30min，直至蛋白條帶出現(xiàn)。
(13)以PBS清洗以終止顯色反應(yīng)。
將pET32b和重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Origami(DE3)pLysS宿主菌(購自Promega公司)，構(gòu)建了pET32b-VP19和pET32b的表達(dá)菌株，IPTG(0.8mmol/L)誘導(dǎo)后在不同時(shí)間收集菌樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)目的蛋白WSSV VP19獲得了表達(dá)(見圖4)，分子量約為37kDa，與預(yù)期的大小相符，如圖2中的箭頭所示，并在誘導(dǎo)后4h表達(dá)量最大。用Western Blot也檢測到WSSV VP19蛋白的表達(dá)。將菌體反復(fù)凍融3次，超聲波破碎，離心(12000r/min，4℃，10min)收集上清，鎳離子親和樹脂純化帶6×His標(biāo)簽的融合蛋白后，約37kDa處為單一的條帶(見圖5)。同樣的方法純化得到pET32b空載體的表達(dá)產(chǎn)物Trx，在18kDa處為單一的條帶(見圖5)。
實(shí)施例3WSSV VP28蛋白的制備1.PCR擴(kuò)增vp28基因根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的WSSV序列設(shè)計(jì)引物。
vp28上游引物gaattcatggatctttctttcac(劃線處為EcoR I位點(diǎn))下游引物ctcgagttactcggtctcagtgc(劃線處為XhoI位點(diǎn))。
上述引物是用Oligo6.0軟件分析設(shè)計(jì)的，由上海生工生物公司合成。
以質(zhì)粒PUC-vp28為模板，PCR擴(kuò)增目的基因vp28。PCR反應(yīng)體系10×reaction buffer 5uL，MgCl2 3uL(1.5mM)，dNTP1uL(0.2mM)，上下游引物各1uL(30pmol)，Taq DNA聚合酶1uL(5U)，模板4uL，加無菌水至終體積為50uL。PCR反應(yīng)條件95℃5min；95℃1min，55℃45s，72℃1min(30個(gè)循環(huán))；72℃10min。取5uL PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后紫外燈下觀察。
PCR擴(kuò)增vp28基因，PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后紫外燈下觀察，有與目的基因vp28大小相符的目的條帶，大小為640bp左右，如圖6所示。
2克隆載體pMD18-T28的構(gòu)建將vp28 PCR產(chǎn)物用PCR純化回收試劑盒回收后與克隆載體pMD18-T(購自寶生物工程有限公司)連接，連接體系為LigationsolutionI 5μL，pMD 18-T載體0.5μL，純化后的PCR產(chǎn)物4.5μL，終體積10uL。16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。用無菌牙簽從轉(zhuǎn)化平皿上挑取單菌落，接種于5mL含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。次日提取質(zhì)粒，做PCR鑒定和EcoRI、XhoI雙酶切鑒定，篩選含有vp28目的片斷的重組質(zhì)粒，命名為pMD18-T28。
3重組表達(dá)載體的構(gòu)建EcoRI、XhoI雙酶切表達(dá)載體pET-22b(+)和篩選到的重組克隆載體pMD18-T28，分別用膠回收試劑盒回收目的片斷vp28和pET-22b(+)，再通過T4 DNA Ligase連接，16℃連接15h后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。用無菌牙簽從轉(zhuǎn)化平皿上挑取單菌落，接種于5mL含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。次日提取質(zhì)粒，做PCR鑒定和EcoRI、XhoI雙酶切鑒定，篩選含有vp28目的片斷的重組質(zhì)粒，命名為pET-vp28，構(gòu)建圖如圖7所示。
以EcoRI/XhoI雙酶切質(zhì)粒pET22b(+)和pMD18-T28。膠回收兩目的片斷并連接，通過EcoRI/XhoI雙酶切鑒定，篩選陽性重組體，即為成功構(gòu)建pET-vp28表達(dá)載體，見圖6。
4外源蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)A、E.coli BL21(DE3)-pET-vp28的誘導(dǎo)表達(dá)1)從平板上挑取攜帶有質(zhì)粒pET-vp28的大腸桿菌BL21(DE3)單菌落，接種于20mL含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下，250rpm振蕩培養(yǎng)8-12h。
2)次日按4％接種到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約2小時(shí)左右。
3)至菌液OD600值為0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為0.6mM，在37℃下誘導(dǎo)表達(dá)3-5h。
4)菌液在4℃下12,000離心1min，收集菌體。
B、程蛋白的粗提取1)向收集的菌體加入適量PBS，-20℃反復(fù)凍融幾次后，再進(jìn)行超聲波破碎菌處理(4℃，處理3次，每次10秒，間隔30秒)。
2)待菌液變清亮，絕大部分菌體破裂后，4,000rpm離心菌液15-20分鐘。
3)分別收集得到菌體殘?jiān)蜕锨逡骸Ｉ锨逶?℃下12,000rpm繼續(xù)離心15分鐘。
4)收集兩次離心所得上清和沉淀，分別取其1/100加入2×SDS-PAGE加樣緩沖液(100mM Tris-Cl、200mMβ-巰基乙醇、4％SDS、0.2％溴酚藍(lán)、20％甘油)，經(jīng)沸水浴10分鐘后，用12％SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測。
C、表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定SDS-PAGE電泳按照分子克隆上所講述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。濃縮膠的濃度為5％，分離膠的濃度為12％，電泳時(shí)電壓為8V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)指示線到達(dá)分離膠底邊時(shí)，關(guān)掉電源。用0.1％考馬斯亮藍(lán)染液染色4-6h后，再用脫色液(甲醇∶乙酸∶ddH2O＝4∶1∶5)將背景色脫盡為止。
表達(dá)目的蛋白的重組工程菌株E.coli BL21(DE3)-pET-vp28在IPTG(終濃度為0.6mM)誘導(dǎo)下，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4-6h。如圖8所示，在誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)4h、5h、6h的時(shí)候分別取樣，菌液超聲波破碎后得的上清和沉淀用12％SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)在上清中有與預(yù)期大小32kDa相符合的目的蛋白帶，而沉淀中有少量的目的蛋白。
D、Western blotting檢測1)制備用于Western blot分析的SDS-PAGE凝膠，按照分子克隆上所講述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行方法2)待電泳結(jié)束后，切下用于移的一半凝膠，用轉(zhuǎn)移緩沖液TBST溶液清洗凝膠；另一半凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)染色、脫色。
3)剪取一張與聚丙烯酰胺凝膠大小相似的硝酸纖維素濾膜，剪2張大小與硝酸纖維素濾膜完全一樣的3MM濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸潤，將其中一張鋪于電轉(zhuǎn)移裝置上，然后將SDS-PAGE凝膠鋪于3MM濾紙上，用玻璃棒在凝膠上輕輕滾動(dòng)，以防止中間夾有氣泡；4)將硝酸纖維素膜平鋪于凝膠表面，用玻璃棒在硝酸纖維素膜上輕輕滾動(dòng)，以防止中間夾有氣泡；5)將另一張3MM濾紙平鋪于硝酸纖維素膜表面，用玻璃棒在濾紙上輕輕滾動(dòng)，以防止中間夾有氣泡，然后將濾紙/凝膠/膜/濾紙夾層放入電泳裝置內(nèi)，注意凝膠面朝向負(fù)極；按凝膠面積0.65mA/cm2的電流電轉(zhuǎn)移90min。
6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，用25ml TBS.緩沖液洗膜3-5次，每次5min，并不時(shí)輕輕地?fù)u動(dòng)；7)將硝酸纖維素膜浸20ml封閉緩沖液中，室溫輕輕振蕩封閉1小時(shí)。
8)將膜浸入20ml用一抗稀釋緩沖液稀釋的第一抗體中，室溫下輕輕振蕩反應(yīng)1小時(shí)。
9)用25ml TBST緩沖液洗膜3-5次，每次5min，并不時(shí)輕輕地振蕩。
10)將硝酸纖維素膜浸入20ml用封閉緩沖液稀釋好的辣根過氧化酶標(biāo)記的第二抗體溶液中，室溫下輕輕振蕩反應(yīng)1小時(shí)。
11)用50ml TBST緩沖液洗膜3-5次，每次5min，并不時(shí)輕輕地振蕩。
12)用DAB試劑盒染色。
表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)Western blotting檢測，有明顯的雜交帶，大小約32KD，如圖9所示，進(jìn)一步說明vp28在大腸桿菌中得到了表達(dá)。
實(shí)施例4抗WSSV抗體的制備(1)取純化的WSSV VP19、VP28各200μg，混合均勻，免疫新西蘭大白兔，每次免疫間隔時(shí)間為15天。第三次免疫后第十天取血，全血放置在37℃靜置1h，然后在4℃放置過夜，以4000g，4℃離心10min，取上清凍存于-70℃，即為抗WSSV抗血清。
(2)將抗WSSV抗血清用Protein A親合層析柱純化，得到抗WSSV抗體，純化步驟如下1)將3mL抗血清用Protein A親和層析柱的Binding buffer(50mmol/L Tris buffer，pH7.0)稀釋到30mL，以10000g，4℃離心15min，收集上清并用0.45μm濾膜過濾。
2)將處理好的樣品連續(xù)兩次，以1mL/5min的速度流過預(yù)先用Binding buffer平衡好的Protein A SepharoseTMCL-4B柱(1×10cm玻璃柱，內(nèi)裝2mL Protein A Sepharose填料)。
3)以0.5mL/min的流速用Binding buffer沖洗柱子直到基線穩(wěn)定。
4)以0.25mL/min的流速用5CV的Elution buffer(0.1mol/L甘氨酸，pH3.0)洗脫IgGs，分部收集洗脫液，為保持抗體IgGs的活性，收集的同時(shí)在每mL洗脫液中加入200μL Neutralizing buffer(1mol/L Tris-HCl，pH9.0)并立即混勻。
5)用SDS-PAGE分析抗體IgGs的純化效果。
實(shí)施例5載有金標(biāo)抗體的結(jié)合墊的制備(1)膠體金的制備取0.01％的氯金酸溶液100mL，加熱至沸騰，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1％的檸檬酸三鈉水溶液2.0mL，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)槌壬^續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以去離子水恢復(fù)到原體積，用0.1mol/L K2CO3調(diào)pH為9.0。制備的膠體金經(jīng)一次性除菌濾器過濾，裝入潔凈玻璃瓶中4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)金標(biāo)抗體的制備將1μL抗WSSV抗體加入1mL膠體金溶液中，混均，加入10％氯化鈉溶液100μL，觀察顏色變化，如果變藍(lán)，則說明抗體不足，然后逐漸增加抗體量，直至膠體金顏色不變?yōu)闇?zhǔn)，在此基礎(chǔ)上，將此抗體量增加20-30％，此時(shí)為1mL膠體金標(biāo)記的最適抗體量。將純化抗WSSV抗體1.25mg用10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)稀釋至5mL，攪拌下將其加入100mL(1)步制備的膠體金溶液中，10分鐘后加入10％牛血清白蛋白至終濃度為1％；結(jié)合物在15,000g，4℃離心1小時(shí)，棄上清，沉淀用10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)重懸、洗滌、離心后(重復(fù)2次)，用10mL含有1％牛血清白蛋白、0.02％疊氮鈉的50mmol/LPB(Na2HPO4·12H2O 1.386g，NaH2PO4·2H2O 0.176g，溶于100mL去離子水，pH7.4)重懸，即為金標(biāo)抗體，4℃保存。
(3)結(jié)合墊的制備將玻璃纖維膜完全浸沒于上述步驟(2)制成的金標(biāo)抗體溶液中，30分鐘后取出后干燥，即為載有金標(biāo)抗體的結(jié)合墊，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例6硝酸纖維素膜的檢測層的制備在硝酸纖維素膜上用純化后的抗WSSV抗體(1.25mg/mL)劃線，做為檢測線；相距5mm用羊抗兔IgG(2mg/mL)劃線，做為質(zhì)控線。檢測線5近樣品墊2，質(zhì)控線6近吸收墊7，室溫<20～25℃>干燥后于37℃用1％酶解干酪素封閉1小時(shí)，室溫<20～25℃>干燥后，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例7對(duì)蝦白斑綜合癥病毒檢測試紙條應(yīng)用本發(fā)明所用儀器及試劑氯金酸(購自Sigma公司)；羊抗兔IgG(購自Sigma公司)；牛血清白蛋白(購自Amresco公司)；酶解干酪素(購自Sigma公司)；玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜(購自Millipore公司)；羊抗兔IgG(購自Pierce公司)。
使用本發(fā)明的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒現(xiàn)場檢測試紙條，檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的步驟首先，快速地從被檢蝦的蝦鰓中提取對(duì)蝦白斑綜合癥病毒，制備檢測樣品。所述的檢測樣品的制備過程是1)對(duì)于成蝦，取1-2只蝦將蝦腮取出，加入適量純凈水充分搗碎，制成檢測樣品；2)對(duì)于幼蝦，取2-3只整蝦，加入適量純凈水充分搗碎，制成檢測樣品；3)對(duì)于蝦苗，取30只左右整蝦，加入適量純凈水充分搗碎，制成檢測樣品。然后，將試紙條的樣品墊2浸入檢測樣品中，液面不要超過MAX線，5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
陽性結(jié)果檢驗(yàn)層4上下呈現(xiàn)兩條紅色的檢測線5和質(zhì)控線6，表示有WSSV感染；陰性結(jié)果檢驗(yàn)層4上端部呈現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線6，表示無WSSV感染或其WSSV含極低；檢測結(jié)果無效加樣5分鐘內(nèi)，檢驗(yàn)層4上端質(zhì)檢線6處無紅線出現(xiàn)，表示該試紙失效，檢測結(jié)果無效。(見圖2)實(shí)施例8對(duì)蝦白斑綜合癥病毒檢測試紙的特異性與穩(wěn)定性本發(fā)明的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒現(xiàn)場檢測試紙的特異性與穩(wěn)定性測定如下(1)特異性實(shí)驗(yàn)選擇二組樣品，第一組為ddH2O、50mmol/L PB(pH7.4)及健康蝦腮做為陰性樣本；第二組為純化的VP19+VP28、WSSV及患對(duì)蝦白斑綜合癥的蝦腮做為陽性樣本，分別用本發(fā)明的試劑條測試。結(jié)果顯示，每一組所有樣品均為陰性；每二組所有樣品均為陽性。
(2)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將本發(fā)明的試劑條分別置4℃和室溫(20-25℃)30天，取出后分別再用特異性測試的二組樣品進(jìn)行檢測。測試的結(jié)果與特異性測試結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的試紙條，其特征在于，在PVC襯墊(1)的兩端分別設(shè)有樣品墊(2)和吸收墊(7)，在PVC襯墊(1)上設(shè)有硝酸纖維膜檢測層(4)，在硝酸纖維膜檢測層(4)與樣品墊(2)交界處設(shè)有金標(biāo)抗體的結(jié)合墊(3)，在結(jié)合墊(3)一端設(shè)置在樣品墊(2)下，另一端設(shè)置在檢測層(4)上，在檢測層(4)上設(shè)有檢測線(5)和質(zhì)控線(6)，在檢測線(5)和質(zhì)控線(6)處分別包被有抗WSSV抗體和羊抗兔2gG。
2.權(quán)利要求1所述的一種檢測對(duì)蝦白斑綜合病毒試紙條的制備方法，其特征在于A、將WSSV VP19、VP28蛋白1∶1混合，免疫新西蘭大白兔，純化后得抗WSSV多克隆抗體；B、用檸檬酸三鈉還原法制備20-40nm的膠體金顆粒，將抗WSSV抗體加入到膠體金溶液中，加入牛血清白蛋白，離心后的沉淀用含有牛血清白蛋白、疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液懸起，制成抗WSSV金標(biāo)抗體溶液；D、在硝酸纖維素膜上用純化后的抗WSSV抗體劃線，為檢測線；相距5mm用羊抗兔IgG劃線，為質(zhì)控線，室溫干燥后于用1％酶解干酪素封閉，干燥后得到WSSV抗體固相硝酸纖維素膜檢測層。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的試紙條及制備方法，該紙條由PVC襯墊、樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、吸收墊、WSSV抗體固相硝酸纖維素膜檢測層構(gòu)成，然后是WSSV、VP19、VP28線純蛋白、抗WSSV多克隆抗體、抗WSSV金標(biāo)抗體、WSSV抗體固相硝酸纖維素膜檢測層的制備，本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單，制備方法容易，對(duì)蝦斑綜合病病毒檢測簡便、快捷、準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)G01N33/549GK1932520SQ20061012465
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日
發(fā)明者孟小林, 徐進(jìn)平, 程清宇, 魯偉, 王健 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)