專(zhuān)利名稱：對(duì)蝦白斑綜合癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的制備和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行菌樣檢測(cè)的方 法，具體是 一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的制備和檢測(cè)方法。
技術(shù)背景對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus)是新設(shè)立的 Nimaviridae科Whispovirus屬的代表種。對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒W(wǎng)SSV最早 出現(xiàn)在上世紀(jì)90年代初，是一種具有高度感染性和致死性的病毒，嚴(yán)重危 害著全球?qū)οx(chóng)下養(yǎng)殖業(yè)并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，僅我國(guó)自1993年爆發(fā)以來(lái) 已累計(jì)損失數(shù)百億元，成為海水養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病毒。WSSV的肆虐立刻 引起了許多國(guó)家和地區(qū)(中國(guó)、美國(guó)、曰本、臺(tái)灣地區(qū)、荷蘭、印度、韓 國(guó)、新加坡等)的高度重視，但由于缺乏對(duì)病毒遺傳信息和功能特性的了 解，影響了病毒的防治研究。以往檢測(cè)對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒的主要方法有兩種l.癥狀觀察法，觀 察發(fā)病的對(duì)蝦行動(dòng)遲鈍，彈跳無(wú)力，靜臥不動(dòng)或游動(dòng)異常(圍著池邊在水面 兜圈或在水中翻滾，)這種異常行為可在幾小時(shí)內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)，直到最后無(wú)力 活動(dòng)，腹面朝上慢慢沉到水底，或被其他對(duì)蝦吃掉。而患病的斑節(jié)對(duì)蝦在 瀕臨死亡時(shí)則顯示出明顯變藍(lán)的現(xiàn)象，并多伴有腹部肌肉混濁。 一些幸存 的對(duì)蟲(chóng)下可緩慢恢復(fù)正常。個(gè)別蝦可在甲殼、鰓部的表皮下出現(xiàn)大量黑色素 斑點(diǎn)。2.病理確認(rèn)法。該病毒侵害的主要組織和器官是皮下組織、表皮角 質(zhì)層組織，觸角腺、造血組織。病毒寄生在對(duì)蝦大部分的器官，從而導(dǎo)致 全身系統(tǒng)性的壞死；進(jìn)行血相檢查，發(fā)現(xiàn)血淋巴細(xì)胞減少，血淋巴混濁， 淋巴樣器官和肝胰臟腫大。血淋巴液凝固時(shí)間超過(guò)3分鐘。瀕死蝦殼變軟， 血淋巴液發(fā)黃，不易凝固。病毒粒子可在細(xì)胞質(zhì)中繼續(xù)裝配。最后細(xì)胞解 體，病毒粒子再感染周?chē)?xì)胞。在腹部肌肉纖維之間有時(shí)也發(fā)現(xiàn)病毒粒子， 有的病郞在鰓和觸角腺中可看到血細(xì)胞變性壞死，包圍成結(jié)狀構(gòu)造，其大 小約為20 - 50Mm;淋巴樣器官有血細(xì)胞浸潤(rùn)。在顯微鏡下可見(jiàn)，病蝦甲殼 內(nèi)面有直徑數(shù)毫米的白點(diǎn)，呈重瓣的花朵狀，外圍較透明，花紋較清楚， 中部木透明，花紋著木清。白點(diǎn)在頭胸甲上特別清楚，肉眼可見(jiàn)。白點(diǎn)在 酸中容易溶解。3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR法)，該方法較前兩種方法快速、 靈敏，但需要昂貴的PCR儀并電泳觀察結(jié)果，或者使用熒光PCR儀檢測(cè)， 檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和成本高。2004年TomoyaKono報(bào)導(dǎo)了使用LAMP技術(shù)檢測(cè)WSSV的技術(shù)(Tomoya Kono， Ram Savan, Masahiro Sakai, Toshiaki Ttami.Dtection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-medicated isothermal amplification. Journalof Virological Methods. 2004,115,59-65.),但是檢測(cè)WSSV病毒的亞型比較 少，并且沒(méi)有進(jìn)一步防止污染的措施。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供 一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的快速檢測(cè)試劑盒的制 備和檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為 試劑盒l(wèi)-2mL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A、 0. 5-1. 5U/ju L UNG酶、6-10 U/ juL Bst DNA聚合酶B和1-3juL顯色劑C;顯色劑C體積濃度為5%-20°/。；其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A含l-2 mL lOxThermopol反應(yīng)緩 300 - 500jumo1 dNTP、 2-4mmol硫酸鎂、0. 8 - 1. 2 ji mol上游內(nèi)引物、0.8 -1. 2 jumol下游內(nèi)引物、0. 2 - 0. 3 jumol上游外引物、0. 2 - 0. 3 jumol下游 外引物和1-1.5 mol甜菜堿；上游內(nèi)引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下游內(nèi)引物5—ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA—3、上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下i^外弓l物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。所述 dNTP 內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。所述每升10 x The函pol反應(yīng) 緩沖液含100-300mmol pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、80-120mmo1 氯化鉀、80-120mmol硫酸銨、10-30 mmol硫酸鎂和0. 8-1. 5%曲拉通X-100;所述顯色劑為熒光染料SYBR GREEN I或DNAGreen。檢測(cè)方法1) 待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到500-800 |iL 蒸餾水中調(diào)制句漿后，再加入1.0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勻，而后一并加 入到100 - 150 m L滅菌雙蒸水中混勻，并于IO(TC沸水浴中加熱10 - 15 min， 待水洛后將其以10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5-10 min,取上清即為待檢樣品 模板DNA,待用2) 對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在21-23nL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1-2jliL待檢樣 品模板DNA和，0. 5-1. 5 U/jaL UNG酶，于恒溫95 。C放置3-5min，而后 置于冰上1-3min;待冷卻后加入、6-1Q U/|a L Bst DNA聚合酶B,于60 -65。C恒溫放置45 - 90 min;而后再將溫度調(diào)到80 - 95 °C中止反應(yīng)，3-5 min后待用；3) 顯色檢測(cè)在反應(yīng)液中加入1-3^L顯色劑C，觀察顏色變化； 每升環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A含10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液、300 - 500iamoldNTP、 2-4 mmol硫酸鎂、0.8-1.2/a mol上游內(nèi)引物、0. 8 - 1. 2 n mol下游內(nèi)引物、0. 2 - 0. 3m'ho1上游外引物、0. 2 - 0. 3 |a mol下游外引物 和1 - 1. 5 mol甜菜堿；上游內(nèi)引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、 下游內(nèi)引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、 上i^外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、 下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。所述 dNTP 內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。所述每升10 x The函pol反應(yīng) 緩沖液含100-300mmo1 pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、80-120mmol 氯化鉀、80-120mmo1硫酸銨、10-30 mmol硫酸鎂和0. 8-1. 5%曲拉通X-100;所述顯色劑為10%的熒光染料SYBR GREEN I或DNAGreen。所述步驟 3)觀察顏色變化若顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不含或者不是對(duì)蝦白斑綜合 癥病毒，若顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明待檢樣品含有或者為對(duì)蝦白斑綜合癥病 毒。本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設(shè)計(jì)一組可以識(shí)別靶DNA六個(gè)不同序 列的兩個(gè)內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個(gè)外引物(上游外引物 和下游外引物)，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個(gè)內(nèi)引 物首先和靶DNA雜交，隨后的鏈置換薩A合成在具有高度鏈置換活性的DNA 聚合酶的參與下由一個(gè)外引物啟動(dòng)，釋放出單鏈DNA,并作為由雜交到靶的 另一端的一個(gè)內(nèi)引物和一個(gè)外引物啟動(dòng)的DNA合成模板，產(chǎn)生一個(gè)原始的 莖環(huán)DNA; (3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟動(dòng)鏈置換DNA的合成，產(chǎn) 生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA和一個(gè)新的由兩倍莖長(zhǎng)度的莖環(huán)薩A; ( 4 )在等溫條 件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過(guò)鏈置換形成多個(gè)含有靶DNA反復(fù)重 復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時(shí)內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到10'拷貝，可 通過(guò)熒光染料來(lái)觀察擴(kuò)增結(jié)果。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明建立了對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢 測(cè)方法，試劑盒根據(jù)對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒的VP28基因的基本保守區(qū)的六個(gè) 序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物和兩個(gè)特異性外引物，該保守的基因序列為 對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒各不同血清型和菌株型所共有，以保證從種的水平上 檢測(cè)不同來(lái)源的對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒株的可靠性。本發(fā)明釆用環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)，與PCR檢測(cè)方法有相同的高靈敏度， 但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水洛鍋即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳 方法來(lái)觀察，使用熒光染料來(lái)觀察即可，簡(jiǎn)單而快速?？捎糜趯?duì)蝦白斑綜 合癥病毒的檢測(cè)，特別適用于基層養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，使用范圍廣、檢測(cè)結(jié) 果可靠。
具體實(shí)施方式
下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。 實(shí)施例1試劑盒1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A ( LAMP反應(yīng)液A):含有2.5|uL lOxThermopol反應(yīng)緩沖液、1. OjuL 10 mmol/L dNTP、 1. 0|iL 20|amol/L上游內(nèi)引物(FIP)、 1. 0 |i L 20 ju mol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0. 25 |iL 20|amol/L上游外引物(F3 )、 0. 25 ju L 20 n mol/L下游外引物(B3 )、 0. 5|aL 100 mmol/L MgS04、 12.5juL 2 mol/L甜菜堿和4 ju L ddH20 (滅菌雙蒸水)。上游內(nèi)引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下游內(nèi)引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3 (參見(jiàn)序列表)。其中dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2: 1: 1: 1。2 ) 1U/ ju L UNG酶(購(gòu)自New England Biolabs )、 8U/ ju L Bst DNA聚合酶B (購(gòu)自New England Bi。labs )禾口 1 |i L顯色劑C;所述10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液為200 i腦l /L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100 mmol/L氯化鉀、100 mmol/L硫酸銨、20 mmol/L硫酸鎂和1。/。曲拉通X-100，顯色劑C為10。/。的熒光染料SYBR GREEN I (天根生物有限公司)。 檢測(cè)方法1) 待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到500|iL蒸餾 水中調(diào)制勻漿后，置于1.5mL離心管中，再加入1.0-1.5 raL滅菌雙蒸水 混句，而后一并加入到100nL滅菌雙蒸水中混勻，并于10(TC沸水浴中加 熱lOmin,待水浴后將其以10000轉(zhuǎn)/分離心10 min，取上清即為待檢樣 品模板DNA，待用2) 對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在23 n L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A中加入1 ju L待檢樣品DNA模板和0. 5 U/]uL的UNG酶，置于95。C下恒溫放置5 min，而后置于冰上1 min;待冷 卻后加入加入8 U/|iL Bst DNA聚合酶B，于65。C恒溫放置60min;而后 再將溫度調(diào)到8(TC中止反應(yīng)，3min后待用；3) 顯色檢測(cè)在反應(yīng)液中加入l|aL10% (體積濃度)的熒光染料SYBR GREEN I,直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不含 或者不是對(duì)蝦白斑綜合癥病毒，如果顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明待檢樣品含有或者為對(duì)蝦白斑綜合癥病毒。其中，LAMP反應(yīng)液A:含有2. 5pL 10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液、1.0 HL 10 mmol/L dNTP、 l.OjuL 20 p mol/L上游內(nèi)引物(FIP )、 l.OjuL 20 jamol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0.25 |iL 20|imol/L上游外引物(F3)、 0.25 juL 20 jLimol/L下游外引物(B3)、 0, 5 juL 100 mmol/L MgS04、 12. 5 juL 2 mol/L 甜菜堿和 4 ju L ddH20 (滅菌雙蒸水)。上游內(nèi)引物 5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3 、 下游內(nèi)引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3 、 上游外引物 5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3 (參 見(jiàn)序列表)。dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2: 1: 1: 1。所述每升10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液為200 mmol /L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100 mmol/L氯化鉀、100 隱ol/L硫酸銨、20隱ol/L硫酸鎂和1%曲拉通X-100, 實(shí)施例2與實(shí)施例l不同之處在于試劑盒l(wèi)mLLAMP反應(yīng)液A、 1.5U/|iLUNG 酶(購(gòu)自New England Biolabs )、 6 U/ |U L Bst DNA聚合酶B (購(gòu)自New England Biolabs)和l)iL體積濃度為5。/。的熒光染料DNAGreen(購(gòu)自于天根生物有限 公司)；其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A含lmL 10 x Thermopol反應(yīng)緩300 jumoldNTP、 2mmol硫酸鎂、0. 8 ju mol上游內(nèi)引物、0. 8 |a mol下游內(nèi)引物、0. 2|amol上游外引物、0.2,1下游外引物和lmol甜菜堿和4 ju L ddH20 (滅菌雙蒸水)；所述dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP:l. 5: 1: 1: 1;所述每升10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液含 lOO隨ol pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、80mmol氯化鉀、80mmol硫 酸銨、10 mmol硫酸鎂和0. 8 %曲拉通X - 100。檢測(cè)方法1 )待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到 800|aL蒸餾水中調(diào)制勻漿后，置于1. 5mL離心管中，再加入1. 0 - 1. 5 mL 滅菌雙蒸水混勻，而后一并加入到150nL滅菌雙蒸水中混勻，并于10(TC 沸水洛中加熱10min，待水浴后將其以10000轉(zhuǎn)/分離心10min，取上清即 為待檢樣品模板DNA,待用2)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在23 juL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A中加入luL待檢樣品DNA模板和1. 5U/|iL的UNG酶，置于95。C下恒溫放置5min,而后置于冰上3min;待 冷卻后加入加入6 U/juL Bst DNA聚合酶B，于65'C恒溫放置45min;而 后再將溫度調(diào)到80'C中止反應(yīng)，3min后待用；3)顯色檢測(cè)在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入ljaL體積濃度為5%的熒光 染料讓AGreen的顯色劑C,直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色， 說(shuō)明待檢樣品不含或者不是對(duì)蝦白斑綜合癥病毒，如果顏色變?yōu)榫G色，則 說(shuō)明待檢樣品含有或者為對(duì)蝦白斑綜合癥病毒。實(shí)施例3與實(shí)施例l不同之處在于試劑盒2 mL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A、 1.5U/juL UNG酶、10 U/jiL Bst DNA聚合酶B和3 |a L體積濃度20%顯色劑c;其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A含2 mL 10 x Thermopol反應(yīng)緩500 iamoldNTP、 4mmol硫酸鎂、1. 2 m mol上游內(nèi)引物、1. 2 |a mol下游內(nèi)引物、0. 3nmo1上游外引物、0. 3jumo1下游外引物和1. 5 mol甜菜堿；所述的dNTP 內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。所述 每升lOxThermopol反應(yīng)緩沖液為300mmol pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷 -鹽酸、120mmol氯化鉀、120mmol硫酸銨、30 mmol硫酸鎂和1. 5 %曲拉 通X- 100。
檢測(cè)方法l)待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到600 juL蒸餾水中調(diào)制勻漿后，再加入l. 0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勻，而后一并 加入到150ML滅菌雙蒸水中混勻，并于IO(TC沸水洛中加熱12min，待水 洛后將其以11000轉(zhuǎn)/分離心8min，取上清即為待檢樣品模板DNA,待用
2) 對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在22 nL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 反應(yīng)液A中加入1. 5 |i L待檢樣品DNA模板和1. 5U/ p L的UNG酶，置于95 。C下恒溫放置4min，而后置于冰上2min;待冷卻后加入10U/ ja L Bst DNA聚 合酶B，于62。C恒溫放置60min;而后再將溫度調(diào)到90°C中止反應(yīng)，4 min 后待用；
3) 顯色檢測(cè)在反應(yīng)液中加入3juL體積濃度20y。顯色劑C，觀察顏色變 實(shí)施例4
與實(shí)施例l不同之處在于試劑盒1. 5 mL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A、 lU/juLUNG酶、9U/juLBstDNA聚合酶B和2 y L體積濃度為15%顯色劑C;
其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A含1. 5mL lOxThermopol反應(yīng)緩 400 iamoldNTP、 3mmo1硫酸鎂、ljamol上游內(nèi)引物、1 p mol下游內(nèi)引物、 0. 25jLitno1上游外引物、0. 25jLimo1下游外引物和1. 2mo1甜菜堿；
所述的dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。所述每升10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液為200mmol pH8. 8的三羥基 甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol氯化鉀、lOOmmol硫酸銨、20 mmol硫酸鎂 和1%曲拉通X - 100。
檢測(cè)方法1 )待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入 到700)iL蒸餾水中調(diào)制勻漿后，再加入l. 0-1. 5 mL滅菌雙蒸水混勻，而 后一并加入到130laL滅菌雙蒸水中混勻，并于10(TC沸水洛中加熱13min， 待水洛后將其以10000轉(zhuǎn)/分離心7min,取上清即為待檢樣品模板DNA， 待用
2 )對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在22 nL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反 應(yīng)液A中力口入2 )i L待檢樣品DNA模板和1U/ m l的UNG酶，置于95。C下恒 溫放置3min，而后置于冰上2min;待冷卻后加入9U/)aL Bst DNA聚合酶 B，于63。C恒溫放置80min;而后再將溫度調(diào)到85°C中止反應(yīng)，4 min后待 用；
3)顯色檢測(cè)在反應(yīng)液中加入2pL體積濃度為15y。顯色劑C,觀察顏色 變化。SEQUENCE LISTING 〈110>中閨科學(xué)院海洋研究所
〈120〉對(duì)臥CJ斑綜合癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的制備和檢測(cè)方法
〈130〉
〈160〉 4
〈170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 38
〈212〉 DNA <213>人T.序列
〈220〉
〈221〉 prim—bind
〈222〉 (1). . (38) 〈223〉
〈400> 1
accacctttg gcgcaccaat cgt,gcacgt,a catgtcga 38
<210> 2
〈211> 42
〈212〉 腿
<213〉 人工序列
〈220〉
<221> prim—bind
<222〉 (1)..(42) 《223〉
〈400〉 2
accacacaca aaggtgccaa ctctttgtcg gtagctccaa ca 42
<210〉 3
〈211〉 20
〈212〉 DNA〈213> 人.T.序列 《220〉
〈221> prim—bind
〈222〉 (1). . (20) <223〉
<400> 3
ggtctcagtg ccagagtagg 加
〈210〉 4
〈211> 20
<212> DNA
〈213〉 人工序列
〈220〉
〈221〉 pi'im—bind
〈222〉 (1). . (20) <223〉
〈400〉 4
tggtgccaaa gattaaccca 20
權(quán)利要求
1.一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于1-2mL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A、0.5-1.5U/μL UNG酶、6-10U/μL BstDNA聚合酶B和1-3μL顯色劑C；其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A含1-2mL 10×Thermopol反應(yīng)緩300-500μmol dNTP、2-4mmol硫酸鎂、0.8-1.2μmol上游內(nèi)引物、0.8-1.2μmol下游內(nèi)引物、0.2-0.3μmol上游外引物、0.2-0.3μmol下游外引物和1-1.5mol甜菜堿；上游內(nèi)引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下游內(nèi)引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鰻弧菌快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述 dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到 2: 1: 1: 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鰻弧菌快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述 每升lOxThe腦pol反應(yīng)緩沖液含100-300mmol pH8. 8的三羥基甲基氨基 甲烷-鹽酸、80-120mmol氯化鉀、80-120mmol硫酸銨、10-30 mmol硫酸鎂 和0. 8-1.5 %曲拉通X-100;所述顯色劑為的熒光染料SYBR GREEN I或 DNAGreen。
4. 一種按權(quán)利要求1所述的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè) 方法，其特征在于1) 待檢樣品DNA模板的提取取200 mg待檢樣品加入到500-800 |aL 蒸餾水中調(diào)制勻漿后，再加入1.0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勻，而后一并加 入到100 - 150 |i L滅菌雙蒸水中混句，并于IO(TC沸水洛中加熱10 - 15 rain, 待水浴后將其以10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5-10min,取上清即為待檢樣品 模板DNA，待用2) 對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在21-23 n L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1-2 (i L待檢樣 品模板DNA和，G. 5-1.5 U/iuL UNG酶，于恒溫95 。C放置3-5min,而后 置于冰上1-3 mill;待冷卻后加入、6-10 U/|a L Bst DNA聚合酶B，于60 -65。C恒溫放置45 - 90 min;而后再將溫度調(diào)到80 - 95°C中止反應(yīng)，3-5 min后待用；3) 顯色檢測(cè)在反應(yīng)液中加入l-3pL顯色劑C，觀察顏色變化； 每升環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A含10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液、300 - 500拜ld證、2-4 mmol硫酸鎂、0. 8 - 1. 2 n mol上游內(nèi)引物、0. 8 - 1. 2 |a mol下游內(nèi)引物、0.2-0. 3jumo1上游外引物、0.2-0. 3jumo1下游外引物和1 - 1. 5 mol甜菜堿；上游內(nèi)引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、 下游內(nèi)引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、 上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、 下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。
5. 按權(quán)利要求4所述的鰻弧菌快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在 于所述dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。
6. 按權(quán)利要求4所述的鰻弧菌快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在 于所述每升lOxThermopol反應(yīng)緩沖液含100_300mmol pH8. 8的三羥基 甲基氨基甲烷-鹽酸、80-120腿o1氯化鉀、80-120隱o1硫酸銨、10-30隱o1 硫酸鎂和0. 8-1.5 %曲拉通X-100;所述顯色劑為10%的熒光染料SYBR GREEN I或醒Green。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4中所述的對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的檢 測(cè)方法，其特征在于所述步驟3)觀察顏色變化若顏色為黃色，說(shuō)明待檢 樣品不含或者不是對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒，若顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明待檢樣 品含有或者為對(duì)蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行菌樣檢測(cè)的方法，具體是一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的制備和檢測(cè)方法。試劑盒包含1-2mL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A、0.5-1.5U/μL UNG酶、6-10U/μL BstDNA聚合酶B和1-3μL顯色劑C；上游內(nèi)引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下游內(nèi)引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。本發(fā)明用于對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的檢測(cè)，特別適用于基層養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，使用范圍廣、檢測(cè)結(jié)果可靠。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101307364SQ200810015290
公開(kāi)日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2008年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日
發(fā)明者李富花, 相建海, 高宏偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所