專利名稱：吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材的指紋圖譜的建立方法，尤其是吳茱萸脂溶性高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的建立方法，以及由此方法所得到的吳茱萸脂溶性成分標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
背景技術(shù)：
我國傳統(tǒng)的中藥及其制劑大多缺乏嚴(yán)密的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)的檢測手段，難以有效的控制其內(nèi)在質(zhì)量，不能保證用藥的安全、有效，也不符合國際醫(yī)藥市場的要求，嚴(yán)重制約了我國中藥行業(yè)的發(fā)展。加強中藥材質(zhì)量控制研究是中藥規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵問題。只有對中藥材進行科學(xué)的質(zhì)量控制，才能保證中藥質(zhì)量，實現(xiàn)中藥的“安全、有效、穩(wěn)定、可控”。
吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.或石虎Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實。8～11月果實尚未開裂時，剪下果枝，曬干或低溫干燥，除去枝、葉、果梗等雜質(zhì)。別名米辣子、臭辣子樹、氣辣子、曲藥子、茶辣子等。吳茱萸為常用中藥材；也是常用苗藥。性味功能與主治辛、苦、熱；有小毒；有散寒止痛、降逆止嘔和助陽止瀉之功效，常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等，外治口瘡，高血壓癥。眾所周知，吳茱萸藥材成分復(fù)雜，主要包括以下幾類生物堿、苦味素、苯并色原酮類、萜類、黃酮、香豆精、木脂素、甾類化合物、揮發(fā)油和有機酸類。研究表明，吳茱萸的多種化學(xué)成分有各種具體的藥理作用。因此，對其某一種或幾種活性成分進行檢測，就有失全面。不能真實反映吳茱萸藥效的整體性。要全面有效地控制吳茱萸及其成方制劑的質(zhì)量，必須對它的物質(zhì)群整體予以控制。
中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，指紋圖譜對于有效控制中藥材或中成藥的質(zhì)量，具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20世紀(jì)80年代就采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。德國、法國在對銀杏葉提取物的質(zhì)量控制中亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國FDA近幾年制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法。指紋圖譜作為中草藥及其提取物質(zhì)量控制方法，目前已成為國際共識。為了有效控制吳茱萸藥材的質(zhì)量，使其質(zhì)量控制技術(shù)更加完善、科學(xué)，申請人對吳茱萸的脂溶性物質(zhì)進行了全面系統(tǒng)的指紋圖譜研究，建立了吳茱萸脂溶性提取物的指紋圖譜測定方法

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明通過對吳茱萸脂溶性提取物HPLC指紋圖譜的研究，提供了一種更好的吳茱萸質(zhì)量控制方法，彌補了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足，使吳茱萸藥材的質(zhì)量控制技術(shù)更為完善、科學(xué)。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法包括以下步驟(1)供試品溶液的制備取吳茱萸藥材粉碎，過篩，稱取樣品，用氯仿超聲提取1～3次，然后濃縮，用乙醇與四氫呋喃的混合溶液定容，過濾，濾液作為供試品溶液；(2)對照品溶液的制備取適量對照品，加入乙醇與四氫呋喃的混合溶液制成對照品溶液；(3)測定分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，用高效液相色譜儀測定；將吳茱萸供試品溶液注入高效液相色譜儀進行洗脫，以水為A相、乙腈為B相進行梯度洗脫，洗脫液進入DAD紫外檢測器，檢測器采集66min的檢測數(shù)據(jù)；(4)以對照品色譜峰的相對保留時間和峰面積為1，計算相對保留時間和峰面積，用指紋圖譜軟件對所得的數(shù)據(jù)和圖譜進行處理，即得到吳茱萸脂溶性成分標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
其中，高效液相色譜測定時的色譜條件為色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為B相乙腈和A相水；檢測波長220±1nm；理論塔板數(shù)按吳茱萸堿峰計算應(yīng)不低于3000。
供試品溶液的制備過程為取吳茱萸藥材粉碎過60目篩，準(zhǔn)確稱取樣品1克，加氨水5mL潤濕，加80mL氯仿超聲提取2次，每次25min，然后濃縮至干，用乙醇∶四氫呋喃＝4∶1溶液定容至10mL，過濾，即得供試品溶液。
對照品溶液的制備為取吳茱萸堿、吳茱萸次堿兩種對照品，分別加入乙醇∶四氫呋喃＝4∶1溶液，制成每1ml各含10ug吳茱萸堿、吳茱萸次堿的兩種對照品溶液。
步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10uL。
流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的A、B相變化為開始時，A相75％，B相25％，穩(wěn)定2min；到第20min時，A相58％，B相42％；穩(wěn)定14分鐘；到第35min時，A相30％，B相70％；到第54min時，A相15％，B相85％，穩(wěn)定2min；到第56min時，A相為0，B相100％，穩(wěn)定10min。
按照上述吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法得到的吳茱萸脂溶性成分標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中的共用峰不得少于31個。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.研究表明，吳茱萸的多種化學(xué)成分有各種具體的藥理作用。對其某一種活性成分進行檢測，就有失全面。本發(fā)明以吳茱萸脂溶性提取物建立起來的HPLC指紋圖譜，代表了吳茱萸大部分藥理活性，能有效地表征吳茱萸藥材的質(zhì)量。提供了一種全面評價吳茱萸藥材的科學(xué)方法，可作為吳茱萸質(zhì)量檢測和質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)之一。
2.將吳茱萸指紋圖譜作為一個整體看待，注重其整體面貌特征，既避免了只測定一、二個化學(xué)成分來判定吳茱萸整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達標(biāo)而人為處理的可能性。本發(fā)明為完整、準(zhǔn)確評價吳茱萸的質(zhì)量提供了新的對照標(biāo)準(zhǔn)，為提高吳茱萸及其成方制劑的質(zhì)量和療效做出貢獻。
3.本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高以及重現(xiàn)性好等特點。由于指紋圖譜不是為了測定某個成分的精確含量，而是要充分反映化學(xué)成分的信息。因此，本發(fā)明選擇在220±1nm波長處進行測定，其出峰較多，反映的信息較完全；各個峰吸收值良好，基線平穩(wěn)，也避免了近紫外雜質(zhì)峰較大吸收情況。
4.以往為測定吳茱萸中某種化學(xué)成分的含量，往往要對樣品進行較復(fù)雜的處理，而本發(fā)明選用超聲提取其脂溶性成分，提取方法簡單，時間短，節(jié)約了檢驗的成本和時間。
5.本發(fā)明方法所得脂溶性指紋圖譜的峰多，峰形好，易于鑒別，相似性高，準(zhǔn)確可靠。
下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。


圖1是酸性乙醇提取法所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖2是堿性氯仿提取法所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖3是混合溶劑提取法所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖4是用甲醇-水系統(tǒng)作流動相所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖5是用乙腈-水系統(tǒng)作流動相所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖6是用乙腈-水(含乙酸銨)系統(tǒng)作流動相所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖7是用色譜柱①Hypersil ODS2 PN13120520183所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖8是用色譜柱②Hypersil ODS2 PN13120400215所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖9是用色譜柱③Hypersil ODS2 PN7991618-584所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖10是用色譜柱④ZORBAX RX-C18PN880967-902所得吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖11是分別在235nm、218nm、220nm、225nm、230nm波長處進行測定的吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
圖12是吳茱萸脂溶性成分的DAD全掃描3D圖。
圖13是吳茱萸藥材脂溶性指紋圖譜的共有模式圖。
圖14是36批吳茱萸藥材脂溶性指紋圖譜的疊加圖。
圖15是吳茱萸藥材脂溶性HPLC指紋圖譜。
具體實施例方式
具體實施例方式吳茱萸脂溶性HPLC指紋圖譜的建立方法及吳茱萸脂溶性成分標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜1.儀器與試藥1.1儀器安捷倫1100高效液相色譜儀；安捷倫DAD檢測器；安捷倫色譜工作站。
1.2試藥吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內(nèi)酯，三種對照品購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈，色譜純；蒸餾水；針筒式微孔濾膜過濾器，直徑13mm，0.45um；吳茱萸藥材2.方法與結(jié)果2.1提取方法的選擇吳茱萸中生物堿是主要成分之一，本實驗在考察脂溶性提取條件的同時，盡量將生物堿提取出來。生物堿提取方法按提取溶劑一般分為醇類溶劑提取法，親脂性溶劑提取法及混合溶劑提取法。據(jù)文獻報道超聲提取生物堿效率較高，因此，選用超聲提取的方法來提取。同時做了提取溶劑的考察。①酸性乙醇提取法75％乙醇溶液(含1％HCl)的溶劑來提取。②堿性氯仿提取法用5mL濃NH3·H2O潤濕，加氯仿溶劑來提取。③混合溶劑提取法甲醇∶氯仿＝2∶1的混合溶劑來提取。所得結(jié)果見附圖1、圖2、圖3。由圖可見，方法②的譜圖最好。因此，選擇方法②來做吳茱萸脂溶性指紋圖譜。
2.2色譜條件2.2.1流動相的選擇申請人用了三組流動相來比較，即甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)和乙腈-水(含乙酸銨)系統(tǒng)。所得結(jié)果見附圖4、圖5、圖6。由圖可見，圖5的譜圖最好。也就是乙腈-水系統(tǒng)做流動相效果比甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水(含乙酸銨)系統(tǒng)明顯要好，梯度洗脫效果最佳，譜圖上各個色譜峰的分離度良好，保留時間適中，因此選擇乙腈-水系統(tǒng)作為流動相梯度洗脫系統(tǒng)。
2.2.2液相色譜柱的選擇指紋圖譜的研究一般需要用三根以上不同的色譜柱進行比較，經(jīng)過實驗比較后，固定用同一根色譜柱做完整個指紋圖譜。申請人考察了四根不同的色譜柱[①大連依利特科學(xué)儀器有限公司Hypersil ODS2 PN13120520183(4.6×250mm，5mm)②大連依利特科學(xué)儀器有限公司Hypersil ODS2 PN13120400215(4.6×250mm，5mm)③AgilentTechnologiesHypersil ODS2 PN7991618-584(4.6×250mm，5mm)④AgilentTechnologiesZORBAX RX-C18PN880967-902(4.6×250mm，5μm))在選定的相同色譜條件下進行測定。
由所得譜圖結(jié)果(見附圖7、圖8、圖9、圖10)表明柱④的分離效果最好，柱效最高，故選擇柱④進行吳茱萸脂溶性指紋圖譜的檢測。
2.2.3檢測波長的選擇2005版藥典對吳茱萸藥材中吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量測定，用的檢測波長是225nm，故申請人選擇了218nm、220nm、225nm、230nm和235nm這五個波長同時進行檢測，見附圖11。
同時還利用DAD二極管陣列檢測器，對脂溶性部分進行全波長掃描，見附圖12。在選擇吳茱萸堿和吳茱萸次堿的較大吸收的同時，也兼顧其它色譜峰的吸收值，故選擇220nm這個檢測波長來做吳茱萸脂溶性指紋圖譜，各個峰吸收值良好，基線平穩(wěn)，也避免了近紫外雜質(zhì)峰較大吸收情況。
通過以上實驗，確定了色譜條件如下色譜柱十八烷基鍵合硅膠；流動相乙腈-水；流速1mL/min；檢測波長220±1nm；柱溫25℃；理論塔板數(shù)按吳茱萸堿峰計算應(yīng)不低于3000。
3.脂溶性指紋圖譜的測定3.1.1吳茱萸脂溶性指紋圖譜的制備對照品溶液的制備取吳茱萸堿、吳茱萸次堿兩種對照品，分別加入乙醇∶四氫呋喃＝4∶1溶液，制成每1ml各含10ug吳茱萸堿、吳茱萸次堿的兩種對照品溶液。
參照物選用吳茱萸堿、吳茱萸次堿作為參照物。
供試品溶液的制備取吳茱萸藥材粉碎過60目篩，準(zhǔn)確稱取樣品1克，加氨水5mL潤濕，再加80mL氯仿超聲提取兩次，每次25min，然后濃縮至干，用乙醇∶四氫呋喃＝4∶1溶液定容至10mL，過濾，即得供試品溶液。
分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10uL，分別注入高效液相色譜儀，進行測定，記錄66分鐘的色譜圖，即得到所需指紋圖譜。以吳茱萸堿、吳茱萸次堿色譜峰的相對保留時間和峰面積計算相對保留時間和相對峰面積。同時，用指紋圖譜軟件對所得數(shù)據(jù)和圖譜進行處理即得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
3.1.2精密度實驗取江西樟樹的吳茱萸藥材，按建立的供試品溶液制備方法制備供試品，連續(xù)進樣6次，以吳茱萸堿為檢測指標(biāo)，計算相對峰面積的RSD為0.16％，結(jié)果表明儀器精密度良好。
3.1.3穩(wěn)定性實驗取銅仁江口的吳茱萸藥材，按建立的供試品溶液制備方法制備供試品，分別在0、2、4、8、12、24h進樣，進樣量為10uL，以吳茱萸堿為檢測指標(biāo)，計算相對峰面積的RSD為1.42％，結(jié)果表明在24小時內(nèi)，吳茱萸色譜指紋圖譜的圖基本穩(wěn)定，沒有明顯變化，符合指紋圖譜要求。
3.1.4重現(xiàn)性實驗取江西樟樹的吳茱萸藥材6份，按建立的供試品溶液制備方法平行制備6份供試品，分別進樣，以吳茱萸堿為檢測指標(biāo)，計算相對峰面積的RSD為1.35％，結(jié)果表明該方法的重現(xiàn)性良好。
3.1.5吳茱萸脂溶性指紋圖譜共有峰的確定和相似度計算通過對全國36批不同產(chǎn)地的吳茱萸脂溶性指紋圖譜的測定，并通過計算機輔助相似度評價系統(tǒng)指紋圖譜軟件(如中南大學(xué)開發(fā)的“計算機輔助相似度評價系統(tǒng)”)對色譜圖和測定的數(shù)據(jù)進行處理，確定共有峰31個。得到了36批藥材的脂溶性指紋圖譜疊加圖(附圖14)，脂溶性指紋圖譜共有模式圖(附圖13，脂溶性指紋圖譜的相似性分析結(jié)果(表1)，其中以吳茱萸堿、吳茱萸次堿為參照物，其峰分別為19號和21號峰，見附圖13。
全國不同產(chǎn)地吳茱萸脂溶性指紋圖譜相似度計算和相似性分析結(jié)果如下表1 36批全國吳茱萸藥材脂溶性指紋圖譜的相似性分析結(jié)果


3.1.6共有特征峰的描述(見附圖13)(1)特征峰共有31個，其中以吳茱萸堿的峰面積最大，最高。
(2)1、3、9、10、16、21、27、29共八個峰的峰面積和峰高較大。
(3)對照品吳茱萸堿和吳茱萸次堿的峰高、峰面積和峰形都很好。所得吳茱萸藥材的共有指紋圖譜如附圖13。
(4)共有特征峰的相似系數(shù)整體較高。說明指紋圖譜的相似性較高，可作為吳茱萸藥材的脂溶性標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
4.以上實驗結(jié)果表明，應(yīng)用該方法對吳茱萸脂溶性成分進行測定，方法簡單可靠。建立的指紋圖譜，峰形好，峰分離效果好，峰面積較大?？勺鳛閰擒镙侵苄猿煞值臉?biāo)準(zhǔn)圖譜。對吳茱萸種植、生產(chǎn)的質(zhì)量控制和吳茱萸的鑒別提供了一個很好的方法。
權(quán)利要求
1.一種吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法，其特征在于它包括以下步驟(1)供試品溶液的制備取吳茱萸藥材粉碎，過篩，稱取樣品，用氯仿超聲提取1～3次，然后濃縮，用乙醇與四氫呋喃的混合溶液定容，過濾，濾液作為供試品溶液；(2)對照品溶液的制備取適量對照品，加入乙醇與四氫呋喃的混合溶液制成對照品溶液；(3)測定分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，用高效液相色譜儀測定；將吳茱萸供試品溶液注入高效液相色譜儀進行洗脫，以水為A相、乙腈為B相進行梯度洗脫，洗脫液進入DAD紫外檢測器，檢測器采集66min的檢測數(shù)據(jù)；(4)以對照品色譜峰的相對保留時間和峰面積為1，計算相對保留時間和峰面積，用指紋圖譜軟件對所得的數(shù)據(jù)和圖譜進行處理，即得到吳茱萸脂溶性成分標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
2.按照權(quán)利要求1所述吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法，其特征在于高效液相色譜測定時的色譜條件為色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為B相乙腈和A相水；檢測波長220±1nm；理論塔板數(shù)按吳茱萸堿峰計算應(yīng)不低于3000。
3.按照權(quán)利要求1所述吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法，其特征在于供試品溶液的制備過程為取吳茱萸藥材粉碎過60目篩，準(zhǔn)確稱取樣品1克，加氨水5mL潤濕，加80mL氯仿超聲提取2次，每次25min，然后濃縮至干，用乙醇∶四氫呋喃＝4∶1溶液定容至10mL，過濾，即得供試品溶液。
4.按照權(quán)利要求1所述吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法，其特征在于對照品溶液的制備為取吳茱萸堿、吳茱萸次堿兩種對照品，分別加入乙醇∶四氫呋喃＝4∶1溶液，制成每1ml各含10ug吳茱萸堿、吳茱萸次堿的兩種對照品溶液。
5.按照權(quán)利要求1所述吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法，其特征在于步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10uL。
6.按照權(quán)利要求1所述吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法，其特征在于流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的A、B相變化為開始時，A相75％，B相25％，穩(wěn)定2min；到第20min時，A相58％，B相42％；穩(wěn)定14分鐘；到第35min時，A相30％，B相70％；到第54min時，A相15％，B相85％，穩(wěn)定2min；到第56min時，A相為0，B相100％，穩(wěn)定10min。
7.如權(quán)利要求1所述吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法得到的吳茱萸脂溶性成分標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
8.按照權(quán)利要求7所述的吳茱萸脂溶性成分標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其特征在于所述圖譜中的共用峰不得少于31個。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種吳茱萸脂溶性指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，包括供試品溶液的制備，對照品溶液的制備，用高效液相色譜儀測定，用指紋圖譜軟件對所得的數(shù)據(jù)和圖譜進行處理，即得到吳茱萸脂溶性成分標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高以及重現(xiàn)性好等特點；脂溶性成分的提取方法簡單，時間短；所得脂溶性指紋圖譜的峰多，峰形好，易于鑒別，相似性高，準(zhǔn)確可靠；所建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜能有效地表征吳茱萸藥材的質(zhì)量，為完整、準(zhǔn)確評價吳茱萸的質(zhì)量提供了新的對照標(biāo)準(zhǔn)，為提高吳茱萸及其成方制劑的質(zhì)量和療效做出貢獻。
文檔編號G01N30/26GK1932506SQ20061020091
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月26日
發(fā)明者周欣, 陳華國, 雷培海, 劉海, 周偉 申請人:貴州師范大學(xué)