超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法，所述的9種脂溶性維生素分別為：維生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、輔酶Q10、番茄紅素和葉黃素；采用超高效液相色譜儀檢測經(jīng)過預(yù)處理的血清中的上述9種脂溶性維生素，通過樣品的響應(yīng)值的大小與標(biāo)準(zhǔn)品的比較計算上述9種脂溶性維生素的含量。本發(fā)明方法的優(yōu)勢是：節(jié)省樣品，200微升樣品，可以實現(xiàn)九種脂溶性維生素分析；節(jié)約時間，將最佳吸收波長不同的九種目標(biāo)組分整合在一個方案中在12.5分鐘內(nèi)可以完成分離分析；節(jié)約成本，避免大量有機試劑消耗及儀器損耗。
【專利說明】超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法，屬于 分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 脂溶性維生素泛指可溶于脂肪及脂溶劑的一類維生素。本發(fā)明主要針對其中對人 體正常生長代謝及機能調(diào)節(jié)至關(guān)重要的9種維生素進行分析，包括維生素 A、α -生育酚、 生育酚、生育酚、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、輔酶Q10、番茄紅素和葉黃素。
[0003] 其中，維生素 Α對于良好的視力、胚胎和嬰兒的正常發(fā)育、免疫系統(tǒng)的功能、生長、 骨骼的形成、繁殖及傷口的愈合都是必不可少的；α-生育酚、 Y-生育酚、δ-生育酚是維 生素 Ε的三種常見形式，它們是高度活躍的自由基清除劑，保護脂質(zhì)膜不被氧化，α -生育 酚阻抑了蛋白酶C的活性，Υ -生育酚作為活性氮氧化物，是一種對抗在體內(nèi)引發(fā)疾病的 化合物的強大后衛(wèi)；胡蘿卜素中比較重要的β_胡蘿卜素可以轉(zhuǎn)換成維生素 Α，胡蘿卜的攝 入有助于消除動脈硬化、癌癥、眼疾等疾病的發(fā)生；蕃茄紅素是目前被發(fā)現(xiàn)的最強抗氧化劑 之一，它可以有效防治因衰老、免疫力下降引起的各種疾??；輔酶Q10是一種強還原劑，能 防止脂質(zhì)過氧化；葉黃素是一種性能優(yōu)異的抗氧化劑，可抵御氧自由基在人體內(nèi)造成細胞 與器官損傷，另外對于保護視力、降低白內(nèi)障的發(fā)生率、延緩動脈硬化、抗癌等都有非常重 要的意義。
[0004] 上述這些脂溶性維生素與人體正常生長發(fā)育，代謝功能都息息相關(guān)，其在血清中 含量的檢測對考察這些物質(zhì)在體內(nèi)的代謝途徑、探查疾病機理以及考察某些藥物的作用效 果等等都有著指導(dǎo)意義。目前尚未見同時檢測這9種物質(zhì)的方法的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠利用超高效液相色譜技術(shù)同時測定 血清中9種脂溶性維生素的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法，所述的9種脂溶性維 生素分別為：維生素 Α、α-生育酚、生育酚、δ-生育酚、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、 輔酶Q10、番茄紅素和葉黃素；
[0008] 采用超高效液相色譜儀檢測經(jīng)過預(yù)處理的血清中的上述9種脂溶性維生素，通過 樣品的響應(yīng)值的大小與標(biāo)準(zhǔn)品的比較計算上述9種脂溶性維生素的含量，具體色譜條件 為：
[0009] (1)色譜柱型號：ΒΗ1 C18 1. 7 μ m*2. 1 μ m*50mm ;
[0010] ⑵流動相：
[0011] 流動相A :0. 1 % v/v三氟乙酸水溶液；
[0012] 流動相B:乙醇；
[0013] 流動相C :0· 1% v/v三氟乙酸甲醇溶液；
[0014] 流動相梯度見表1，流動相按照表1中的梯度保留時間均勻變化；
[0015] 表1流動相梯度洗脫參數(shù)
[0016]

【權(quán)利要求】
1. 超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法，其特征在于， 所述的9種脂溶性維生素分別為：維生素 A、α -生育酚、Y -生育酚、δ -生育酚、α -胡 蘿卜素、β-胡蘿卜素、輔酶Q10、番茄紅素和葉黃素； 采用超高效液相色譜儀檢測經(jīng)過預(yù)處理的血清中的上述9種脂溶性維生素，通過樣品 的響應(yīng)值的大小與標(biāo)準(zhǔn)品的比較計算上述9種脂溶性維生素的含量，具體色譜條件為： (1) 色譜柱型號：ΒΗ1 C18 1. 7 μ m*2. 1 μ m*50mm ; (2) 流動相： 流動相A :0. 1% v/v三氟乙酸水溶液； 流動相B:乙醇； 流動相C :0. 1% v/v三氟乙酸甲醇溶液； 流動相梯度見表1，流動相按照表1中的梯度保留時間均勻變化； 表1流動相梯度洗脫參數(shù)
表2波長切換參數(shù)
(3) 流速：初始流速0. 2mL/min，勻速提升至4. 51分鐘時升到0. 3mL/min，8. 51分鐘再 勻速下降，至8. 6分鐘時降至0. 2mL/min ; (4) 柱溫：30°C ; (5) 采用可調(diào)紫外可見光檢測器，進行多波長切換，具體波長切換條件見表2 ; (6) 進樣量：lyL。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法， 其特征在于，所述的血清為人或動物的血清。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法， 其特征在于，所述的經(jīng)過預(yù)處理的血清按照如下方法制備得到：取200 μ L血清加入1. 5mL 離心管中，向其中加入200 μ L冷凍乙醇渦漩2min，加入800 μ L冷凍的0. 4g/L 2,6-二叔 丁基-4-甲基苯酚的正己燒溶液，1500rpm潤漩lOmin，3000rpm離心20min，取出上清液，離 心后的沉淀部分加入800 μ L冷凍的0.4g/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液， 1500rpm渦漩lOmin，3000rpm離心20min，合并上清液，氮氣流上吹至近干，然后用100 μ L 冷凍乙醇復(fù)溶渦旋60s，過0. 2 μ m濾膜。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法， 其特征在于，所述的標(biāo)準(zhǔn)品按照如下步驟制備得到： (a) 標(biāo)準(zhǔn)品母液配制：分別稱取維生素 A 8. 8mg、δ -生育酚l〇mg、Y -生育酚l〇mg、 <1-生育酚9.1111^，分別加入11111^含有0.48/12,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的乙醇溶液，另 稱取α -胡蘿卜素 l〇mg、β -胡蘿卜素17. 12mg、蕃茄紅素10mg、輔酶Q105mg、葉黃素20mg 分別定容于2mL、10mL、lmL、lmL、10mL正己燒中，分別得到各自標(biāo)準(zhǔn)品母液； (b) 校正液配制：分別從維生素 A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚母液中移取 40 μ L、80 μ L、40 μ L、20 μ L標(biāo)準(zhǔn)品母液用乙醇定容至1000 μ L得到校正液Α，分別從α -胡 蘿卜素、β-胡蘿卜素、蕃爺紅素、輔酶Q10、葉黃素母液中移取40yL、200yL、20yL、 100 μ L、50 μ L標(biāo)準(zhǔn)品母液用正己烷定容至1000 μ L得到校正液B，分別取A、B各20 μ L用乙 醇定容至1000 μ L，得到9種維生素標(biāo)準(zhǔn)品混合母液C，分別取其中12. 5 μ L、25 μ L、50 μ L、 20(^1^、50(^1^用空白血清基質(zhì)溶液定容至100(^1^，得到5個濃度標(biāo)準(zhǔn)校正點51、52、53、 S4、S5,具體數(shù)值見表3 ; 表3 9種維生素對應(yīng)線性濃度范圍單位μ g/mL
(c) 標(biāo)準(zhǔn)品處理：將上述所得SI、S2、S3、S4、S5五個濃度標(biāo)準(zhǔn)校正點各取200 μ L轉(zhuǎn)移 至1. 5mL離心管中，向其中加入200 μ L乙醇，渦旋數(shù)秒，加入800 μ L冷凍0. 4g/L 2,6-二叔 丁基-4-甲基苯酚的正己燒溶液，1500rpm潤漩lOmin，3000rpm離心20min，待離心結(jié)束后， 取出上清液，離心后的沉淀部分加入800 μ L冷凍0. 4g/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正 己烷溶液，1500rpm渦漩lOmin，3000rpm離心20min，合并上清液，在氮氣流上吹至近干，然 后用100 μ L冷凍乙醇復(fù)溶渦旋60s，過0. 2 μ m濾膜。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方法， 其特征在于，步驟（b)中，所述的空白血清基質(zhì)溶液，是將4g牛血清蛋白用水定容至100mL 制得。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的超高效液相色譜技術(shù)測定血清中9種脂溶性維生素的方 法，其特征在于，所述的冷凍乙醇為在一 20°C條件下放置30min以上。
【文檔編號】G01N30/02GK104155386SQ201410440157
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】徐鳳仙, 于嘉屏 申請人:上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司