專利名稱：用于診斷或預(yù)測(cè)早期心臟機(jī)能障礙的設(shè)備和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于基于尿樣中的腦利尿鈉肽(BNP)的量來診斷對(duì)象 的輕微或中度心臟衰竭的方法和設(shè)備。此外，本發(fā)明包括用于基于尿樣 中的BNP的量來預(yù)測(cè)對(duì)象是否處于發(fā)展了伴隨心臟衰竭的心血管事件 的風(fēng)險(xiǎn)的方法和設(shè)備。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的目的是提供個(gè)人化或個(gè)體化的治療法。這些治療法是考 慮到患者的個(gè)體需要或風(fēng)險(xiǎn)的治療法。特別重要的風(fēng)險(xiǎn)是心血管并發(fā)癥 的出現(xiàn)，特別是未認(rèn)識(shí)到的心血管并發(fā)癥。心血管并發(fā)癥，特別是心臟 疾病是西半球發(fā)病率和死亡率的主導(dǎo)原因。心血管并發(fā)癥可以在長(zhǎng)時(shí)間 周期內(nèi)保持無癥狀。因此，對(duì)心血管并發(fā)癥的存在的可靠診斷比一般所 認(rèn)為的更困難和易錯(cuò)(Svendstmp Nielsen, L.,等(2003). N-terminal pro-brain natriuretic peptide for discriminating between cardiac and non-cardiac dyspnoea. The European Jounal of Heart Failure )。
利尿鈉肽已知是對(duì)于心血管疾病進(jìn)展的分子標(biāo)志。WO 02/083913 披露了腦利尿鈉肽(BNP)及其在血液中的變體可以用于預(yù)測(cè)已經(jīng)患有 心臟衰竭的患者的近期死亡率和發(fā)病率。在試圖于診斷心血管疾病中， 特別是對(duì)于心肌缺血，WO 02/089657也^皮露了多種血液生物標(biāo)志，該
也被提到是合適的生物標(biāo)志。此外，Hutfless等已示出，在心臟手術(shù)后 基于患者血液內(nèi)的BNP濃度可以預(yù)測(cè)在所述的手術(shù)后30天的時(shí)間期間 內(nèi)的發(fā)病率或死亡率(Hutfless 2004, Utility of B-type natriuretic peptide in predicting postoperative complications and outcomes in patients undergoing heart surgery. J Am Coll Cardiol 43: 1873-9 )。然而，根據(jù)作 者，研結(jié)果并不很顯著。然而，因?yàn)槿Q于這些肽在包括來自適當(dāng)?shù)?腎功能的尿的多種體液內(nèi)的水平，利尿鈉肽作為診斷標(biāo)志的使用在先前 是有危險(xiǎn)的(McCullough 2003. B畫Type Nanuretic Peptides: A Diagnostic Breakthrough for Clinicians. Reviews in Cardiovascular Medicine 4: 72-80.)。
現(xiàn)有技術(shù)方法的缺點(diǎn)是它們通常要求由專業(yè)心臟病專家來評(píng)價(jià)結(jié) 果或它們只能在例如已經(jīng)發(fā)生的手術(shù)的心臟事件后應(yīng)用。此外，所披露 的用于診斷目的的裝置和方法的可靠性，特別是對(duì)于不很嚴(yán)重的心臟衰 竭情況，因前述的不確定性是可疑的。
因此，存在對(duì)用于診斷尚未被識(shí)別為患有心臟疾病或尚未接受心臟
手術(shù)的患者的心臟衰竭的裝置和方法的明確的長(zhǎng)期存在的需求。此外，
裝置和方法應(yīng)允許可靠和迅速的診斷。特別地，裝置和方法應(yīng)允許不僅
由專業(yè)的臨床醫(yī)生或心臟病專家而且由一般從業(yè)者來it斷心臟衰竭。
因此，作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的技術(shù)問題應(yīng)視作提供用于應(yīng)對(duì)前述需求
的裝置和方法。裝置和方法同時(shí)避免了以上所參考的現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。 技術(shù)問題由其特征在于權(quán)利要求書和下文的實(shí)施例解決。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及用于診斷對(duì)象內(nèi)的心臟衰竭的方法，方法包括
a) 確定所述的對(duì)象的尿樣中的腦利尿鈉肽(BNP)的量；和
b) 基于在步驟a)中確定的BNP的量診斷對(duì)象是否患有心臟衰竭。 用于診斷的方法優(yōu)選地是在體外進(jìn)行的方法。以上所參考的步驟
b )優(yōu)選地包括將步驟a)中確定的量與下文中將詳細(xì)描述的參考標(biāo)準(zhǔn)或 數(shù)個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)關(guān)聯(lián)?？梢赃M(jìn)一步包括將關(guān)聯(lián)的診斷原始數(shù)據(jù)處理為診斷 結(jié)果，該診斷結(jié)果可以不需要由臨床醫(yī)生進(jìn)一步解釋。優(yōu)選地，步驟a) 和/或步驟b)可以全部或部分地以自動(dòng)化來輔助，例如通過用于關(guān)聯(lián)和 /或處理數(shù)據(jù)的合適的計(jì)算機(jī)程序，或用于在步驟a)中確定量的自動(dòng)機(jī) 械和感測(cè)4義器。
術(shù)語"診斷"在此指評(píng)估對(duì)象患有或?qū)⒒加行呐K衰竭的可能性。如 本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將理解，這樣的評(píng)估通常不意圖于對(duì)于被診斷的對(duì) 象100 %正確。然而，此術(shù)語要求在統(tǒng)計(jì)上對(duì)象的顯著部分可以^皮i貪斷 為患有心臟衰竭或具有將來將患有心臟衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。部分是否在統(tǒng)計(jì)上 顯著可以被確定而不進(jìn)一 步由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員使用多種已知的統(tǒng) 計(jì)評(píng)估工具來進(jìn)行，例如確定置信區(qū)間、p值確定、學(xué)生(Student's) t 檢驗(yàn)、Mann-Whitney檢驗(yàn)等。細(xì)節(jié)參考Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。優(yōu)選的置信區(qū)間是至少90 %、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。 p值優(yōu)選地為O.l、 0.05、 0.01、 0.005、或0.0001。
根據(jù)本發(fā)明的診斷包括監(jiān)測(cè)、確認(rèn)、分子類和預(yù)測(cè)相關(guān)疾病、癥狀 或其風(fēng)險(xiǎn)。監(jiān)測(cè)涉及保持跟蹤已診斷的疾病或并發(fā)癥，例如分析疾病的 進(jìn)展或特定治療對(duì)疾病或并發(fā)癥的進(jìn)展的影響。確認(rèn)涉及強(qiáng)化或證實(shí)已 使用其他指示器或標(biāo)志進(jìn)行的診斷。分子類涉及根據(jù)所診斷的疾病的不 同的子類進(jìn)一 步限定診斷，例如根據(jù)疾病的輕微形式和嚴(yán)重形式來限 定，如以下將詳細(xì)描述。預(yù)測(cè)涉及在其他癥狀或標(biāo)志變得明顯或變得顯 著地變化前預(yù)測(cè)疾病或并發(fā)癥。如在此所使用，預(yù)測(cè)優(yōu)選地包括診斷心 臟衰竭的流行程度。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"尿"包括全尿或尿的部分。部分是包含了肽或 多肽的尿部分。尿樣可以本領(lǐng)域中任何已知的方式獲取。在應(yīng)用本發(fā)明 的方法(即處理的尿樣)前，樣本可以受到多種已知的預(yù)處理。
術(shù)語"心臟衰竭"在此用于指示受損的心臟功能。根據(jù)NYHA(紐 約心臟協(xié)會(huì)(New York Heart Association)),心臟衰竭凈皮分類為功能 性分類系統(tǒng)。類型I的患者無明顯的心血管疾病癥狀。體力活動(dòng)不受限， 且一般性體力活動(dòng)不導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)钠?、心悸或呼吸困難(呼吸短促)。 然而超聲心動(dòng)描記術(shù)可能檢測(cè)到患者具有不正常性。類型II的患者具有 輕微的體力活動(dòng)限制。它們?cè)陟o息時(shí)是舒適的，但一般性體力活動(dòng)導(dǎo)致 疲勞、心悸或呼吸困難。類型III的患者顯示出明顯的體力活動(dòng)限制。 它們?cè)陟o息時(shí)是舒適的，但低于一般性的體力活動(dòng)導(dǎo)致疲勞、心悸或呼 吸困難。類型IV的患者不能無不適地承受任何體力活動(dòng)。它們?cè)陟o息 時(shí)顯示了心功能不全的癥狀。如果進(jìn)行任何體力活動(dòng)，則不適性增加。 因此，患者可以被分為顯示了無臨床癥狀的個(gè)體和有癥狀(例如呼吸困 難)的個(gè)體。優(yōu)選地，心臟衰竭是慢性心臟衰竭。而且，優(yōu)選地，如在 此所參考的心臟衰竭涉及輕微或中度心臟衰竭。在此提到的輕微或中度 心臟衰竭所伴隨的癥狀不很嚴(yán)重，即它們是不明顯的癥狀(例如對(duì)于類 型I)或根據(jù)NYHA類型II或類型III的癥狀。優(yōu)選地，術(shù)語涉及由多 種潛在的疾病或病癥導(dǎo)致的充血性心臟衰竭。如前文所描述，輕微或中 度心臟衰竭涉及根據(jù)NYHA類型I、類型II或類型III的心臟衰竭。
通過調(diào)查和監(jiān)測(cè)癥狀，患有心臟衰竭的患者，特別是患有輕微或中 度心臟衰竭的患者由于癥狀弱或不明確可能難于分類。根據(jù)本發(fā)明已發(fā) 現(xiàn)，至少0.8 pg/ml的尿BNP的量指示了心臟衰竭。更優(yōu)選地，屬于NYHA 類型I的對(duì)象將具有在Advia Carteener化驗(yàn)(Bayer)中等于0.8 pg/ml
至2.4 pg/ml的BNP的量，最優(yōu)選地為具有1.7 pg/ml的BNP的量。也 更優(yōu)選的是，屬于NYHA類型II的對(duì)象將具有在Advia Carteener化驗(yàn) 中等于2.5 pg/ml至3.9 pg/ml的BNP的量，最優(yōu)選地為具有2.8 pg/ml 的BNP的量。優(yōu)選地，屬于NYHA類型III的對(duì)象將具有在Advia Carteener化驗(yàn)中等于4.0 pg/ml至12.0 pg/ml的BNP的量，最優(yōu)選地為 具有5.4 pg/ml的BNP的量。更高的量(即大于12.0 pg/ml )指示了 NYHA 類型IV。在本文中以上所使用的縮寫"ml"指以毫升為單位的尿樣體積。 前述范圍和值的極限可以在統(tǒng)計(jì)上變化(見如下的例子和圖)。此外， 范圍可以進(jìn)一步因用于檢測(cè)的特定化驗(yàn)而改變。然而，需理解的是，本 發(fā)明的方法或設(shè)備將允許以基本上與在附帶的例子(Advia Carteneenr 化驗(yàn))中所描述的化驗(yàn)中相同的靈敏度和/或特異性確定尿BNP值。
確定BNP的量可以由用于確定樣本內(nèi)的多肽或肽的量的所有已知 裝置實(shí)現(xiàn)。所述的裝置包括可以利用在多種夾心、竟?fàn)幓蚱渌?yàn)?zāi)Ｊ?中的標(biāo)記分子的免疫測(cè)定設(shè)備和方法。所述的化驗(yàn)將形成指示了 BNP 的存在或不存在的信號(hào)。此外，信號(hào)強(qiáng)度可以優(yōu)選地直接或間接地關(guān)聯(lián) 于(例如反比例于)樣本內(nèi)存在的多肽的量。此外，設(shè)備和方法包括生 物傳感器、聯(lián)接到免疫測(cè)定的光學(xué)設(shè)備、生物芯片、例如質(zhì)譜儀、NMR 分析儀或色譜設(shè)備的分析設(shè)備。進(jìn)一步地，方法包括基于微板ELISA的 方法、完全自動(dòng)的或自動(dòng)機(jī)的免疫測(cè)定(例如獲得的Elecsys 分析儀)、 CBA (酶的鈷結(jié)合化驗(yàn)，例如獲得的Roche-HitachiTM分析儀)和乳膠凝 集化驗(yàn)(例如獲得的Roche-Hitachi 分析儀)。根據(jù)本發(fā)明的對(duì)量的確 定涉及對(duì)量或濃度的測(cè)量，優(yōu)選地半定量的或定量的測(cè)量。測(cè)量可以直 接或間接完成。間接測(cè)量包括測(cè)量細(xì)胞響應(yīng)、結(jié)合配體、標(biāo)記或酶反應(yīng) 產(chǎn)物。在本發(fā)明的內(nèi)容中，量也涉及濃度。顯見，從關(guān)心的物質(zhì)在已知 大小的樣本內(nèi)的總量可以計(jì)算物質(zhì)的濃度，或反之。BNP在樣本中的量 或濃度的確定可以通過多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，用于測(cè)量BNP的量的方法包括如下步驟(a) 使能對(duì)多肽具有細(xì)胞響應(yīng)的細(xì)胞與多肽接觸足夠的時(shí)間期間，(b )測(cè) 量細(xì)胞響應(yīng)。為測(cè)量細(xì)胞響應(yīng)，尿樣或處理的尿樣優(yōu)選地被添加到細(xì)胞 培養(yǎng)內(nèi)且測(cè)量?jī)?nèi)部或外部細(xì)胞響應(yīng)。細(xì)胞響應(yīng)可以包括報(bào)告子基因表達(dá) 或例如肽、多肽或小分子的物質(zhì)的分泌。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，用于測(cè)量BNP的量的方法包括如下步
驟(a)使多肽與合適的底物接觸足夠的時(shí)間期間，(b)測(cè)量產(chǎn)物的量。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，用于測(cè)量BNP的量的方法包括如下步 驟(a)使多肽與特定的結(jié)合配體接觸，(b)(選擇地)去除非結(jié)合 的配體，(c)測(cè)量結(jié)合的配體的量。
其他用于測(cè)量的優(yōu)選的方法包括測(cè)量特定地與關(guān)心的肽或多肽結(jié) 合的配體或試劑的量。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合。 根據(jù)本發(fā)明的配體可以是結(jié)合到在此所述的BNP的任何肽、多肽、核 酸或小分子。優(yōu)選地，配體或試劑特定地與BNP結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，"特 定地結(jié)合"意味著配體或試劑大體上不應(yīng)結(jié)合到待分析的樣本內(nèi)存在的 其他肽、多肽或物質(zhì)(與它們"交叉反應(yīng)")。優(yōu)選地，特定地結(jié)合的 蛋白質(zhì)應(yīng)以比任何其他相關(guān)的肽或多肽至少高3倍的、更優(yōu)選地至少高 10倍的且甚至更優(yōu)選地至少高50倍的親和力而結(jié)合。非特定結(jié)合如果 仍能分辨且不含糊的被測(cè)量，例如根據(jù)其尺寸在Western Blot上的尺寸 或通過其在樣本內(nèi)相對(duì)更高的充足度，則是容許的。配體結(jié)合可以通過 在本領(lǐng)域中任何已知的方法測(cè)量。優(yōu)選地，方法是半定量的或定量的。 合適的方法在如下描述。首先，配體的結(jié)合可以直接測(cè)量，例如通過 NMR或表面等離子體共振。第二，如果配體也用作關(guān)心的肽或多肽的 酶活性的底物，則可以測(cè)量酶反應(yīng)產(chǎn)物(例如可以例如在Western Blot 上通過測(cè)量分裂的底物的量來測(cè)量蛋白酶的量)。為測(cè)量酶反應(yīng)產(chǎn)物， 優(yōu)選地底物的量是飽和的。底物也可以在反應(yīng)前以可檢測(cè)標(biāo)記來標(biāo)記。 優(yōu)選地，樣本與底物接觸足夠的時(shí)間期間。足夠的時(shí)間期間指對(duì)于可檢 測(cè)的，優(yōu)選地可測(cè)量的將產(chǎn)生的產(chǎn)物的量所需的時(shí)間。作為測(cè)量產(chǎn)物的 量的替代，可以測(cè)量給定(例如可檢測(cè))的產(chǎn)物量的出現(xiàn)所需的時(shí)間。 第三，配體可以共價(jià)或非共價(jià)地聯(lián)結(jié)到允許;險(xiǎn)測(cè)和測(cè)量配體的標(biāo)記。標(biāo) 記可以通過直接或間接方法完成。直接標(biāo)記涉及將標(biāo)記直接(共價(jià)或非 共價(jià))聯(lián)結(jié)到配體。間接標(biāo)記涉及將第二配體結(jié)合(共價(jià)或非共價(jià))到 第一配體。第二配體應(yīng)特定地結(jié)合到第一配體。所述的第二配體可以與 合適的標(biāo)記聯(lián)結(jié)和/或可以是結(jié)合到第二配體的第三配體的目標(biāo)(受 體)。第二、第三或更高次配體的使用經(jīng)常用于增加信號(hào)。合適的第二 和更高次配體可以包括抗體、第二抗體和已熟知的抗生蛋白鏈菌素_生 物素系統(tǒng)(Vector Laboratories Inc.)。酉己體或底物也可以以本領(lǐng)域已知
的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽來"加標(biāo)簽"。這樣的標(biāo)簽則可以是更高次配體的目標(biāo)。合適的標(biāo)簽包括生物素、異羥基洋地黃毒甙元(Digoxygenin)、 His-Tag、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶、FLAG、 GFP、 myc標(biāo)簽、曱型流感病毒血 凝素(HA)、麥芽糖結(jié)合蛋白等。在肽或多肽的情況中，標(biāo)簽優(yōu)選地 處于N端和/或C端。合適的標(biāo)記是由適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法可檢測(cè)的任何標(biāo) 記。典型的標(biāo)記包括金微粒、乳膠珠、9,10-二氫吖啶(acridan)酯、魯 米諾、釕、酶活性標(biāo)記、放射性標(biāo)記、》茲性標(biāo)記("例如》茲珠"，包括 順》茲和超順》茲標(biāo)記)、以及熒光標(biāo)記。酶活性標(biāo)記例如包括辣才艮過氧化 物酶、石成性磷酸酶、|3-半乳糖苷酶、熒光素酶及其衍生物。用于4全測(cè)的 適合底物包括對(duì)二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 、 3，3'-5,5'-四曱基聯(lián)苯胺、NBT-BCIP (4-硝基藍(lán)四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-口引哚-磷酸酯，從Roche Diagnostics可獲得制備好的儲(chǔ)備溶液)、CDP-STAR ( Amersham Biosciences) 、 ECF ( Amersham Biosciences )。合適的酵-底物的纟且合 可以導(dǎo)致彩色的反應(yīng)產(chǎn)物、熒光或化學(xué)發(fā)光，它們可以根據(jù)在本領(lǐng)域中 已知的方法測(cè)量(例如使用光敏膠片或合適的照相系統(tǒng))。至于測(cè)量酶 反應(yīng)，類似地應(yīng)用以上給出的標(biāo)準(zhǔn)。典型的焚光標(biāo)記包括突光蛋白(例 如GFP及其衍生物)Cy3、 Cy5、 Texas Red、熒光素和Alexa染料(例 如Alexa 568 )。進(jìn)一步的熒光標(biāo)記例如可從Molcular Probes ( Oregon ) 獲得。也考慮了使用量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記。典型的放射性標(biāo)記包括35S、 125I、 32P、 33P等。放射性標(biāo)記可以由任何已知和合適的方法例如光敏 膠片或磷光體成像儀來檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的合適的測(cè)量方法也包括沉淀
(特別是免疫沉淀)、電化學(xué)發(fā)光(電致化學(xué)發(fā)光)、RIA (放射性免 疫測(cè)定)、ELISA (酶鏈接免疫吸收劑化驗(yàn))、夾心酶免疫測(cè)試、電化 學(xué)發(fā)光夾心免疫測(cè)定(ECLIA)、解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖邷y(cè)定
(DELFIA)、接近閃爍化驗(yàn)(SPA)、比濁法、混濁度法，膠乳增強(qiáng)比 濁法或混濁度法或固相免疫測(cè)試。在本領(lǐng)域中已知的進(jìn)一步的方法(例 如凝膠電泳、2D凝膠電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、 Western Blotting和質(zhì)譜法)可以單獨(dú)使用或與標(biāo)記或其他以上所述的斗全 測(cè)方法結(jié)合使用。優(yōu)選的配體包括抗體、核酸、肽或多肽和核酸適體， 例如核酸或肽核酸適體。對(duì)于這樣的配體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。 例如合適的抗體或核酸適體的識(shí)別和產(chǎn)生也由商業(yè)供貨商提供。本領(lǐng)域 一般技術(shù)人員熟悉形成這樣的配體的帶有更高的親和力或特異性的衍
生物的方法。例如，隨機(jī)突變可以引入到核酸、肽或多肽內(nèi)。這些衍生 物然后可以根據(jù)在本領(lǐng)域中已知的篩選法，例如噬菌體顯示來測(cè)試結(jié) 合。在此參考的抗體包括多克隆和單克隆抗體，以及它們的段，例如可
結(jié)合抗原或半抗原的Fv、 Fab和F(ab)2段。本發(fā)明也包括人類化的雜 交抗體，其中展示了希望的抗原特異性的非人類供體抗體的氨基酸序列 與人類受體抗體序列組合。供體序列將通常包括至少供體的結(jié)合抗原的 氨基酸殘基，但也可以包括供體抗體的其他結(jié)構(gòu)和/或功能性上相關(guān)的氨 基酸殘基。這樣的雜交物可以通過本領(lǐng)域中數(shù)個(gè)已熟知的方法準(zhǔn)備。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，優(yōu)選地從包括核酸、肽、多肽、抗體和 核酸適體的組中選擇的配體存在于固態(tài)支承物上，優(yōu)選地存在于陣列 上。這樣的包括用于BNP的配體或結(jié)合劑的固態(tài)支承物或陣列在本領(lǐng) 域中已熟知，且尤其包括商用柱材料、聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁性珠、 膠體金屬微粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝化纖維素條、膜、片、 duracyte、反應(yīng)盤的井和壁、塑料管等。配體或試劑可以結(jié)合到許多不 同的載體。已知的載體的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、 聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖酐、尼龍、直鏈淀粉、天然和改性纖維素、 聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。載體的屬性可以是可溶的或不可溶的， 以用于本發(fā)明的目的。用于固定/穩(wěn)定所述的配體或試劑的合適的方法已 熟知且包括但不限制于離子、厭水、共價(jià)相互作用等。根據(jù)本發(fā)明也考 慮了使用"懸浮陣列"作為陣列(Nolan JP, Sklar LA. (2002). Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm. Trends Biotechnol. 20(1):9-12)。在這樣的懸浮陣列中，例如微珠或微球的載體存在于懸浮
;生這樣的陣列二方法一般地已知(U、S ,744,305 ) : 5例如基)固相化 學(xué)和光不穩(wěn)定保護(hù)組。這樣的陣列也可以與物質(zhì)或物質(zhì)庫(library)接 觸且測(cè)試相互作用，例如結(jié)合或確認(rèn)的改變。因此，如以上所限定的包 括肽或多肽的陣列可以用于識(shí)別特定地結(jié)合到所述的肽或多肽的配體。
術(shù)語"BNP"包括成熟BNP及其具有相同的診斷和預(yù)兆值的變體。 變體優(yōu)選地是前體多肽、所述的多肽的段或降解產(chǎn)物。此外，術(shù)語"變 體，，也包括由人類或其他動(dòng)物種類中的同源基因所編碼的等位變體。這 樣的同源基因優(yōu)選地是編碼了前述的多肽的平行同源基因或垂直同源
基因。根據(jù)本發(fā)明待應(yīng)用的優(yōu)選的BNP及其變體在下文中詳細(xì)描述。
術(shù)語"肽"和"多肽，，在此說明書中可以可互換地使用。
基于BNP的量診斷對(duì)象是否患有輕微或中度心臟衰竭包括將確定 的BNP的量與參考量進(jìn)行相關(guān)聯(lián)。參考量將同時(shí)確定或分開確定。在 后者情況中，參考將以合適的方式存儲(chǔ)或記錄且為相關(guān)聯(lián)而提供。參考 量將指示心臟衰竭。在一個(gè)實(shí)施例中，參考量將是從已知未患有心臟衰 竭的，即健康的對(duì)象或?qū)ο蟮慕M確定的量(即對(duì)于所述的組的平均值或 均值)。所述的健康的對(duì)象(多個(gè)對(duì)象)的特征在于他們?cè)诔暥嗥绽?研究中顯示為正常，顯示了正常的心電圖(ECG)且顯示了標(biāo)準(zhǔn)生物化 學(xué)和血液病學(xué)參數(shù)的正常范圍。此外，健康對(duì)象應(yīng)不顯示任何根據(jù) N YH A分類的癥狀。診斷將通過將已確定的量與所述的參考量進(jìn)行相關(guān) 聯(lián)來進(jìn)行，由此在與參考量的對(duì)比中任何量的增加指示了心臟衰竭。
在另一個(gè)實(shí)施例中，將已確定的量與來自已知患有心臟衰竭的參考 對(duì)象或?qū)ο蟮慕M的參考量進(jìn)行對(duì)比。診斷將通過將已確定的量與所述的
參考量進(jìn)行相關(guān)聯(lián)來進(jìn)行，由此在與參考量的對(duì)比中類似的量或增加的 量指示了心臟衰竭。
在再進(jìn)一步的實(shí)施例中將提供參考值面板，每個(gè)與和心臟衰竭有關(guān) 的癥狀的不同強(qiáng)度相關(guān)聯(lián)，即個(gè)體參考值將對(duì)于根據(jù)NYHA類型I、類 型II、類型III和類型IV的心臟衰竭的每個(gè)被提供。優(yōu)選的參考值已在 以上所述。根據(jù)NYHA的標(biāo)準(zhǔn)的癥狀已在說明書其他部分中詳細(xì)論述。 根據(jù)此實(shí)施例，不僅可以診斷對(duì)象是否患有心臟衰竭，而是也可以診斷 給定的對(duì)象所發(fā)展的癥狀的強(qiáng)度。因此，患有心臟衰竭的對(duì)象也可以可 靠地被識(shí)別且分類到各NYHA類別內(nèi)。
由于本發(fā)明，通過使用容易操作的測(cè)試設(shè)備且不依賴高度專業(yè)的臨 床醫(yī)生的評(píng)估，可以可靠地診斷心臟衰竭，且特別是輕微和中度心臟衰 竭，或診斷因心臟衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。因此，取決于方法，可以不再要求臨床 醫(yī)生來進(jìn)行診斷。對(duì)于一般從業(yè)者，不再要求昂貴的診斷工具來進(jìn)行心 臟診斷。有利地，使用尿作為樣本避免了在對(duì)象上進(jìn)行任何侵入性步 驟。令人驚奇的是，作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的研究中發(fā)現(xiàn)，尿中的BNP的 量至少與血液中的BNP的量對(duì)于診斷一樣地有價(jià)值和可靠。通常，人 們預(yù)期在尿中僅存在低水平的BNP,因?yàn)樗龅亩嚯牡闹饕宄谀I臟 內(nèi)通過腎小球過濾而發(fā)生。因此，人們未預(yù)期到(i)實(shí)際上在尿中存在
足夠的BNP的量，和(ii)因?yàn)樵谀蛑械腂NP的量也依賴于適當(dāng)?shù)哪I小 球過濾，所以可以基于它來進(jìn)行可靠的診斷或預(yù)測(cè)。此外，在作為本發(fā) 明的基礎(chǔ)的研究中發(fā)現(xiàn)，在尿樣中存在的BNP的量不僅指示了心臟衰 竭的發(fā)展，而且允許了根據(jù)NYHA分類系統(tǒng)對(duì)所述的心臟衰竭的可靠分 類。這進(jìn)一步允許了對(duì)疾病進(jìn)展的有效監(jiān)測(cè)。在此描述的方法可以在涉 及藥物效力的研究中應(yīng)用。特別地，可以可靠地確定藥物或候選藥物是 否改善了心臟衰竭、伴隨心臟衰竭的疾病或在此涉及的癥狀。因此，本 發(fā)明的方法也將便于臨床試驗(yàn)或研究。
以上進(jìn)行的術(shù)語的限定和解釋在作必要的修正后適用于如下描述 的實(shí)施例。術(shù)語的限定和解釋適用于下文中給出的所有限定和解釋。
此外，本發(fā)明包括用于診斷對(duì)象的心臟衰竭的設(shè)備，設(shè)備包括
(a) 用于確定所述的對(duì)象的尿樣中的BNP的量的裝置；和
(b) 用于基于BNP的量診斷對(duì)象是否患有心臟衰竭的裝置。 如在此使用的術(shù)語"設(shè)備，，涉及包括至少前述的可操作地相互鏈接
的裝置的裝置的系統(tǒng)，以允許診斷心臟衰竭。用于確定BNP的量和用 于診斷心臟衰竭的優(yōu)選裝置在上文中結(jié)合本發(fā)明的方法披露。如何以操 作方式鏈接裝置將取決于包括到設(shè)備內(nèi)的裝置的類型。例如，在應(yīng)用了 用于自動(dòng)地確定BNP的量的裝置時(shí)，由所述的自動(dòng)操作的裝置獲得的 數(shù)據(jù)可以例如由計(jì)算機(jī)程序處理以診斷心臟衰竭。優(yōu)選地，裝置在這樣 的情況中包括單一的設(shè)備。所述的設(shè)備可以因此包括用于測(cè)量所應(yīng)用的 樣本內(nèi)的BNP的量的分析單元和用于處理得到的數(shù)據(jù)以進(jìn)行診斷的計(jì) 算機(jī)單元。替代地，在使用例如測(cè)試條的裝置來確定BNP的量時(shí)，用 于診斷的裝置可以包括對(duì)照條或表，從而將所確定的量分類到已知的心 臟衰竭伴隨的量或已知的指示了健康對(duì)象的量，如以上所述。測(cè)試條優(yōu) 選地聯(lián)結(jié)到特定地結(jié)合BNP的配體或試劑。條或設(shè)備優(yōu)選地包括用于 檢測(cè)源自結(jié)合到所述的配體或試劑的BNP前體原(preproBNP )的肽的 裝置。用于檢測(cè)的優(yōu)選的裝置結(jié)合涉及以上的本發(fā)明的方法的實(shí)施例披 露。在這樣的情況中，裝置可操作地鏈接，使得系統(tǒng)的使用者將量的確 定結(jié)果和其診斷值根據(jù)在手冊(cè)中給出的指令和解釋匯總。在這樣的實(shí)施 例中，裝置可以表現(xiàn)為分開的設(shè)備，且優(yōu)選地作為套件包裝到一起。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到如何將裝置鏈接而無需進(jìn)一步工作。優(yōu)選的設(shè)備 是可不以專業(yè)臨床醫(yī)生的特定知識(shí)而應(yīng)用的設(shè)備，例如僅要求裝載樣本
的測(cè)試條或電子設(shè)備。結(jié)果可以作為需要臨床醫(yī)生解釋的診斷原始數(shù)據(jù) 輸出給定。然而優(yōu)選的是，設(shè)備的輸出是處理過的診斷原始數(shù)據(jù)，它不 要求臨床醫(yī)生的解釋，即應(yīng)從輸出必然地清楚對(duì)象是否患有心臟衰竭。
(例如生物傳感器、陣列、聯(lián)結(jié)到特定地識(shí)別BNP的配體或試劑的固 態(tài)支承物、等離子體表面共振設(shè)備、NMR分光計(jì)、質(zhì)譜儀等)，或評(píng) 估單元/設(shè)備。
根據(jù)前述描述，在本發(fā)明的方法或設(shè)備的優(yōu)選實(shí)施例中，所述的基 于BNP的量的診斷包括將對(duì)象的尿樣中的BNP的量與已知未患有心臟 衰竭的對(duì)象或已知患有心臟衰竭的對(duì)象的尿樣中的BNP的量進(jìn)行對(duì)比。
本發(fā)明也涉及用于預(yù)測(cè)對(duì)象是否處于在心臟衰竭后發(fā)展心血管事 件的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括
a) 確定所述的對(duì)象的尿樣中的BNP的量；和
b) 基于在步驟a)中確定的BNP的量預(yù)測(cè)對(duì)象是否處于發(fā)展伴隨 心臟衰竭的心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。
術(shù)語"心血管事件，，涉及心血管死亡和任何心血管事件-心臟衰 竭、急性冠脈綜合癥、腦血管事故/短暫性缺血性發(fā)作、周圍血管事件、 心律不齊或暈厥的入院。此外，任何要求增加藥物治療的代謝失調(diào)的心 臟衰竭的新的門診事件也可以總結(jié)為在此所指出的心血管事件中。心血 管事件的癥狀和診斷特征對(duì)于臨床醫(yī)生是熟知的(例如，見Troughton 2000. Treatment of heart failure guided by plasma aminoterminal brain natriuretic peptide (N-BNP) concentrations. The Lancet, Vol. 355.)。 在例 如Pschyrembel或Stedman的標(biāo)準(zhǔn)教科書中也描述了細(xì)節(jié)。癥狀和特征 可以被確定且可以由臨床醫(yī)生通過考慮到例如對(duì)象的年齡、體重、身 高、和另外的疾病或病癥、治療和/或臨床病史的進(jìn)一步的參數(shù)來評(píng)估。 優(yōu)選地，所述的心血管事件要求對(duì)象住院治療和/或伴隨有對(duì)象的死亡率 或增加的發(fā)病率。
根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選地至少2.5 pg/ml的尿BNP的量，且更優(yōu) 選地至少2.67 pg/ml的尿BNP的量指示了將來增加的發(fā)展心血管事件的 風(fēng)險(xiǎn)和/或死亡率(心臟死亡)。應(yīng)理解的是，前述的值可以在統(tǒng)計(jì)學(xué)邊 界內(nèi)變化。
因此，本發(fā)明的方法可以用于對(duì)于患者的風(fēng)險(xiǎn)分層。因此，治療或 其他必需的醫(yī)療處理或裝置可以應(yīng)用于對(duì)象。此外，將來的治療或醫(yī)療 裝置可以考慮到發(fā)展心臟衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。
進(jìn)一步地，本發(fā)明包括了用于預(yù)測(cè)對(duì)象在心臟衰竭后是否處于發(fā)展
心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)的設(shè)備，設(shè)備包括
a) 用于確定所述的對(duì)象的尿樣中的BNP的量的裝置；和
b) 用于基于BNP的量來預(yù)測(cè)對(duì)象是否處于發(fā)展心臟衰竭伴隨的心 血管事件的風(fēng)險(xiǎn)的裝置。
遵循前述描述，在本發(fā)明的方法或設(shè)備的優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的 基于BNP的量的預(yù)測(cè)包括將對(duì)象的尿樣中的BNP的量與已知未發(fā)展心 臟衰竭的對(duì)象或已知發(fā)展心臟衰竭的對(duì)象的尿樣中的BNP的量進(jìn)行對(duì) 比。
在本發(fā)明的方法或設(shè)備的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施例中，所述的發(fā)展心臟衰 竭伴隨的心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)涉及至少12個(gè)月的預(yù)兆期。
在作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的研究中發(fā)現(xiàn)，基于BNP的量的心血管事件 的預(yù)測(cè)在12個(gè)月的預(yù)兆期內(nèi)是最可靠的和顯著的。也由本發(fā)明所構(gòu)思 的進(jìn)一步的預(yù)兆期至少為一年。
在本發(fā)明的方法或設(shè)備的另 一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的心臟衰竭可 以分類到紐約心臟協(xié)會(huì)(NYHA)類型I、類型II、類型III或類型IV內(nèi)。 如上所述，將輕微或中度心臟衰竭分類到NYHA類型內(nèi)可以基于BNP 的量進(jìn)行，即對(duì)象將發(fā)展的癥狀的強(qiáng)度可以基于BNP的量確定。在作 為本發(fā)明的基礎(chǔ)的研究中令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，甚至特別地屬于NYHA類型 I和類型II的患者可以被可靠地分類到他們各自的類型中。因此，可能 由對(duì)象發(fā)展的癥狀可以更可靠地關(guān)于輕微或中度心臟衰竭被預(yù)測(cè)。此 外，基于對(duì)象可能發(fā)展的癥狀的獲知，對(duì)象的生活可能更方便。
在本發(fā)明的方法或設(shè)備的優(yōu)選實(shí)施例中，所述的對(duì)象是人類。
優(yōu)選地，涉及根據(jù)本發(fā)明的方法或設(shè)備的BNP從包括如下項(xiàng)的組 中選擇
a) 人類BNP
b) 至少60%與人類BNP相同的多肽；和
c) 具有與人類BNP相比的氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽，其 中所述的多肽具有BNP特性。
根據(jù)本發(fā)明被參考的人類BNP為對(duì)應(yīng)于成熟分子包括長(zhǎng)度優(yōu)選地 為32個(gè)氨基酸的多肽(BNP前體原的氨基酸77至108 )。在現(xiàn)有技術(shù) 中已詳細(xì)描述了多肽結(jié)構(gòu)，例如WO 02/089657, WO 02/083913, Bonow 1996, New Insights into the cardiac natriuretic peptides. Circulation 93: 1946-1950。前述的現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)在此通過關(guān)于其中披露的BNP及其 變體的特定序列而參考而合并。根據(jù)本發(fā)明參考的BNP進(jìn)一步包括具 有相當(dāng)?shù)纳锖?或免疫學(xué)特性的人類多肽的所述的特定序列的等位和 其他變體。特別地，因此設(shè)想的是在至少60%,更優(yōu)選地至少70%, 至少80%，至少90%，至少95%,至少98%或至少99%地相同于人類 BNP的氨基酸水平上的變體多肽。也包括具有與人類BNP相比氨基酸 缺失、取代和/或添加的變體多肽，其中所述的多肽具有人類BNP的生 物或免疫特性。這些變體多肽具有與在此參考的特定BNP相同的關(guān)于 心臟衰竭的預(yù)測(cè)和診斷值。BNP優(yōu)選地被化驗(yàn)，如在WO 02/089657或 在以下伴隨的例子中描述。
更優(yōu)選地，BNP是上文所指定的人類BNP。
最后，本發(fā)明也包括對(duì)以上在此所述的設(shè)備或以上所限定的尿樣中 的BNP的使用，以用于診斷所述的對(duì)象的心臟衰竭或用于預(yù)測(cè)所述的 對(duì)象是否處于發(fā)展心臟衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。
所有在此說明書中引用的參考通過參考它們的完整披露內(nèi)容和特 別地在此說明書中提及的4皮露內(nèi)容而在此合并。


各圖為
圖1示出了患有心臟衰竭的患者(HF患者)的尿中的BNP的量與 健康對(duì)照組的比較。p<0.001的p值指示了量的差異很明顯。
圖2示出了健康對(duì)照個(gè)體或患有根據(jù)紐約心臟協(xié)會(huì)類型I、類型II 或類型III (NYHA的I型、II型或III型)的心臟衰竭的個(gè)體的尿中的 BNP的量的差異。如從圖中顯見，個(gè)體的尿中的BNP的量可以用于區(qū) 分心臟衰竭的嚴(yán)重性。組之間的差異在統(tǒng)計(jì)上是顯著的。
圖3是用于診斷心臟衰竭的尿BNP的量的受試者工作特征曲線 (ROC)。
圖4是用于在樣本測(cè)量后12個(gè)月時(shí)間窗內(nèi)心臟死亡預(yù)兆的尿BNP 的量的受試者工作特征曲線(ROC曲線)。
圖5示出了在作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的研究中發(fā)現(xiàn)的死亡率ROC曲線 的最優(yōu)選截止值的表。
如下例子圖示了本發(fā)明且不意圖于限制本發(fā)明的范圍 例子尿BNP的診斷和預(yù)兆值
本研究的目的是分析在人尿中BNP的存在、將對(duì)照組和患病組中 發(fā)現(xiàn)的水平之間進(jìn)行比較和研究尿中BNP的診斷和預(yù)兆值。尿BNP水 平在15名健康志愿者和91名心臟衰竭(HF)患者中測(cè)量。在HF組中， 8名處于NYHA狀態(tài)I、 63名處于NYHA狀態(tài)II、且20名處于NYHA 狀態(tài)III。
HF患者的尿BNP水平統(tǒng)計(jì)上顯著高于對(duì)照者(3.28 ± 4.24對(duì)比0.54 ±0.94 pg/ml; pO.OOOl )。在惡化的功能類中，平均BNP尿水平根據(jù) 嚴(yán)重性的增加顯著地升高(圖3 )。用于檢測(cè)HF的BNP的ROC曲線在 曲線下產(chǎn)生了 0.81的區(qū)(AUC) ; pO.OOOl與對(duì)角線相比。從此ROC 曲線，在此特定的化驗(yàn)中可選的割點(diǎn)將是0.83 pg/ml，特異性為80%且 靈敏度為78%。此外，為研究尿BNP是否預(yù)兆了心臟死亡(12個(gè)月)， 進(jìn)行了 ROC曲線產(chǎn)生了 AUC = 0.76, p = 0.013與對(duì)角線相比。預(yù)兆心 臟死亡率的最優(yōu)割點(diǎn)在此特定的化驗(yàn)中計(jì)算為2.67 pg/ml。
因此，本研究示出了 BNP可以在人尿樣中確定，且尿中的BNP水 平可以用于診斷和預(yù)兆心臟衰竭患者以及用于這些患者的功能狀態(tài)的 定特征。
權(quán)利要求
1.用于診斷對(duì)象的心臟衰竭的方法，其包括a)確定所述的對(duì)象的尿樣中的腦利尿鈉肽(BNP)的量；和b)基于在步驟a)中確定的BNP的量診斷對(duì)象是否患有心臟衰竭。
2. 用于診斷對(duì)象的心臟衰竭的設(shè)備，其包括a) 用于確定所述的對(duì)象的尿樣中的BNP的量的裝置；和b) 用于基于BNP的量診斷對(duì)象是否患有心臟衰竭的裝置。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求2所述的設(shè)備，其 中基于BNP的量的所述的診斷包括將對(duì)象的尿樣中的BNP的量與已知 未患有心臟衰竭的對(duì)象或已知患有心臟衰竭的對(duì)象的尿樣中的BNP的 量進(jìn)行對(duì)比。
4. 用于預(yù)測(cè)對(duì)象是否處于發(fā)展心臟衰竭伴隨的心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括a) 確定所述的對(duì)象的尿樣中的BNP的量；和b) 基于在步驟a)中確定的BNP的量預(yù)測(cè)對(duì)象是否處于發(fā)展心臟 衰竭伴隨的心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。
5. 用于預(yù)測(cè)對(duì)象是否處于發(fā)展心臟衰竭伴隨的心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)的設(shè)備，其包括a) 用于確定所述的對(duì)象的尿樣中的BNP的量的裝置；和b) 用于基于BNP的量來預(yù)測(cè)對(duì)象是否處于發(fā)展心臟衰竭伴隨的 心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)的裝置。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求5所述的設(shè)備，其 中基于BNP的量的所述的預(yù)測(cè)包括將對(duì)象的尿樣中的BNP的量與已知 未發(fā)展心臟衰竭的對(duì)象或已知發(fā)展心臟衰竭的對(duì)象的尿樣中的BNP的 量進(jìn)行對(duì)比。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求5所述的設(shè)備或根 據(jù)權(quán)利要求6所述的方法或設(shè)備，其中所述的發(fā)展心臟衰竭伴隨的心血 管事件的風(fēng)險(xiǎn)涉及l(fā)2個(gè)月的預(yù)兆期。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的 設(shè)備或根據(jù)權(quán)利要求3、 6或7的任一項(xiàng)所述的方法或設(shè)備，其中所述 的衰竭可以分類到紐約心臟協(xié)會(huì)(NYHA)類型I、類型II、類型III或 類型IV。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法或設(shè)備，其中所述的心臟衰竭是慢 性心臟衰竭。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的 設(shè)備或根據(jù)權(quán)利要求3或6至9的任一項(xiàng)所述的方法或設(shè)備，其中所述 的心臟衰竭是輕微或中度心臟衰竭。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求2或5所迷的 設(shè)備或根據(jù)權(quán)利要求3或6至10的任一項(xiàng)所述的方法或設(shè)備，其中所述的對(duì)象是人類。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的 設(shè)備或根據(jù)權(quán)利要求3或6至11的任一項(xiàng)所述的方法或設(shè)備，其中所 述的BNP從包括如下項(xiàng)的組中選擇a ) 人類BNPb) 至少60%與人類BNP相同的多肽；和c) 具有與人類BNP相比的氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽， 其中所述的多肽具有BNP特性。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2、 4或7至12的任一項(xiàng)所述的設(shè)備或根據(jù)權(quán)利 要求12所限定的對(duì)象尿樣中的BNP的使用，以用于診斷所述的對(duì)象的 心臟衰竭。
14. 根據(jù)權(quán)利要求5至11的任一項(xiàng)所述的設(shè)備或根據(jù)權(quán)利要求12 所限定的對(duì)象尿樣中的BNP的使用，以用于預(yù)測(cè)所述的對(duì)象是否處于 發(fā)展心臟衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于基于尿樣中的腦利尿鈉肽(BNP)來診斷對(duì)象的心臟衰竭的方法和設(shè)備。此外，本發(fā)明包括用于基于尿樣中的BNP的量來預(yù)測(cè)對(duì)象是否處于發(fā)展了心臟衰竭伴隨的心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101171517SQ200680015868
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2006年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日
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