專利名稱：二氧化碳診斷/測定試劑盒及二氧化碳濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測 定二氧化碳濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景血液內(nèi)二氧化碳的含量對人體內(nèi)酸堿平衡的調(diào)節(jié)起著重要的作用。血液pH的恒定是維持生命活動必不可少的條件，血槳中的多種緩 沖系統(tǒng)中以碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)最為重要，直接影響血液的pH。血液內(nèi)二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸堿平衡紊亂。單純 代謝性酸或堿中毒時，血液碳酸氫根[HC03—]下降或升高，總二氧化碳 也隨之下降或升高。而單純呼吸性酸或堿中毒時，血液碳酸氫根升高 或下降?？偠趸己吞妓釟涓臏y定方法較可分為直接測定和間接推算 兩類。直接測定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Corway微 量擴散法、流動注射氣體擴散法等。間接推算是利用血氣分析儀測得 的PH與PC02,根據(jù)H-H方程的變換形式 HC(V (m mol /L) 二O. 03 XPC02(mm Hg) Xantilog(PH-p ka)或 HC(V(m mol/L)=0. 225XPC02(k Pa) Xantilog(PH—p Ka) 計算獲得。式中PH為37。 C時測得值，p ka在37。 C為6. 10。目前，以間接推算法應(yīng)用較普遍，由血液分析儀的微處理計算機并 與血氣分析結(jié)果一起報告，準(zhǔn)確性基本可以符合臨床要求。4直接測定法以滴定法應(yīng)用最廣泛，但由于受多種因素影響，測定誤 差較大。酶法測定適合自動化分析，結(jié)果可靠，應(yīng)當(dāng)是很有前途的測定方 法，但目前尚有待深入研究。檢索中國專利發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?6190276.0、申請日為1996. 02. 06 的發(fā)明專利申請公開了一種用來導(dǎo)出病人血液中氣體含量的非侵入性 的系統(tǒng)和方法。該系統(tǒng)相應(yīng)于體積測量呼氣中的二氧化碳濃度。然后 處理該數(shù)據(jù)導(dǎo)出動脈血中二氧化碳氣體水平。若數(shù)據(jù)為時間域，處理 可將時間域數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成體積域。該方法也經(jīng)迭代評估了多個變量的顯 著性，所得的關(guān)系可供快速和準(zhǔn)確地對健康人和患肺病病人進行血中 氣體含量的測定。近年來，申請?zhí)枮?2282386. 7、申請日為2002. 10. 29 的實用新型專利公開了一種醫(yī)用的血液碳酸氫根測定儀，主要由操作 面板、進樣檢測機構(gòu)、定滴加液機構(gòu)、攪拌機構(gòu)和以單片機為主控元 件的電器控制部分組成。其操作面板包括有手動按鍵、輸入鍵盤和顯 示屏；進樣檢測機構(gòu)由沿圓周均布樣本孔且在孔內(nèi)放置樣本瓶的樣本 轉(zhuǎn)盤和豎直裝配在轉(zhuǎn)盤下面的驅(qū)動電機及對應(yīng)于檢測位樣本孔設(shè)置的 光電檢測器組成；定滴加液機構(gòu)由配置電機的微量泵和設(shè)置于樣本孔 上方的定滴頭及配置在定滴頭滴液口處的計滴器組成；攪拌機構(gòu)由設(shè) 置在樣本轉(zhuǎn)盤下方相應(yīng)位置的攪拌電機和裝配在攪拌電機軸上的磁盤 及放置于樣本瓶內(nèi)的攪拌棒組成。以上專利均與酶法測定無關(guān)，這從一個側(cè)面說明，國內(nèi)此方面的 實驗研究十分缺乏。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得 以測定二氧化碳濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法 的二氧化碳診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析 儀或半、全自動生化分析儀上進行二氧化碳濃度測定，而且測定速度 快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明二氧化碳濃度測定方法原理如下二氧化碳+腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸羧化酶腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸 草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶 L-蘋果酸+輔酶 這種方法應(yīng)用丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase ; EC 6.4.1.1) 酶(偶)聯(lián)蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase ; EC 1丄1.37)酶促反 應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法/速率比色法。丙酮酸羧化酶酶解二氧化碳反應(yīng)產(chǎn)生草酰 乙酸，再通過(偶)聯(lián)合蘋果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340mn處沒有吸收峰)，從而 得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量 340nm處吸光度下降的程度/速度，可以測算二氧化碳的濃度大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明二氧化碳診 斷/測定試劑盒較為理想緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L丙酮酸羧化酶 10000 U/L蘋果酸脫氫酶 12000 U/L腺苷三磷酸 12mmol/L 丙酮酸 30 mmol/L本發(fā)明的二氧化碳診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、蘋果酸 脫氫酶、丙酮酸羧化酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶。 還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶 在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶。試劑緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶。 還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定二氧化碳濃度的方法，其 還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶丙酮酸羧化酶蘋果酸脫氫酶腺苷三磷酸丙酮酸100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12 mmol/L 30 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))， 延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出二 氧化碳的濃度大小。 實施例二本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶腺苷三磷酸丙酮酸腦mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 12 mmol/L 30 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑丙酮酸羧化酶 蘋果酸脫氫酶畫mmol/L 500 mmol/L10000 U/L12000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出二 氧化碳的濃度大小。 實施例三本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為三試劑，包括-試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L還原型輔酶 腺苷三磷酸丙酮酸0.25 mmol/L 12 mmol/L 30 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑蘋果酸脫氫酶濯mmol/L 500 mmol/L 12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑丙酮酸羧化酶100mmol/L500 mmol/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用, 測定二氧化碳濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm，測試副 波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例 為4/40/5/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左 右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出二 氧化碳的濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的二氧化碳濃度測定方法，其方法原理如下二氧化碳+腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸羧化酶 腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶L-蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出二氧化碳的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種二氧化碳診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L丙酮酸羧化酶 1000——80000 U/L蘋果酸脫氫酶 1000——80000 U/L腺苷三磷酸 1——200 mmol/L丙酮酸 1——200 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、蘋果酸脫 氫酶、丙酮酸羧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、蘋果酸脫 氫酶、丙酮酸羧化酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定 齊U、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶組成。還原型輔酶、腺苷三磷酸、 丙酮酸、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、蘋果酸脫 氫酶、丙酮酸羧化酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定 齊U、蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化 酶組成。還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、蘋果酸脫氫酶、丙酮 酸羧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于還 包括穩(wěn)定劑l"4000mmol/L或0.1。/。-100n/。體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定二氧化碳濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑混合，使之發(fā)生酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101324604SQ200710023220
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司