專利名稱：鉀診斷/測定試劑盒及鉀濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鉀診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鉀濃度的 方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
背景技術：
血清鉀三個決定性水平的臨床意義低于參考值下限，表現(xiàn)低鉀血癥， 其原因有腎小管疾病，高醛固酮癥，胰島素過多癥，代謝性堿中毒，利尿 劑治療、胰島素治療糖尿病酮癥時鉀離子轉移至細胞內(nèi)等。高于參考值上 限，可能由腎小球疾病、腎功能衰弱、糖尿病酮癥中毒、腎上腺皮質(zhì)功能
減退等。當血鉀高達7.5mmol/L或以上時病人將出現(xiàn)心律失常，應考慮確 定適當?shù)闹委煼桨?。血清鉀超過10 mmol/L時，即可發(fā)生心室纖顫，心臟 停搏而死亡。高鉀使心臟停跳于舒張期。
目前鉀測定常用的方法有同位素稀釋質(zhì)譜法、中子活化法、火焰光度 計法、化學測定法、離子選擇電極法、原子分光光度法、酶動力學法。
火焰光度法1950年開始使用并一直沿用至今的火焰光度法檢測血清、 尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，是一種發(fā)射光譜分析法。測定方法分為 內(nèi)標準法和外標準法兩種。外標準法操作誤差較大， 一般不采用?，F(xiàn)在主 要使用內(nèi)部標準法，即標本及標準液采用加進相同濃度的內(nèi)部標準元素鋰 或銫進行測定。操作時，將含鋰的溶液作為稀釋液，同時測定K、 Na和Li 的濃度，以標本與標準液的Na/Li與K/Li比值，計算Na、 K濃度。由于血清稀釋倍數(shù)大，血清蛋白質(zhì)粘性的影響幾乎可忽略不計。
化學測定法主要利用復環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠 醚，均為離子載體進行測定，由于大環(huán)結構內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧原子有 未共用電子對可與金屬離子結合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結合不同直徑 的金屬離子，從而可達到測出離子濃度的目的。測定血清K， 一般采用普 通冠醚陰離子染料進行比色定量。
離子選擇電極法ISE法是采用靈敏的特定專用電極，在專用儀器上進 行血清和尿等體液的K+、 Na+的測定，因標本用量少，快速準確，幾乎有取 代其他方法的趨勢。其儀器測定原理是離子選擇電極與參比電極組合浸泡 在待測標本溶液中，進行檢測。目前已有的電極種類為①玻璃膜電極， 感應材料為玻璃薄膜的有pH電極、K+電極和Na+電極；②固相膜電極，由 難溶性金屬物質(zhì)加壓成型，以固體膜或單日膜作為感應膜的電極有Cl—電極 和F—電極；③液態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙稀為感應膜的C,電 極；④用纈氨霉素膜制成的K+電極。上述電極均有一定的壽命，因為電極 使用一段時間就會自動老化，有效期長短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于檢測血清K+、 Na+，操作繁雜， 誤差較大，不及火焰光度法簡便。
鉀測定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法及中子活化法。WHO推薦的方
法是火焰光度計法。目前離子選擇電極法應用較為普遍，但是電極成本昂
蟲 貝°
酶測定法和火焰光度計法或離子選擇電極法均有較好的一致性，且抗干 擾性強，穩(wěn)定性好，彌補了生化分析儀不能同時測定鉀鈉的不足。有較的分析性能，易于自動化，在臨床化學分析中必定取代火焰光度計法成為
常規(guī)分析項目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環(huán)擴增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法 (Couple Reaction)技術，計量通過酶聯(lián)反應生成tl引嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneiminedye)所導致在400—700nm波長處吸光 度的上升，得以測定鉀濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方 法的鉀診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在可見光分析儀或半、全自 動生化分析儀上進行鉀濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確度高， 因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明鉀濃度測定方法原理如下
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶化+ 腺苷三磷酸
+丙酮酸
丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+
水+輔酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+
過氧化氫
過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶噴嗒胺色原或
醌亞胺色原+水
這個方法應用需要鉀離子激活的丙酮酸激酶(pyruvate kinase ; EC 2.7.1.40)聯(lián)合丙氨酸脫氫酶(alaninedehydrogenase; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase; EC 1.4.3.19)及過氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。丙酮酸激酶作為作用酶，功能為將磷酸烯 醇式丙酮酸酶解產(chǎn)生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶也作為作用酶，它的酶促作用 使丙酮酸產(chǎn)生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作為循環(huán)酶可以一再將丙氨酸再次變 回丙酮酸，使丙酮酸不斷地被重復循環(huán)利用；同時不斷地重復循環(huán)產(chǎn)生過 氧化氫。過氧化物酶(peroxidase ; EC Lll丄7)作為顯色酶，通過和過氧 化氫的作用，使無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通 過可見光分析儀器，在400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定) 波長處測定染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大小程度/速度，得出氨基酸(氮)濃度大小測
定結果。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮， 如下成分關系的本發(fā)明鉀診斷/測定試劑盒較為理想
緩沖液 穩(wěn)定劑 過氧化物酶 丙酮酸激酶
甘氨酸氧化酶
磷酸烯醇式丙酮酸
腺苷二磷酸
100mmol/L 500 mmol/L 30000 U/L 10000 U/L 12000 U/L 12000U/L 6 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L
氨離子可以用任何氨鹽。
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任何
一個配對組合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基""N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2.4- 雙氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3.5- 雙氯-2-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2,2，-AZINO-雙G-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
4-氨基抗砒 ， 仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 雙甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
本發(fā)明的鉀診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、磷酸烯醇 式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子、過氧化物酶、還原型色原體組合。試劑 盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二 磷酸、氨離子。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、丙酮酸激酶、
丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸 氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可
以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二 磷酸、氨離子 。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化 酶、過氧化物酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子在試劑1、試劑2或試 劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的鉀診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L丙酮酸激酶丙氨酸脫氫酶甘氨酸氧化酶過氧化物酶磷酸烯醇式丙酮酸腺苷二磷酸10000U/L12000 U/L12000U/L30000 U/L 6 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L4-氨基抗砒2 mmol/L石碳酸 10mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使 用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間IO分鐘，測試主波長505nm，測試副波長600nm，被測鉀樣品與試劑的體積比例為1/25， 反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約1分鐘 左右，檢測時間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出鉀的濃度大 小。實施例二本實施例的鉀診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑l三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑磷酸烯醇式丙酮酸 腺苷二磷酸2,4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸訓mmol/L 50 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L0.2 mmol/L試劑2(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 丙酮酸激酶甘氨酸氧化酶過氧化物酶4-氨基抗砒500 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L 30000 U/L0.6 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，測試主波長546nm，測試副波長600nm，被測鉀樣品與試劑的體積比例為1/20，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出鉀的濃度大小。實施例三本實施例的鉀診斷/測定試劑為三試劑，包括: 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑磷酸烯醇式丙酮酸 腺苷二磷酸100 rtimol/L 50 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L3-甲基-2-苯噻唑酮腙0.6 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑甘氨酸氧化 過氧化物酶雙甲基苯胺500 mmol/L 12000U/L 12000 U/L 30000 U/L 2 mmol/L試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L10000U/L丙酮酸激酶試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，測試主波長578nm，測試副波長660nm，被測鉀樣品與試劑的體積比例為1/30，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出鉀的濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉?？傊?，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分析儀 器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)量污 染。
權利要求
1.一種酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的鉀濃度測定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶/K+ 腺苷三磷酸 +丙酮酸丙酮酸+氨離子+還原型輔酶 丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+ 水+輔酶丙氨酸+水+氧 甘氨酸氧化酶 氨離子+丙酮酸+ 過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶 吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出鉀濃度大小測定結果。
2. —種鉀診斷/測定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液 穩(wěn)定劑 過氧化物酶 丙酮酸激酶 丙氨酸脫氫酶 甘氨酸氧化酶 磷酸烯醇式丙酮酸20-500 mmol/L1-4000 mmol/L500——80000 U/L1000——80000 U/L1000——80000 U/L1000——80000 U/L1- 50mmol/L腺苷二磷酸 1——50 mmol/L氨離子 1- 50mmol/L還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。氨離子可以用任何氨鹽。3. 根據(jù)權利要求2所述鉀診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、磷酸 烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子、過氧化物酶、還原型色原體組合 組成單劑試劑。4. 根據(jù)權利要求2所述鉀診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、磷酸 烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子、過氧化物酶、還原型色原體組合 組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷 二磷酸、氨離子、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原 體組合組成。過氧化物酶、還原型色原體組合、丙酮酸激酶、丙氨酸脫 氫酶、甘氨酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子在試劑 l或試劑2中的位置可以不限。5. 根據(jù)權利要求2所述鉀診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、磷酸 烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子、過氧化物酶、還原型色原體組合 組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶組成。過氧化物酶、還原型色原體組合丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。6. 根據(jù)權利要求2所述鉀診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。7. 根據(jù)權利要求2所述鉀診斷/測定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-齊基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的鉀診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鉀濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨離子、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出鉀濃度的大小。
文檔編號G01N21/31GK101329355SQ20071002472
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司