專利名稱：甘油診斷/測(cè)定試劑盒及甘油的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘油診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定甘油濃 度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景甘油又名丙三醇，是一種無(wú)色、無(wú)嗅、味甘的粘稠液體。甘油大量用作 化工原料，用于制造合成樹脂、塑料、油漆、硝酸甘油.、油脂和蜂蠟等， 還用于制藥、香料、化妝品、衛(wèi)生用品等工業(yè)中，甘油是食品加工業(yè)中通 常使用的甜味劑和保濕劑，大多出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)食品和代乳品中。歐盟的一個(gè)檢測(cè)游離甘油含量的標(biāo)準(zhǔn)是EN 14106，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)首先對(duì)生 物柴油進(jìn)行萃取，經(jīng)過(guò)萃取后進(jìn)行氣相色譜分析，到目前為止，已經(jīng)有幾 種氣相色譜分析方法被報(bào)道過(guò)。Lozanoetal. (1996)用帶有脈沖安培檢 測(cè)器的高效液相色譜來(lái)檢測(cè)從甲酯或乙酯中萃取出來(lái)的甘油溶液。其它的檢測(cè)游離甘油含量的色譜和非色譜測(cè)試方法有Greenhill建 議了一種酶法測(cè)試的替代方法，甘油經(jīng)過(guò)酶轉(zhuǎn)化后生成的H202用作形成醌 亞胺色素的轉(zhuǎn)化物，而色素的濃度可以通過(guò)光譜法進(jìn)行檢測(cè)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù) 監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定甘油濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的甘油診 斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生 化分析儀上進(jìn)行甘油濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得 到切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明甘油濃度測(cè)定方法原理如下甘油+腺苷三磷酸甘油激酶甘油-3-磷酸+腺苷二磷酸甘油-3-磷酸+輔酶 甘油-3-磷酸脫氫酶甘油酸磷酸+還原型輔酶這種方法應(yīng)用甘油激酶(Glycerokinase; EC2.7丄30)偶聯(lián)甘油-3-磷酸 脫氫酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase; EC 1.1.1.8; EC 1.1.1.94; EC 1.U.177)酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。甘油激酶酶解甘油反應(yīng)產(chǎn)生甘油 -3-磷酸，再通過(guò)偶聯(lián)甘油-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處 沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè) 定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸 光度上升的程度/速度，可以測(cè)算甘油的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明甘油診斷/測(cè)定試劑盒 較為理想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L腺苷三磷酸 8 mmol/L甘油激酶 10000 U/L甘油-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L本發(fā)明的甘油診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶。 輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油-3-磷酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油激酶。輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定甘油濃度的方法，其輔酶可以 是NADP+、 NAD+或thio- NAD十中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的甘油診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L腺苷三磷酸 8 mmol/L甘油徵酶 10000 U/L甘油-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍千燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)甘油樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘 左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出甘油的濃度大小。實(shí)施例二本實(shí)施例的甘油診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1 '三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑腺苷三磷酸50 mmol/Lmmol/L8 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑甘油激酶甘油-3-磷酸脫氫 500 mmol/L10000U/L12000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)甘油樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出甘油的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的甘油診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括: 試劑l三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑腺苷三磷酸 試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑甘油-3-磷酸脫氫酶100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L畫mmol/L 500 mmol/L 12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 甘油激酶500 mmol/L10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測(cè)定甘油濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被 測(cè)甘油樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)?正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出甘油的濃度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同， 不另一一例舉?？傊?，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的甘油的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下甘油+腺苷三磷酸 甘油激酶 甘油-3-磷酸+腺苷二磷酸甘油-3-磷酸+輔酶 甘油-3-磷酸脫氫酶 甘油酸磷酸+ 還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，測(cè)算出甘油的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種甘油診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-穩(wěn)定劑 l一 輔酶 1--500 mmol/L-4000 mmol/L6 mmol/L1000-1000-50 mmol/L-80000 U/L-80000 U/L腺苷三磷酸 甘油激酶甘油-3-磷酸脫氫酶其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘油診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸 組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘油診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸組成; 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、 甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘油診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷 酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸組成; 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油-3-磷酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、甘油激酶組成。輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、 腺苷三磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甘油診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的甘油診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定甘油濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷三磷酸、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出甘油的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101329335SQ200710024730
公開日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司