專利名稱：：一種快速測定咪唑立賓血藥濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬醫(yī)學檢驗領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測定方法，具體涉及一種快速測定人血漿中咪唑立賓濃度的方法。
背景技術(shù)：
：咪唑立賓(mizoribine,MZR)是一種嘌呤核苷合成抑制劑，能特異性地抑制快速增長的淋巴細胞，從而產(chǎn)生免疫抑制作用。近年來在臨床上用于抑制腎移植時的排斥反應(yīng)，同時也用于治療狼瘡性腎炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎及腎病綜合征等自身免疫性疾病。該藥的個體間藥動學差異大，臨床上須進行血藥濃度監(jiān)測以調(diào)整個體化給藥方案。H前關(guān)于生物樣本中MZR的測定方法，國內(nèi)外相關(guān)報道很少，現(xiàn)有的方法均未采用內(nèi)標法定量，測定準確度、精密度較低，且存在靈敏度低(最低定量限為O.lmgL—。、操作繁瑣費事、效率低、分析成本高等種種缺陷，不適合常規(guī)治療藥物濃度監(jiān)測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的缺陷，提供一種簡便、快速、靈敏的測定體內(nèi)咪唑立賓血藥濃度的方法。本方法無需昂貴的設(shè)備，無需有機溶劑，具有操作簡便、快速、血漿用量少、成本低、環(huán)境污染小等優(yōu)點，適合常規(guī)血藥濃度監(jiān)測。本方法的技術(shù)方案是待測樣品加入內(nèi)標，經(jīng)酸性沉淀劑預處理后，經(jīng)水性流動相在色譜柱分離，用紫外檢測器檢測。包括下述步驟1)樣品預處理取待測樣品，加入內(nèi)標后以酸性沉淀劑進行蛋白沉淀，所述的內(nèi)標為阿糖胞苷，酸性蛋白沉淀劑為O.1-0.5mol*f高氯酸溶液；2)樣品分離與分析采用通用型的液相色譜柱，其填料為HypersilBDSC185咖，高效液相系統(tǒng)采用通用型的紫外檢測器以及高壓泵，流動相采用含有高氯酸的10,olL—'磷酸二氫鉀緩沖液(PH6.0-6.5)，等度洗脫本方法流動相優(yōu)選高氯酸濃度為5-30mtnol*L—';采用紫外檢測器280±lnm檢測阿糖胞苷和MZR的峰面積，用標準曲線方程換算成濃度。本方法具有以下優(yōu)點J、樣品預處理過程加入內(nèi)標，有利于提高測定方法的準確性和精密度。2、預處理方法簡便一步酸性沉淀劑蛋白沉淀法，適用于常規(guī)檢測。3、專屬性強采用填料為HypersilBDSC185um的色譜柱作為固定相，含高氯酸的10咖ol'L—1磷酸二氫鉀緩沖液作為流動相，等度洗脫，11分鐘完成測定，內(nèi)源性物質(zhì)和常用合并用藥不干擾上述藥物的測定。4、靈敏度高最低定量限為0.02mgL—、優(yōu)于文獻報道的0.lmgL—、本發(fā)明方法快速準確、靈敏度高、操作簡便、成本低、適合于臨床常規(guī)血藥濃度監(jiān)測。MZR的線性范圍為0.02-lOnig'L-、平均方法回收率為101.84%,日內(nèi)和日間精密度RSD均小于7'k圖1是典型色譜圖，其中A:未服用咪唑立賓的腎移植患者血漿；B:空白血漿+標準品咪唑立賓(濃度0.5fflg*L"+內(nèi)標阿糖胞苷(濃度:2mg'L-";1:咪唑立賓；2:阿糖胞苷。圖2是服用咪唑立賓的腎移植患者血漿色譜圖(濃度0.31tng*L—"其中，1:咪唑立賓；2:阿糖胞苷。具體實施方式實施例1色譜條件色譜柱:Hypersi1BDSCl8(4.6X250min，5ym,大連依利特公司)；流動相10咖ol'L—'磷酸二氫鉀溶液(含高氯酸10mmol'L—、PH6.0-6.5);流速1.5mL'min1;柱溫室溫；檢測波長280nm。血漿樣品預處理取血漿樣品200uL加入20mg'L—1阿糖胞苷20iiL，加入蒸餾水20yL，渦旋混合30s，加入O.liooll,'高氯酸，渦旋混合lmin，10000"邁in皿1離心5min，取上清液20uL進樣。內(nèi)標法以MZR與阿糖胞苷峰面積比定量。專屬性取不同來源的10名未服用MZR的腎移植患者血樣，按照上述樣品預處理和測定方法進行測定，結(jié)果顯7"未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)對上述測定組分有干擾。取常用合并用藥和非處方藥物對照品溶液進樣，結(jié)果顯示，環(huán)孢素、強的松、他克莫司、西羅莫司、麥考盼酸、6-巰基嘌呤、阿昔洛韋、更昔洛韋、利巴韋林、倍他洛克、硝苯地平、地爾硫卓、對乙酰氨基酚、布洛芬、雙氯芬酸等均不干擾樣品測定。MZR典型保留時間為4.0min,阿糖胞苷典型保留時間為6.8min，色譜分析過程時間為llmin。線性試驗精密稱取標準物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解成系列工作液，再加入空白人血漿，制成含MZR0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10mgL—1標準血樣。取血漿200uL,按"血漿樣品預處理"方法操作。內(nèi)標法以MZR與阿糖胞苷峰面積比(x)為橫坐標，MZR濃度(y)為縱坐標線性回歸，得線性回歸方程為y:0.703x-0.021(r=0.9998)。MZR血漿濃度在0.02-10mg'L—'范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低定量濃度為0.02mg'L—'。準確度和精密度精密稱取標準物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解，空白血漿稀釋定容，制成含MZR0.075，0.75，7.5nigL—1的低、中、高質(zhì)控血樣。取血漿200yL，按"血漿樣品預處理"方法操作，考察日內(nèi)和日間精密度和準確度,，根據(jù)線性回歸方程計算其實測濃度，計算每種濃度的實測平均值及相對標準偏差(RSD),(C麵/C理論)X100'礎(chǔ)卩為回收率，實驗結(jié)果表明內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物的測定。上述待測組分和內(nèi)標物質(zhì)峰形對稱、分離良好。表1為MZR的曰內(nèi)、日間精密度和方法回收率。同時，本方法己在實際患者血藥濃度的測定中得到了驗證。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>實施例2色譜條件色譜柱HypersilBDSC18(4.6X250咖，5um，大連依利特公司)流動相10鵬ol'L—'磷酸二氫鉀溶液(含高氯酸20mmol'L—、PH6.0-6.5);流速1.5niL'niin—、柱溫室溫；檢測波長280nm。血漿樣品預處理取血漿樣品200uL，加入20mg'f阿糖胞苷20uL,加入蒸餾水20uL,渦旋混合30s，加入0.25molL'高氯酸，渦旋混合l邁in，10000r'邁in1離心5min，取上清液20nL進樣。內(nèi)標法以MZR與阿糖胞苷峰面積比定量。專屬性取不同來源的10名未服用MZR的腎移植患者血樣，按照上述樣品預處理和測定方法進行測定，結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)對上述測定組分有干擾。取常用合并用藥和非處方藥物對照品溶液進樣，結(jié)果顯示.環(huán)孢素、強的松、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸、6-巰基嘌呤、阿昔洛韋、更昔洛韋、利巴韋林、倍他洛克、硝苯地平、地爾硫卓、對乙酰氨基酚、布洛芬、雙氯芬酸等均不干擾樣品測定。MZR典型保留時間為4.0min，阿糖胞苷典型保留時間為6.8邁in，色譜分析過程時間為llmin。線性試驗精密稱取標準物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解成系列工作液，再加入空白人血漿，制成含MZR0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、lOmg*L—'標準血樣。取血漿200uL，按"血漿樣品預處理"方法操作。內(nèi)標法以MZR與阿糖胞苷峰面積比(x)為橫坐標，和MZR濃度(y)為縱坐標線性回歸，得線性回歸方程為y0.683x0.019(r=0.9999)。MZR血漿濃度在0,02-lO邁g.L—1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低定量濃度為0.02tug*L—'。準確度和精密度精密稱取標準物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解，空白血漿稀釋定容，制成含MZR0.075,0.75，7.5mgL1的低、中、高質(zhì)控血樣。取血漿200uL，按"血漿樣品預處理"方法操作，考察日內(nèi)和日間精密度和準確度。根據(jù)線性回歸方程計算其實測濃度，計算每種濃度的實測平均值及相對標準偏差(RSD),(C/C)X100%即為回收率，實驗結(jié)果表明平均方法回收率為101.84%，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于7%。實施例3色譜條件色譜柱:HypersilBDSCl8(4.6X250mm,5um,大連依利特公司)；流動相10迅inol'L—'磷酸二氫鉀溶液(含高氯酸30mmol'L—、PH6.0-6.5);流速1.5mL'miti—1;柱溫室溫；檢測波長280nm。血漿樣品預處理取血漿樣品200uL，加入20mg'L—1阿糖胞苷20uL,加入蒸餾水20uL，渦旋混合30s，加入0.5mo1L'高氯酸，渦旋混合linin，10000r'inin—1離心5min，取上清液20yL進樣。內(nèi)標法以MZR與阿糖胞苷峰面積比定量。專屬性取不同來源的IO名未服用MZR的腎移植患者血樣，按照上述樣品預處理和測定方法進行測定，結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)對上述測定組分有干擾。取常用合并用藥和非處方藥物對照品溶液進樣，結(jié)果顯示.環(huán)孢素、強的松、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸、6-巰基嘌呤、阿昔洛韋、更昔洛韋、利巴韋林、倍他洛克、硝苯地平、地爾硫卓、對乙酰氨基酚、布洛芬、雙氯芬酸等均不干擾樣品測定。MZR典型保留時間為4.0邁in，阿糖胞苷典型保留時間為6.8min,色譜分析過程時間為llmin。線性試驗精密稱取標準物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解成系列工作液，再加入空白人血漿，制成含MZR0.02、0.05、0.丄、0.2、0.5、1、2、5、lOing*L—1標準血樣。取血漿200uL，按"血漿樣品預處理"方法操作。內(nèi)標法以MZR與阿糖胞苷峰面積比(x)為橫坐標，和MZR濃度(y)為縱坐標線性回歸，得線性回歸方程為y-()691x0.010(r=0.9998)。MZR血槳濃度在0.02-10mg.L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低定量濃度為0.02mg*i:1。準確度和精密度精密稱取標準物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解，空白血漿稀釋定容，制成含MZR0.075，0.75，7.5mg'L—1的低、中、高質(zhì)控血樣。取血漿200uL，按"血漿樣品預處理"方法操作，考察日內(nèi)和日間精密度和準確度。根據(jù)線性回歸方程計算其實測濃度，計算每種濃度的實測平均值及相對標準偏差(RSD)，(C細/C理論)XJ(Xm即為回收率，實驗結(jié)果表明平均方法回收率為100.68%，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于7W。權(quán)利要求1.一種快速測定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是待測樣品預處理后，經(jīng)水性流動相在色譜柱上分離，用紫外檢測器檢測，包括下述步驟1)樣品預處理取待測樣品，加入內(nèi)標后，加入定量的酸性沉淀劑進行蛋白沉淀；2)樣品分離與分析采用通用型液相色譜柱，其填料為HypersilBDSC185um，高效液相系統(tǒng)采用通用型的紫外檢測器以及高壓泵，流動相采用含有高氯酸的磷酸二氫鉀緩沖液，等度洗脫；3)紫外檢測器檢測測咪唑立賓、內(nèi)標峰面積，以二者峰面積比代入標準曲線方程計算濃度。2、按權(quán)利要求1所述的測定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是所述步驟l)的內(nèi)標為阿糖胞苷。3、按權(quán)利要求1所述的測定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是所述步驟l)的酸性沉淀劑為0.1-0.5mo1L—'的高氯酸溶液。4、按權(quán)利要求1所述的測定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是所述步驟2)的流動相混合液為l()mmolL—'磷酸二氫鉀緩沖液，其含高氯酸濃度為5-30mmo卜L—'。5、按權(quán)利要求1所述的測定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是所述步驟2)的流動相混合液PH6.0-6.5。6、按權(quán)利要求1所述的測定咪唑立賓血藥濃度的方法.其特征是所述步驟3)的紫外檢測器檢測，檢測波長為280mn。全文摘要本發(fā)明屬醫(yī)學檢驗領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測定方法，具體涉及一種快速測定人血漿中咪唑立賓濃度的方法。本發(fā)明方法于待測樣品中加入內(nèi)標后，經(jīng)蛋白沉淀預處理后，在水性流動相條件下等度洗脫，經(jīng)色譜柱分離后，用紫外檢測器檢測。本方法樣品取樣量少，預處理方法簡單、快速、靈敏，無需昂貴的設(shè)備和有機溶劑，使用面廣，環(huán)境污染小，成本低，適合于臨床常規(guī)血藥濃度的監(jiān)測。文檔編號G01N30/00GK101226172SQ20071002633公開日2008年7月23日申請日期2007年1月17日優(yōu)先權(quán)日2007年1月17日發(fā)明者斌任,張志豪,王長希,孝陳申請人:中山大學附屬第一醫(yī)院