專利名稱：：用表面等離子體子共振傳感器研究藥物與生物分子相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于用波長檢測型表面等離子體子共振(Surfaceplasmonresonance,SPR)傳感器研究藥物與生物分子相互作用的方法領(lǐng)域，特別涉及本課題組研制的波長檢測型SPR分析儀及其應(yīng)用方法。技術(shù)背景自從Liedberg等將SPR技術(shù)用于化學(xué)和生物傳感器研究領(lǐng)域以來，SPR傳感器逐漸成為國際傳感器領(lǐng)域的研究熱點。近年來在分子水平上進行功能研究的技術(shù)大量涌現(xiàn)，其中SPR技術(shù)比較引人注目。尤其自上世紀九十年代Pharmacia公司(現(xiàn)為BIAcoreAB公司)將這一技術(shù)商品化以來，SPR技術(shù)用于生物分子相互作用的研究取得了迅猛的發(fā)展。短短幾年內(nèi)，運用此新技術(shù)所發(fā)表的文獻幾乎包括了現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域，使分子相互作用的研究取得了前所未有的突破，進而全面推動了生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域的進展。由于SPR技術(shù)具有能實時監(jiān)測反應(yīng)動態(tài)過程、樣品無需標記、靈敏度較高、無背景干擾等特點，主要應(yīng)用于研究大分子之間的相互作用，可得到反應(yīng)物分子之間每一步的鍵合信息，測定動力學(xué)常數(shù)，已在生物科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用中取得了長足進展。據(jù)粗略的統(tǒng)計，在生物傳感器領(lǐng)域發(fā)表的文章中，大約有70%報道了關(guān)于SPR傳感器被應(yīng)用到對生物分子間反應(yīng)的檢測。已報道的各類SPR商品儀器都是采用固定波長，測定共振角度變化的工作模式，這種工作模式，或者需要有一個機械傳動裝置來改變?nèi)肷涔饨嵌龋蛘咝枰ㄟ^點光源的發(fā)散作用，測定角度的變化。前者在儀器中有一個可動部件，后者測量的角度范圍較小，限制了方法的應(yīng)用。這類市售的棱鏡型SPR傳感器儀器價格昂貴，不宜普及。自行設(shè)計組裝的波長檢測型SPR分析儀容易實現(xiàn)多波長同時檢測，且檢測的波長范圍不受限制，這樣不僅使傳感器表面被檢測物質(zhì)量的范圍不受限制，即折射率變化的范圍不受限制，而且非常有益于分子間或分子與組織(如細胞)間相互作用的研究；其次，由于現(xiàn)在用于波長選擇的器件比較成熟，且有的器件具有很高的波長分辨能力，所以有望進一步提高SPR分析儀的靈敏度。本儀器特別適于分子間相互作用的研究，對于研究藥物與生物分子的作用、藥物篩選及藥物化學(xué)的發(fā)展具有重要意義，且對SPR傳感器方法、儀器裝置的發(fā)展及應(yīng)用也具有重要意義。傳統(tǒng)的藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的研究方法有平衡透析法和超濾法。其中平衡透析法為經(jīng)典的參比方法，由于需建立結(jié)合平衡，運用此法耗時長(幾個小時或幾天)。超濾法則由于常需進行放射性或熒光標記而帶來很大不便。這兩種方法均存在膜對藥物的吸附，以及Donnan效應(yīng)(由于蛋白和藥物均帶電荷，使得膜兩側(cè)的游離藥物濃度不相等)等問題，對于高結(jié)合率藥物的游離藥物濃度難以準確檢測。其他方法還有免疫分析法，液相色譜法，熒光淬滅法和毛細管電泳法。其中免疫分析法耗時長，而且只能用于定性、半定量，無法滿足深層次藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合研究的要求；液相色譜法不僅需要樣品量大、柱吸附嚴重，且常需添加改良溶劑，不能準確評價生理條件下的藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合作用；當(dāng)藥物與白蛋白結(jié)合的位點遠離色氨酸時，此時應(yīng)用熒光淬滅法就不能檢測到藥物與蛋白的結(jié)合；毛細管電泳法最主要的缺點是它的靈敏度不高。近年來，SPR已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物一蛋白的結(jié)合研究。將一系列藥物作用在已固定的蛋白上，根據(jù)藥物與蛋白作用的SPR信號強度來確定藥物與蛋白的結(jié)合情況。在SPR的應(yīng)用中，一般要求作敏感膜的分子一端為可與金或銀鍵合的活性基團，而其另一端為具有分子識別功能的活性基團。巰基丙酸的巰基端可與金膜連接，另一末端的羧基可作為活性基團，用其連接抗體分子，結(jié)果良好。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是采用波K:檢測型SPR傳感器，研究藥物分子與生物分于的相互作用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來加以實現(xiàn)采用波長檢測型SPR傳感器，研究藥物分子與生物分子相互作用的方法，涉及下列步驟1.釆用本課題組研制的波長檢測型SPR分析儀由光源l、導(dǎo)光系統(tǒng)2，3，4,10，11、傳感元件5，6、流通池7，8，9、分光檢測系統(tǒng)12和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成；2.傳感器的制備采用下列步驟在波長檢測型SPR分析儀中，選用玻璃棱鏡5作為傳感器的傳感元件；采用真空鍍膜法，在棱鏡5的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜，作為傳感器的傳感膜6;3.在傳感膜6底部的流通池7中注入巰基丙酸(MPA)溶液，待MPA在金膜表面自組裝完成后，將磷酸鹽(PBS)緩沖溶液注入到流通池7中反復(fù)沖洗，以清除傳感器表面的非特異性結(jié)合；4.待共振波長不再變化后，向流通池7中注入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)隱carbodimidehydrochloride,C8H17N3'HC1，分子量為191.7，簡稱EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide，C4H5N03，分子量為115.1，簡稱NHS)溶液，觀察SPR光譜隨時間的變化，當(dāng)共振波長基本穩(wěn)定時，用PBS緩沖溶液反復(fù)沖洗傳感器表面至共振波長不再發(fā)生變化；5.注入血清白蛋白溶液，記錄共振波長隨時間的變化情況，當(dāng)血清白蛋白形成穩(wěn)定的單分子層后，共振波長穩(wěn)定時，此時將PBS緩沖溶液注入到流通池7中反復(fù)沖洗至共振波長不再發(fā)生變化；6.將藥物分別用PBS緩沖溶液稀釋為n個不同濃度，依次注入到流通池7，記錄共振波長隨時間的變化。每個樣品監(jiān)測完畢后，均注入PBS緩沖溶液沖洗流通池7。7.通過藥物的濃度[D]、波長變化A入、波長變化的響應(yīng)信號AXmax,，通過以下方程(1)可計算出反映藥物分子與生物分子相互作用的結(jié)合速率常數(shù)ka和解離速率常數(shù)kd。dA入/dt=ka[D](Almax—AX)—kdA人(1)本發(fā)明還可以在MPA自組裝完畢后，引入用以提高傳感器靈敏度的金納米粒子。本發(fā)明還可以在MPA自組裝完畢后，引入用以提高傳感器靈敏度的一層或多層除血清白蛋白之外的蛋白，構(gòu)成三明治夾心式傳感器。本發(fā)明所采用的儀器由光源、導(dǎo)光系統(tǒng)(透鏡、偏振片、光纖)、傳感元件(玻璃棱鏡、傳感膜)、流通池、分光檢測系統(tǒng)(CCD檢測器)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成用鹵鎢燈或發(fā)光二極管作為光源，從光源發(fā)出的白色光經(jīng)過平行偏振光管(由二個透鏡和一個偏振片組成)后變成平行偏振光，以一定的角度照射到棱鏡的側(cè)面上，經(jīng)折射后光線到達棱鏡的底部。采用真空鍍膜法，在棱鏡的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜，采用分子自組裝法在金屬膜表面涂一層對待測物有特異結(jié)合能力的分子，組成敏感膜，光線在棱鏡與金屬的界面處發(fā)生全內(nèi)反射，然后從棱鏡的另一個側(cè)面折射出去，通過下一個透鏡聚焦耦合進入光導(dǎo)纖維，由光纖將信號光再傳輸至光柵和電荷耦合器件(CCD)檢測器，當(dāng)溶液中含有待測物及待測物濃度改變時，共振波長有明顯變化，據(jù)此對待測物進行研究。實驗方法是將傳感器固定在流通池口上面，流動注射進樣，當(dāng)試樣通過流通池時傳感器鍍膜一面與被分析試液接觸，復(fù)色光通過偏振片及透鏡后照射在棱鏡上，發(fā)生共振，產(chǎn)生強烈的共振吸收，通過繪制反射光強度隨波長的變化曲線，對被測物質(zhì)進行研究。本發(fā)明研究的藥物分子和生物分子相互作用的結(jié)合速率常數(shù)ka和解離速率常數(shù)kd的計算方法如下前述方程(1)中AX是共振波長的變化，即SPR的信號，其代表了傳感器表面血清白蛋白(P)和藥物(D)的濃度。dA入/dt是SPR信號的變化速率。A入max是傳感器表面結(jié)合藥物飽和時的響應(yīng)信號，即相當(dāng)于傳感器表面形成的PD復(fù)合物的最大濃度。方程(1)的積分形式為AX={ka[D]A、ax/(ka[D]+kd)}{1-exp(-([D]ka+kd)t)(2)解離過程可用下列方程表示d扁t--kaA入(3)它的積分形式為InAVA入c^-kd(t-10)(4)式中t。是反應(yīng)開始的時間，其所對應(yīng)的SPR信號為AX。，而A人是任何時刻t的SPR信號。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)和方程(1)—(4),可求出動力學(xué)數(shù)據(jù)ka，kd和熱力學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合常數(shù)KA和解離常數(shù)Ko。圖1為波長檢測型SPR分析儀的結(jié)構(gòu)示意圖；1為光源，2、3和10為透鏡，4為偏振片，5為玻璃棱鏡，6為傳感膜，7為流通池，8為進樣口，9為排廢口，ll為光纖，12為CCD檢測器。圖2為流通池結(jié)構(gòu)示意圖；5為玻璃棱鏡，6為傳感膜，7為流通池，8為進樣口，9為排廢口，13為水浴，14為水浴入水口，15為水浴出水口。圖3為傳感器連接示意圖，也是摘要附圖；6為傳感膜，16為玻璃基底(棱鏡底面)，17為巰基丙酸和NHS、EDC修飾層，18為血清白蛋白層，19為藥物分子連接層。圖4為不含MPA及含有MPA溶液引入樣品池時得到的SPR光譜；20為不含MPA時得到的SPR光譜；21為含有MPA時得到的SPR光譜。具體實施方式實施例l:抗生素類藥物與人血清白蛋白相互作用的研究抗生素又稱抗菌素。是由一些微生物合成的、能抑制或殺滅某些病原體的化學(xué)物質(zhì)?？股厥俏⑸锏囊环N次生代謝產(chǎn)物，少量低濃度使用時能對另一種微生物的生長和代謝起抑制或殺滅作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)400多種抗生素，各種抗生素的抗菌機理和作用各不相同。如青霉素和桿菌肽能阻礙細菌細胞壁的合成；多肽類抗菌素可破壞細菌的質(zhì)膜；氯霉素、鏈霉素等可抑制蛋白質(zhì)的合成或干擾核酸的合成等。有的抗菌素作用范圍小，如青霉素只對革蘭氏陽性細菌有效，叫做狹譜抗菌素。有些抗生素作用范圍較廣，如四環(huán)素對多數(shù)細菌均有抑制作用，稱做廣譜性抗生素。目前廣泛應(yīng)用的抗生素約IOO多種，如青霉素、鏈霉素、慶大霉素等都普遍用于醫(yī)療。在農(nóng)業(yè)上春雷霉素、井崗霉素已廣泛用于水稻病菌的防治，滅瘟素用T防治稻瘟病，赤霉素用于促進植物的生長等等。但在使用抗生素時要針對病癥、不可亂用。有的抗生素能產(chǎn)生一些副作用，如連續(xù)使用鏈霉素、慶大霉素都會引起耳聾，服用過量的氯霉素可造成白細胞減少等。也有些人對某種抗生素有過敏反應(yīng)，嚴重時甚至有致命危險。本發(fā)明應(yīng)用自行設(shè)計并組裝的波長檢測型SPR分析儀，釆用氨基耦聯(lián)的方法將血清白蛋白固定在傳感器表面，研究了青霉素VK,苯唑西林，阿莫西林，頭孢哌酮，頭孢噻肟鈉，依諾沙星，諾氟沙星七種抗生素藥物與人血清白蛋白(HSA)的相互作用。測定了反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù)及平衡常數(shù)，同時計算了它們的鍵合百分率。1.儀器采用本課題組研制的波長檢測型SPR分析儀；試劑3—巰基丙酸(MPA)，NHS，EDC青霉素VK，苯唑西林，阿莫西林，頭孢哌酮，頭孢噻肟鈉，依諾沙星，諾氟沙星標準品人血清白蛋白、牛血清白蛋白其它所有試劑均為國產(chǎn)分析純試劑2.傳感器的制備采用下列步驟在波長檢測型SPR分析儀中，選用直角玻璃棱鏡的底面作為傳感器的傳感元件；采用真空鍍膜法，在棱鏡的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜，作為傳感器的傳感膜；3.將樣品池中注入PBS緩沖溶液，記錄共振波長，將10mmol/L的MPA溶液注入樣品池中，通過觀測SPR共振波長的位移，從而監(jiān)測MPA與金結(jié)合的動力學(xué)過程。圖4為不含MPA及含有MPA溶液引入樣品池時得到的SPR光譜。將含有MPA的溶液注入樣品池后，隨著時間的推移，共振波長不斷向長波方向移動，且在開始的幾分鐘內(nèi)組裝較為迅速。在5min內(nèi)，SPR光譜共振波長位移值達總量的99%，30min左右組裝基本完全，共振波長的最大位移值為11.67nm。用PBS緩沖溶液沖洗傳感器表面至共振波長基本不再變化，說明MPA的巰基端與金形成的S-Au鍵很穩(wěn)定。4.向流通池中加入濃度均為40mg/mL的EDC和NHS混合溶液，EDC可催化MPA和NHS的反應(yīng)，使MPA的羧基端酰化，以利于血清白蛋白的連接。5.在MPA修飾膜組裝完全后，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗傳感器表面，以清除特異性吸附。然后將血淸白蛋白注入樣品池。因MPA的羧基端?；髮ρ灏椎鞍譌c段能特異性結(jié)合，可使血淸白蛋白在敏感膜上定向自組裝。實驗考察/人血清白蛋白(HSA)濃度對其在MPA上進行定向自組裝的影響。將HSA配制成濃度為0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL的溶液，不同濃度的HSA在MPA上自組裝的結(jié)果(12h)見表l。綜合考慮，選擇HSA的濃度為0.1mg/mL。表l不同濃度的HSA在MPA上自組裝的結(jié)果(12h)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6.當(dāng)血清白蛋白存:敏感膜上自組裝成穩(wěn)定的分子膜后，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗流通池，待共振波長不再改變時，向流通池中依次注入不同濃度的青霉素VK,苯唑兩林，阿莫西林，頭孢哌酮，頭孢噻肟鈉，依諾沙星或諾氟沙星(均用PBS配制)，實時監(jiān)測并記錄SPR光譜的共振波長位移值，測定時間為30min。7.根據(jù)監(jiān)測所得數(shù)據(jù)，經(jīng)過分析并計算，可得到這些藥物與HSA以及BSA之間鍵合的動力學(xué)常數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)及鍵合百分率(見表2)。表2藥物與HSA之間鍵合的熱力學(xué)常數(shù)及鍵合百分率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>這7種抗生素類藥物與HSA都有不同程度的結(jié)合，藥物與《八的鍵合百分率范圍是91.2—41.1%,它們的鍵合能力的順序為，青霉素vio頭抱哌酮〉頭孢噻肟鈉>苯唑西林>阿莫西林>依諾沙星>諾氟沙星。實施例2:蒽醌類藥物與人血清白蛋白相互作用的研究大黃是我國的四大中藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。我國大黃的產(chǎn)量占世界第一位，并且質(zhì)量最優(yōu)。4600年前我國已開始應(yīng)用大黃。目前已有十九個國家藥典收載了大黃作為法定藥物使用。人黃主要含蒽醌類衍生物，其含量為35%，一部分為游離狀態(tài)，如人黃酸、大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素等；大部分為結(jié)合狀態(tài)，其中屬蒽醌甙類的有大黃酸、葡萄糖甙、大黃酚葡萄糖甙等。具有瀉熱通便、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功能。用于實熱便秘、積滯腹痛、瀉痢不爽，濕熱黃疸、血熱吐衄、目赤、咽腫、腸癰腹痛、癰腫疔瘡、瘀血經(jīng)閉、跌打損傷等病癥。現(xiàn)代臨床可用于治療流行性腦膜炎、大葉性肺炎、急性膽道感染、急性腮腺炎、急性闌尾炎、急性傳染性黃疸型肝炎、急性腸炎、細菌性痢疾、消化道出血、咽喉炎、牙齦膿腫、皮炎、濕疹、淋病、帶狀皰疹等。研究蒽醌類藥物與血清白蛋白的相互作用的有熒光光譜法、紫外光譜法。本發(fā)明應(yīng)用自行設(shè)計并組裝的波長檢測型SPR分析儀，以3—巰基丙酸(MPA)作為固定HSA的連接層，研究了大黃中的主要成分大黃素、大黃酚、及大黃素甲醚與HSA的相互作用，并分別計算了它們的動力學(xué)常數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)及鍵合百分率。方法同實施例l。結(jié)果見表3。表3蔥醌類藥物與HSA的結(jié)合的動力學(xué)常數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)及結(jié)合百分率藥物分子量結(jié)合速率常數(shù)解離速率常數(shù)解離常數(shù)么上a￡n口百分率大黃素270.232息1(^4.09x10"196,4677.43大黃酚244.234.43x101306.7568.69大黃素甲醚284.004.56x1019.71x10-321375.94實施例3:人參皂甙與血清A蛋白相互作用的研究人參，俗稱"棒槌"，屬五加科多年生草本植物，是我國重要特產(chǎn)之一，也是馳名中外的珍貴藥材，被人們稱為"百草之王"，屬東北"三寶"之一。人參根、莖、葉、花及果實富含多種人參皂甙，此外人參根含揮發(fā)油0.12%，莖葉含揮發(fā)油0.13%,花含揮發(fā)油0.29%。人參根的非極性部分含人參炔醇、a—人參萜、卜人參萜以及甾醇化合物。人參還含有賴氨酸、組氨酸、精氨酸等多種氨基酸、維生素、多種有機酸、黃酮類化合物以及糖。經(jīng)過中醫(yī)多年的臨床實驗，人參能夠補血養(yǎng)氣、固津生液、調(diào)節(jié)神經(jīng)、開心明目、益智安神、降低血糖、健胃、利尿等；對T治療久病衰弱的患者，非常有效。主治神經(jīng)衰弱癥、各種神經(jīng)病、植物性神經(jīng)病失調(diào)、性神經(jīng)衰弱、智力減退、貧血、糖尿病、胃病、肝病，以及心血管系統(tǒng)的疾病等。此外，適量久服，還可以使人增加對各種致病因子的抵抗力，對人體并不產(chǎn)生任何副作用和損害。人參的大部分年藥理作用是由人參皂甙來決定的。迄今已分離到人參皂苷單體有40余種，它對人體的一些組織結(jié)構(gòu)有很大的影響可以保護神經(jīng)細胞免受一些有害化合物的侵害；可通過降低神經(jīng)傳導(dǎo)素來調(diào)節(jié)神經(jīng)傳輸；在藥物誘導(dǎo)睡眠方面起著很大的作用；還可通過不同的機理對癌細胞產(chǎn)生影響，抑制癌細胞的生長，或轉(zhuǎn)移癌細胞素。本發(fā)明應(yīng)用自行設(shè)計并組裝的波長檢測型SPR分析儀，以3—巰基丙酸(MPA)作為固定血清白蛋白的連接層，研究了6種人參皂甙單體(Rbl,Rb2,Rb3，Rc，Rd,Re)分別與人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。分別計算了它們的動力學(xué)常數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)及鍵合百分率，并比較了不同人參皂甙單體與血清白蛋白的鍵合能力。方法同實施例l。結(jié)果見表4。表4人參皂武與HSA和BSA結(jié)合的動力學(xué)常數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)及結(jié)合百分率蛋白人參皂甙分子里結(jié)合速率常數(shù)解離速率常數(shù)解離常數(shù)結(jié)合百分率HSARb,11104.74x1012.31xl0-348.71±3.093.19±0.9Rb210782.26xl039.18xl(T240.62±2.994.37±0.7Rb3翻2.35xl022.35xlO-2100.0±18.088.33±2.3Rc10783.13xl029.71xl0-331.00±2.595.58±0.5Rd9463.50xl022.84xl0-281.23±15.089.23±2.0Re9461.14xl032.31xl0-220.32±1.997.10±0.4BSARb,11106.27xl022.84xl0—245.26±2.993.71±0.8Rb2顧1.63xl047.37x10-345.26±3.193.71±1.0Rb310783.33xl026,76xl0-320.31±1.797.10±0.3Rc10789.40x102.91x10-2309.6±26.068.47±4.8Rd9466,59x109.71xlO-3147.3±23.082.05士4.5Re9461.67xl021.36xl(T281.23±13.089.23±1.8權(quán)利要求1.用表面等離子體子共振傳感器研究藥物與生物分子相互作用的方法，其特征在于采用下列步驟(1)采用本課題組研制的波長檢測型SPR分析儀由光源(1)、導(dǎo)光系統(tǒng)(2，3，4，10，11)、傳感元件(5，6)、流通池(7，8，9)、分光檢測系統(tǒng)(12)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成；(2)傳感器的制備采用下列步驟在波長檢測型SPR分析儀中，選用玻璃棱鏡(5)作為傳感器的傳感元件；采用真空鍍膜法，在棱鏡(5)的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜，作為傳感器的傳感膜(6)；(3)在傳感膜(6)底部的流通池(7)中注入巰基丙酸(MPA)溶液，待MPA在金膜表面自組裝完成后，將磷酸鹽(PBS)緩沖溶液注入到流通池(7)中反復(fù)沖洗，以清除傳感器表面的非特異性結(jié)合；(4)待共振波長不再變化后，向流通池(7)中注入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodimidehydrochloride，C8H17N3·HCl，分子量為191.7，簡稱EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide，C4H5NO3，分子量為115.1，簡稱NHS)溶液，觀察SPR光譜隨時間的變化，當(dāng)共振波長基本穩(wěn)定時，用PBS緩沖溶液反復(fù)沖洗傳感器表面至共振波長不再發(fā)生變化；(5)注入血清白蛋白溶液，記錄共振波長隨時間的變化情況，當(dāng)血清白蛋白形成穩(wěn)定的單分子層后，共振波長穩(wěn)定時，此時將PBS緩沖溶液注入到流通池(7)中反復(fù)沖洗至共振波長不再發(fā)生變化；(6)將藥物分別用PBS緩沖溶液稀釋為n個不同濃度，依次注入到流通池(7)，記錄共振波長隨時間的變化，每個樣品監(jiān)測完畢后，均注入PBS緩沖溶液沖洗流通池(7)。(7)通過藥物的濃度[D]、波長變化Δλ、波長變化的響應(yīng)信號Δλmax，，通過以下方程(1)可計算出反映藥物分子與生物分子相互作用的結(jié)合速率常數(shù)ka和解離速率常數(shù)kd。dΔλ/dt＝ka[D](Δλmax-Δλ)-kdΔλ(1)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于MPA自組裝完畢后，引入用以提高傳感器靈敏度的金納米粒子。3.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于MPA自組裝完畢后，引入用以提高傳感器靈敏度的一層或多層除血清白蛋白之外的蛋白，構(gòu)成三明治夾心式傳感器。全文摘要本發(fā)明屬于用波長檢測型表面等離子體子共振傳感器研究藥物與生物分子相互作用的方法領(lǐng)域。采用波長檢測型SPR分析儀，選用玻璃棱鏡作為傳感器的傳感元件，采用真空鍍膜法，在棱鏡的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜，在傳感膜底部的流通池中依次注入巰基丙酸(MPA)溶液，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(簡稱EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(簡稱NHS)溶液，血清白蛋白溶液，當(dāng)共振波長基本穩(wěn)定時，用PBS緩沖溶液反復(fù)沖洗傳感器表面至共振波長不再發(fā)生變化；將藥物分別用PBS緩沖溶液稀釋為n個不同濃度，依次注入到流通池，記錄共振波長隨時間的變化。通過計算，可以得到藥物分子與蛋白分子相互作用的動力學(xué)常數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)以及結(jié)合百分率。文檔編號G01N21/55GK101271066SQ20071005542公開日2008年9月24日申請日期2007年3月19日優(yōu)先權(quán)日2007年3月19日發(fā)明者霞劉,穎孫,宋大千,張寒琦,曹彥波,媛田申請人:吉林大學(xué)