專利名稱：雞γ-干擾素在重組桿狀病毒中的表達(dá)及抗病毒活性的測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及雞，干擾素在重組桿狀病毒中的 表達(dá)及其抗病毒活性的測定 背景技術(shù)干擾素(Interferon, IFN)是在特定的抗原刺激下由細(xì)胞分泌的一類具 有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能等生物活性的糖蛋白，是發(fā)現(xiàn)最早，研 究最多的細(xì)胞因子。根據(jù)IFN的細(xì)胞來源和結(jié)合受體不同，將IFN分為I 型和II型。I型IFN主要有cu卩兩個亞型，分別主要由淋巴細(xì)胞和成弁維 細(xì)胞產(chǎn)生[1]，它們作用于同一受體，可抑制病毒DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成， 活化NK細(xì)胞，促進(jìn)MHCI類分子提呈抗原。II型IFN為Y-干擾素，主要 由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生M，與I型IFN相比有多種免疫學(xué)活性，具有促進(jìn) MHCII類抗原表達(dá)、增強(qiáng)APC細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用、增強(qiáng)輔助T細(xì)胞 和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生等諸多免疫調(diào)節(jié)活性，既可以單獨作為生物制劑 應(yīng)用于疾病的防治，也可作為免疫佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫效果[3~4]。雞Y-千擾 素(Chicken interferon-Y,ChIFN-Y)全基因為495個堿基，編碼164個氨基 酸，前19個氨基酸為信號肽，后145個氨基酸為成熟多肽，含有兩個糖基 化位點[5]，成熟的蛋白質(zhì)為2條145個氨基酸的多肽鏈組成的同源二聚體 [6~7]，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多方面的生物學(xué)活性[8]。 '1995年Digby等首先克隆出ChIFN-Y基因，此后國內(nèi)外學(xué)者利用基因 工程技術(shù)生產(chǎn)重組ChIFN-Y的研究隨之開始興起。迄今為止，ChIFN-Y基因 己在大腸桿菌[，猴腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞,等細(xì)胞中獲得表達(dá)。與原核表達(dá) 系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可以對外源蛋白進(jìn)行多種翻譯后加工和修飾， 表達(dá)重組蛋白更接近天然結(jié)構(gòu)。為此，本研究采用BAC-TO-BAC桿狀病毒 表達(dá)系統(tǒng)(BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System)對ChIFN-y全基 因進(jìn)行了表達(dá)，構(gòu)建含有.ChIFN-Y完整開放閱讀框的重組桿狀病毒，感染 sf9細(xì)胞表達(dá)出具有高效抗病毒活性的rChlFN-Y。我國是養(yǎng)雞大國，每年因 病毒性疾病的爆發(fā)給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大損失，研制出具有高效抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活性的基因工程rChIFN-Y無疑在雞病防治上具有十分重要的意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的采用BAC-TO-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System)對ChlFN-y全基因進(jìn)行了高表達(dá)，構(gòu)建含有 ChIFN-Y完整開放閱讀框的重組桿狀病毒，感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)出具有高效抗 病毒活性的重組ChIFN-Y。 '為了達(dá)到本發(fā)明的目的，采用BAC-TO-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System,由美國Gibco brl公司開發(fā)) 對IFN-Y全基因進(jìn)行了表達(dá)構(gòu)建含有IFN-y完整開放閱讀框的重組桿狀病 毒，感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)IFN-Y，通過間接IFA和間接ELISA方法，證實目 的蛋白在昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)。并采用VSV*GFP-CEF細(xì)胞系統(tǒng)通過感染復(fù) 制抑制試驗測定重組雞IFN-y抗病毒活性，達(dá)到2xl05IU/ml。 發(fā)明效果(1) 目的蛋白表達(dá)的高效性選用昆蟲細(xì)胞優(yōu)勢密碼子對GENEBANK中 提交的雞IFN-Y基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以便目的蛋白在桿狀病毒-昆蟲 細(xì)胞中高效表達(dá)；(2) 目的蛋白獲得的時效性Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中重組病毒的 篩選是在大腸桿菌中進(jìn)行，'利用抗性基因和PCR篩選，并采用桿狀病毒穿 梭載體技術(shù)，如此大大縮短了病毒純化和鑒定的時間，使原來的幾個月時 間縮短到幾周，大大縮短了實驗時間；(3) 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前頗受歡迎的一種表達(dá)系統(tǒng)，它可以進(jìn)行多種 翻譯后修飾作用，包括糖基化、脂肪酸?；被┒艘阴；Ⅳ然┒?酰胺化和信號肽的切割、轉(zhuǎn)運(yùn)，所表達(dá)蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與天然蛋白比 較接近。重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組IFN-Y進(jìn)行了多種翻譯后加 工和修飾作用，產(chǎn)物和天然IFN-Y—樣可以進(jìn)行分泌型表達(dá)，具有較高的生 物學(xué)活性。(4) 生物安全性桿狀病毒具有高度的種屬特異性，僅感染昆蟲，對脊椎 動物無感染性，其表達(dá)產(chǎn)物安全可靠。(5) 制備方便，成本低廉重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞能分泌表達(dá)IFN-Y， 只需經(jīng)過離心滅活等簡單處理程序即可以直接應(yīng)用于畜禽疾病的臨床應(yīng)-用。(6)抗病毒活性檢測方法準(zhǔn)確可靠采用VSV*GFP-CEF細(xì)胞系統(tǒng)通過感 染復(fù)制抑制試驗測定重組IFN-Y抗病毒活性。傳統(tǒng)的干擾素抗病毒活性是利用細(xì)胞病變抑制法測定，通過肉眼或顯微鏡觀察噬斑的數(shù)量而確定其活性單位，本實驗采用的重組￥8￥*0 可以在感染宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋 白，通過觀察熒光強(qiáng)度和數(shù)量，便可確定其感染和復(fù)制情況，因此通過測 定其熒光強(qiáng)度和數(shù)量就可以確定干擾素的活性單位，使得干擾素活性的測 /^B力G，石角不口f《il 。


圖1是IFA檢測重組ChIFN-丫在重組桿狀病毒感染細(xì)胞中的表達(dá)圖.。 圖2是間接elisa檢測重組cmfn-y在重組桿狀病毒感染細(xì)胞上清中 的表達(dá)曲線圖。圖3是重組桿狀病毒表達(dá)ChIFN-y抑制VSV*GFP在CEF細(xì)胞上復(fù)制 表達(dá)4是鼠抗ChIFN-Y免疫血清阻斷重組ChIFN-Y抗病毒活性試驗結(jié)果 圖。
具體實施方式
1材料和方法 1.1材料pMD-18T-ChlFN-y質(zhì)粒(ChIFN-Y基因完整ORF克隆于五coRV位點)、 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)、供體質(zhì)粒pFastBacTMl (Invitrogen) 、 sf9細(xì)胞 系、DH,ac感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)均由本實驗室保存。Grace's培養(yǎng)基、 DMEM培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑(Cdlfectin Reagent)購于Invitrogen公司。熒光 素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉生物技術(shù)公司。辣根過氧化物 酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Sigma公司。引物(ChIFN個f、 CMFN個r; Ml3-48f、 M13-47r)由上海博亞生物有限公司合成。CEF細(xì)胞由本實驗室 制備。表達(dá)綠色熒光蛋白i告基因的重組水皰性口炎病毒VSV*GFP由本 實驗室構(gòu)建、滴定并保存。 1.2鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-y免疫血清的制備以ChIFN-Y-f ( 5，-ATGATCTACO^7UCCACACCGCCTCC-3,)和ChIFN-Y-r (5，-CAA GTCTG7Ta4CATAGCAGTTGCAGC-3')為引物，PCR 擴(kuò)增466bp不包含信號肽基因序列的CMFN-y基因片段?！阠oR I和I雙 酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其克隆于表達(dá)載體pET-30a(+) ￡coR I和I位點， 使ChIFN-Y蛋白表達(dá)框架與His標(biāo)簽融合；轉(zhuǎn)化BL21 ， IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE 檢測融合蛋白表達(dá)，Ni化瓊脂糖柱(Pierce)純化。純化重組ChIFN-Y作為 抗原按10ug/只的劑量腹腔和后肢肌肉注射免疫BALB/c小鼠(首免弗氏完 全佐劑乳化，二免、三免弗氏不完全佐劑乳化，間隔時間三周)，三免后 第三周采血分離血清，測定效價，-20"保存?zhèn)溆谩?1,3表達(dá)rCMFN-Y重組桿狀病毒rBac-ChIFN-Y的構(gòu)建與鑒定￡coR I和1雙酶切pMD-18T-ChlFN-Y，將編碼ChIFN-y完整開放閱 讀框(ORF)克隆至供體質(zhì)粒pFastBacTMl，構(gòu)建PFastBacTMbChIFN-Y(pFast-CMFN-y)。將pFast-ChlFN-y轉(zhuǎn)化DH10Bac，提取質(zhì)粒，PCR篩選 陽性重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-CMFN-Y，制備高純度陽性重組穿梭質(zhì)粒，采用 CdlfectinRReagent (Invitrogen)轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，按文獻(xiàn) [12]進(jìn)行重組病毒擴(kuò)增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因組DNA， M13-48f ( 5，GTTTTCCCAGTCACGAC3， ) 禾卩 M13-47r(5'CAGGAAACAGCTATGAC 3，)為引物PCR驗證ChIFN-y基因在桿狀 病毒中獲得穩(wěn)定重組，重組病毒命名為rBac-ChIFN-Y。擴(kuò)增種毒，進(jìn)行效 價滴定，4。C保存?zhèn)溆谩?1.4間接IFA檢測rChIFN-Y表達(dá)上述rBac-CMFN-Y種毒液按1:10體積感染新鮮制備sf9細(xì)胞，至細(xì)胞 病變達(dá)90%時，收獲細(xì)胞用PBS洗漆重懸后滴于載玻片上，自然陰千95 %乙醇固定，同時設(shè)野生型桿狀病毒感染sf9細(xì)胞為陰'性對照。分別以1:100 稀釋鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-Y免疫血清和相同倍數(shù)稀釋的非免疫小鼠血 清為一抗。PBST (0.05% Tween20)洗滌后加入l:50倍稀釋熒光素(FITC) 標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，作用30min， PBST洗滌后熒光顯微鏡(Leica DMIRES2)觀察結(jié)果。 1.5間接ELISA檢測rChIFN-Y表達(dá). 收取rBac-CMFN-Y感染sf9細(xì)胞上清作為抗原，以Na2C03、 NaHC03(pH=9.6)緩沖液分別做1:5、 1:10、 1:20、 l:40稀釋，按每孔100ul包被 96孔ELISA板(Costar) ， 4"C過夜；10%脫脂乳封閉；以鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-Y免疫血清為一抗，并將其做1:10 1:106系列稀釋；1:2500稀釋 助R標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗；另設(shè)1:5稀釋野生桿狀病毒感染細(xì)胞上清 包被陰性對照；PBST洗感，底物OPD作用15min， 2M硫酸終止反應(yīng)，測 定OD柳nm (Bio-Rad， Benchmark plus)。每個稀釋度至少設(shè)3個平行孔， 取平均值。1.6 rChIFN-y抗病毒活性測定按文獻(xiàn)[13]，用VS，GFP-CEF細(xì)胞系統(tǒng)測定rChIFN-Y抗病毒活性，以 2xl0Vells/孔密度將CEF鋪于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入2xl0 2xl06不同倍數(shù)稀釋rBac-CMFN-Y感染sf9細(xì)胞的培養(yǎng)上清(rChlFN^)和2><10 2><106不同倍數(shù)稀釋野生桿狀病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清，37。C作用過夜，并 設(shè)空白對照。100pfo/孔VSV《GFP感染細(xì)胞，lh后換完全培養(yǎng)液，24h后熒 光顯微鏡觀察結(jié)果，以熒光亮度為對照組50%的最高稀釋度為一個抗病毒 單位(IU)。1.7 rChIFN-Y抗病毒活性阻斷試驗以2xl0^cdls/孔密度將CEF細(xì)胞鋪于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，取100IU 的rChIFN-Y與不同倍數(shù)稀釋的鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-Y免疫血清室溫作 用lh，同時設(shè)非免疫鼠血清與lOOIU的rChIFN-y作用對照組，將混合液體 作用CEF細(xì)胞過夜，100pfu/孔￥8￥*0 感染細(xì)胞，lh后換完全培養(yǎng)液， 24h后熒光顯微鏡觀察結(jié)果。 2結(jié)果2.1重組桿狀病毒rBac-ChIFN-Y的構(gòu)建與鑒定:為構(gòu)建表達(dá)ChIFN-Y基因的重組桿狀病毒，首先將ChIFN-Y完整ORF 克隆至供體質(zhì)粒pFastBacT"l ，構(gòu)建pFast-CMFN-y， ￡coR I和1雙酶切 后獲得約4760bp和550bp兩個片段，與理論預(yù)期值相符。將pFast-ChIFN-Y 轉(zhuǎn)化至DH1QBae ，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定獲得重組穿梭質(zhì).粒 rBacmid-ChIFN，進(jìn)一步提取重組質(zhì)粒rBacmid-CMFN-Y轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞救獲 重組桿狀病毒rBac-ChIFN-y，提取病毒基因組DNA，以M13-48f和M13-47r 為引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出特異的2.8kb的產(chǎn)物，表明ChIFN-Y基因在 桿狀病毒中獲得重組。 2.2間接IFA檢測r ChIFN-Y表達(dá)分別以rBac-ChIFN-Y和野生桿狀病毒感染sf9細(xì)胞，至細(xì)胞病變達(dá)90%時收集細(xì)胞制備涂片，分別以1:100鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-Y免疫血清和相同倍數(shù)稀釋的非免疫鼠血清為一抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測。結(jié)果鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-Y免疫血清檢測rBac-ChIFN-Y感染sf9細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng) 熒光信號，并且熒光主要集中在細(xì)胞膜上(圖1A)，而1:100稀釋非免疫 鼠血清則熒光信號陰性(圖1B);以野生型桿狀病毒感染sf9細(xì)胞懸液制 備涂片，1:100倍稀釋鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-Y免疫血清熒光信號也為陰 性(圖1C)，表明rChlFN-Y在sf9細(xì)胞中獲得表達(dá)。 2.3間接ELISA檢測rChIFN-y在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)收取rBac-CMFN-Y感染sf9細(xì)胞上清作為抗原，分別以1:5、 1:10、 1:20 和1:40進(jìn)行稀釋，按每孔.100ul包被96孔ELISA板，以10倍系列稀釋的 鼠抗原核表達(dá)重組CMFN，免疫血清為一抗；1:2500倍稀釋HRP標(biāo)記山羊 抗鼠IgG為二抗；底物OPD作用15min， 2M硫酸終止反應(yīng)后，測定OD490nm。 結(jié)果rBac-CMFN-Y感染s 細(xì)胞培養(yǎng)上清40倍稀釋與5倍稀釋包被ELISA板進(jìn)行檢測時OD49。nm相近，并且血清1000倍稀釋后P/N值仍大于2.0 (圖2)，表明rCMFN-Y在sf9.細(xì)胞中獲得表達(dá)。2.4 rCWFN-Y抗病毒活性測定利用VSV*GFP-CEF細(xì)胞系統(tǒng)測定rCWFN-Y抗病毒活性，以不同倍數(shù) 稀釋rBac-CMFN-Y感染s 細(xì)胞的培養(yǎng)上清(rChIFN-Y)和不同倍數(shù)稀釋野 生桿狀病毒感染sf9細(xì)胞的培養(yǎng)上清分別作用CEF細(xì)胞過夜，感染 VSV*GFP， 24h后熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，未加rCMFN-Y的對照組出 現(xiàn)大量熒光(圖3D)， VSV*GFP在CEF細(xì)胞中大量復(fù)制。同樣2xl()2和2xl03 倍稀釋的野生桿狀病毒感染sf9細(xì)胞的培養(yǎng)上清組也出現(xiàn)大量熒光(圖3F， 3G)，不能抑制VSVfGFP的復(fù)制，但是20倍稀釋時可以非特異性的部分 抑制VSV*GFP在CEF細(xì)胞中的復(fù)制。2xl0M咅稀釋rChIFN-y可以完全抑 制VSVfGFP的復(fù)制，無熒光出現(xiàn)(圖3A)， 2xl()5和2xl06倍稀釋rChlFN-Y 可部分抑制VSV*GFP的復(fù)制，2><105倍稀釋孔的熒光亮度約為對照組的一 半(圖3B， 3C)，測定rCWFN-Y活性為2xl()5lU/ml。2.5 rChIFN-Y抗病毒活性阻斷試驗利用VSV*GFP-CEF細(xì)胞系統(tǒng)間接證實rChlFN-y抗病毒活性，用不同 倍數(shù)稀釋的鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-Y免疫血清與100IU的rChIFN-丫室溫 下結(jié)合lh，作用CEF細(xì)胞過夜，感染VSV申GFP， 24h后熒光顯微鏡觀察。結(jié)果表明rChIFN-Y的抗病毒活性可以有效地被鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-Y 免疫血清阻斷。完全阻斷100IU的VSV*GFP感染性的有效稀釋倍數(shù)為128， 非免疫鼠血清則完全不能阻斷rCMFN-Y的抗病毒活性(圖4)。 3討論Y-干擾素具有抗病毒、一抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性，人Y-干擾素在 臨床疾病的防治中早有應(yīng)用，動物？千擾素作為生物制劑或疫苗佐劑也具 有較好的應(yīng)用前景，許多國家已經(jīng)將動物細(xì)胞因子的開發(fā)利用作為研究重 點。y-干擾素基因在正常'rt況下處于抑制狀態(tài)，只有在某些剌激因子的刺激 下才能表達(dá)，產(chǎn)量低、純化困難、成本比較高，難以大量制備，隨著基因 工程技術(shù)的迅速發(fā)展，可以利用該技術(shù)大量制備基因工程Y-干擾素。 本研究構(gòu)建了含有ChIFN-Y完整ORF的重組桿狀病毒，感染sf9細(xì)胞 有效表達(dá)出rChIFN-Y。以鼠抗原核表達(dá)重組ChIFNi免疫血清為一抗，間 接IFA和間接ELISA證實rChIFN-Y在sf9細(xì)胞中獲得良好表達(dá)，進(jìn)行間接 IFA檢測ChIFN-Y表達(dá)時，發(fā)現(xiàn)熒光主要集中在細(xì)胞膜上，胞漿中熒光相對 較少。同時利用rBac-ChIFN-Y感染sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清為包被抗原進(jìn)行間接 ELISA試驗的OD49。nm明顯高于以rBac-CMFN-Y感染sf9細(xì)胞裂解物，結(jié)果 表明，細(xì)胞培養(yǎng)上清含有大量rChIFN-Y， rChIFN-Y在信號肽的引導(dǎo)下被分 泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，為以后rChIFN-Y的提純提供便利。傳統(tǒng)的IFN抗病毒活性是利用細(xì)胞病變抑制法測定，通過噬斑的數(shù)量 而確定其活性單位，本研究采用的重組VSVtGFP可以在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制， 并表達(dá)綠色熒光蛋白，通過觀察熒光強(qiáng)度和數(shù)量確定其感染和復(fù)制情況， 即可測定rCWFN-Y的抗病毒活性。因此，使用VSV+GFP作為攻擊病毒， 在CEF細(xì)胞上測定rCMFN-Y抗病毒活性時，采用測定熒光強(qiáng)度或數(shù)量代替 傳統(tǒng)的噬斑數(shù)量計數(shù)而確定其活性單位，使得IFN抗病毒活性的測定更加 準(zhǔn)確和簡便。采用VSV*GFP在CEF的感染復(fù)制抑制試驗初步研究了 rChIFN-y抗病毒活性，并證實rChIFN-Y具有高效抗病毒活性，rBac-ChIFN-Y 感染sf9細(xì)胞上清抗病毒效價可達(dá)2xl05IU/ml，而相同倍數(shù)稀釋的野生桿狀 病毒感染細(xì)胞上清不具有抗病毒活性，僅在20倍稀釋時能非特異性的部分 抑制VSV*GFP在CEF中的復(fù)制。Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)采用桿狀病毒穿梭載體技術(shù)大大縮短了 病毒純化和鑒定的時間，使原來的幾個月時間縮短到幾周。重組桿狀病毒感染sf9細(xì)胞表達(dá)的rCMFN-Y進(jìn)行了多種翻譯后修飾，接近于天然ChIFN-Y， 具有較高的生物學(xué)活性，而且桿狀病毒具有高度的種屬特異性，僅感染昆 蟲，對脊椎動物無感染性，其表達(dá)產(chǎn)物安全可靠，經(jīng)過簡單處理即可以直 接應(yīng)用于畜禽疾病的臨床治療。 參考文獻(xiàn)[1〗卡恩.分子病毒學(xué)原理[M].北京科學(xué)出版社，2006: 177-178.[2] Williams J G, Jurkovich G J, Maier R V. 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權(quán)利要求
1. 雞γ-干擾素在重組桿狀病毒中的表達(dá)，其特征在于將GeneBank中提交的雞γ-干擾素基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化并人工合成得到pMD-18T-ChIFN-γ，EcoR I和Sal I雙酶切pMD-18T-ChIFN-γ，將編碼ChIFN-γ基因DNA克隆至pFastBacTM1，構(gòu)成pFastBacTM1-ChIFN-γ；將pFastBacTM1-ChIFN-γ轉(zhuǎn)化DH10Bac，提取質(zhì)粒，PCR篩選陽性重組桿狀病毒基因組克隆rBacmid-ChIFN-γ，制備陽性重組基因組克隆DNA，采用CellfectinRReagent(Invitrogen)轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，按文獻(xiàn)[12]介紹的方法進(jìn)行重組病毒嗜斑純化和病毒擴(kuò)增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因組DNA，M13-48f(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)和M13-47r(5’CAGGAAACAGCTATGAC3’)為引物PCR驗證ChIFN-γ基因在純化病毒中獲得穩(wěn)定重組，重組病毒命名為rBac-ChIFN-γ；上述rBac-ChIFN-γ種毒液按1∶10體積比感染新鮮制備sf9細(xì)胞，至細(xì)胞病變達(dá)90％時，收獲細(xì)胞用PBS洗滌重懸后滴于載玻片上，自然陰干后95％乙醇固定，同時設(shè)野生型桿狀病毒感染細(xì)胞為陰性對照。分別以1∶100稀釋鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-γ免疫血清和相同倍數(shù)稀釋的非免疫小鼠血清為一抗；PBST(0.05％Tween20)洗滌后加入1∶50倍稀釋熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，作用30min，PBST洗滌后熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的雞Y-干擾素在重組桿狀病毒中的表達(dá)，其特 征在于其抗病毒活性的測定采用VSV*GFP- CEF細(xì)胞系統(tǒng)測定重組 ChIFN-Y抗病毒活性，以2xlO、ells/孔密度將CEF鋪于24孔板，待細(xì)胞貼 壁后，加入2xlO 2xl()6不同稀釋倍數(shù)的重組ChlFNi (rBac-ChIFN-Y感染 sf9細(xì)胞的培養(yǎng)上清)，37TM乍用過夜。100pfu/孔￥8￥*0 感染細(xì)胞，l小 時后換完全培養(yǎng)液，24小時后熒光顯微鏡觀察結(jié)果，以熒光亮度為對照孔 50。/^的最高稀釋度為一個單位(IU)。
全文摘要
本發(fā)明公開了密碼子優(yōu)化后的雞γ-干擾素基因序列、雞γ-干擾素在重組桿狀病毒中的表達(dá)及其抗病毒活性的測定，構(gòu)建了表達(dá)雞γ-干擾素的重組桿狀病毒rBac-ChIFN-γ，采用鼠抗原核表達(dá)重組ChIFN-γ免疫血清作為一抗進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)及間接ELISA檢測，表明ChIFN-γ在重組桿狀病毒rBac-ChIFN-γ感染的sf9昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)?？共《净钚栽囼烇@示，結(jié)果表明重組ChIFN-γ在重組桿狀病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆蟲細(xì)胞中獲得良好表達(dá)，并具有高效抗病毒活性。
文檔編號G01N33/569GK101221176SQ20071005644
公開日2008年7月16日 申請日期2007年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月12日
發(fā)明者李守軍, 李旭東, 步志高, 莉 趙, 鮑恩東 申請人:天津瑞普生物技術(shù)集團(tuán)有限公司