專利名稱：一種適用于己烯雌酚殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒，具體地說，涉及一種適用于己烯雌酚(DES)殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
人工激素殘留常規(guī)的分析主要是應(yīng)用氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)等儀器在實驗室進(jìn)行。應(yīng)用這些理化分析技術(shù)對環(huán)境、生物、食品等樣品中痕量己烯雌酚殘留進(jìn)行分析，不僅儀器化程度要求較高，并且需要經(jīng)過繁復(fù)的分離、提取、凈化、衍生等前處理過程，無法實現(xiàn)大樣本的同時檢測，對操作人員專業(yè)要求較高，前處理過程需要使用大量的有機(jī)溶劑，又造成了新的環(huán)境污染。與理化分析技術(shù)相比，酶聯(lián)免疫吸附分析一般能達(dá)到更高的靈敏度。隨著待檢樣品、特別是要求現(xiàn)場快速檢測樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的分析手段難以適應(yīng)要求，因此，迫切需要開發(fā)和應(yīng)用高效率、快速酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，用于己烯雌酚殘留的批量、快速檢測。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種特異性的己烯雌酚單克隆抗體的制備方法。
(二)技術(shù)方案為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種己烯雌酚殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，該試劑盒包括包被了己烯雌酚抗原的酶標(biāo)板、海綿支架、濃縮洗滌液、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品、己烯雌酚單克隆抗體、酶標(biāo)二抗、顯色液、反應(yīng)終止液。
其中，包被了己烯雌酚抗原的酶標(biāo)板的制備過程中，所用的包被原是己烯雌酚的半抗原正丁酸己烯雌酚單醚(DES-CP)與卵清蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物，所用包被液是0.05M pH 9.6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含1％明膠的上述包被液。
其中，己烯雌酚單克隆抗體的制備過程中所用的免疫原是半抗原正丁酸己烯雌酚單醚與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)復(fù)合物。
己烯雌酚單克隆抗體的制備方法是用上述免疫原免疫Balb/c雌性小鼠，再將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤融合，經(jīng)過多次亞克隆，篩選到能穩(wěn)定分泌己烯雌酚單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞已于2007年3月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.1966。采用體內(nèi)誘生腹水法，挑選經(jīng)產(chǎn)Balb/c小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油，向預(yù)處理后的小鼠腹腔注射陽性克隆雜交瘤細(xì)胞，待7-10天后，小鼠腹部明顯增大，刺穿腹腔，采集腹水。將腹水離心，棄脂肪層和細(xì)胞層，收集中間的澄清層，-20℃保存?zhèn)溆?。?5％的飽和硫酸銨鹽析法粗提細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水，最后用DE-52陰離子交換層析法進(jìn)一步純化，獲得純化的己烯雌酚單克隆抗體。
其中，酶標(biāo)二抗是是辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體。
其中，濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入氯化鈉7～9g、磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2～4g、氯化鉀3～6g、吐溫-200.5～3mL。濃縮洗滌液的濃度是正常使用時的50倍。
其中，顯色液包括A液和B液，A液配方為每1000mL水中加入過氧化脲1g，10.3g檸檬酸，35.8g Na2HPO4·12H2O，吐溫-20 100μL，pH5；B液配方為每1000mL蒸餾水中加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g檸檬酸，pH2.4。
本發(fā)明試劑盒的檢測分析原理是酶標(biāo)板上的每個孔均包被有相同量的抗原，加入待測己烯雌酚樣品和己烯雌酚單克隆抗體后，固相包被抗原和待測己烯雌酚相互競爭與抗體反應(yīng)，由于每個孔中的固相抗原和加入的抗體含量均一致，所以當(dāng)待測的己烯雌酚濃度高時，則被結(jié)合在固相抗原上的抗體少，加入的酶標(biāo)二抗與被固定抗體結(jié)合量少，用洗滌液洗滌后加入底物液(即顯色液A液)和顯色液(即B液)，顯色反應(yīng)淺，用酶標(biāo)儀檢測的OD值低，表明抑制率高；反之，當(dāng)待測己烯雌酚濃度低時，則所測的OD值高，抑制率低。根據(jù)用已知的己烯雌酚濃度檢測所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推算出待測己烯雌酚的濃度。
(三)有益效果本發(fā)明提供的己烯雌酚殘留檢測試劑盒采用了高特異性的己烯雌酚單克隆抗體，能準(zhǔn)確靈敏地檢測水、肉類中己烯雌酚殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法，而且本發(fā)明試劑保存時間長，無放射性污染。本發(fā)明對解決大批量樣品的己烯雌酚殘留現(xiàn)場監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。


附圖為己烯雌酚的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。
具體實施例方式
以下是實施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。
實施例1試劑盒操作及結(jié)果計算待測樣品經(jīng)前處理后，用PBST定容備用。拆開真空包裝袋并取出酶標(biāo)板，在室溫下平衡5分鐘備用。配制0ng/mL，1ng/mL，2.5ng/mL，5ng/mL，12.5ng/mL，25ng/mL，50ng/mL，100ng/mL的己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)液，加入50μL標(biāo)樣或處理好的樣品到各孔中，標(biāo)樣和樣品做4個重復(fù)，加入50μL稀釋的抗體，37℃孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗5次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍干；加入按1∶1000稀釋好的酶標(biāo)羊抗鼠二抗100μL，37℃孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用PBST洗板5次，拍干；取A液和B液等體積混勻，每孔加100μL，在暗處顯色10～15分鐘，每孔加入50μl的終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測定各孔在波長為450nm處的OD值。
將含0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值減去含最大濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值定為B0，其余孔經(jīng)同樣方法校正后的OD值定為B；以B/B0值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的log值為橫坐標(biāo)，繪制己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。根據(jù)曲線的回歸方程可以求出對應(yīng)樣品的濃度，也可以求出己烯雌酚抑制中濃度IC50(B/B0＝50％)及最小檢測限IC20(B/B0＝80％)。曲線回歸方程為Y＝-0.4787X+0.9766，R2＝0.9698計算抑制中濃度IC50＝9.8ng/mL，最低檢測限IC20＝2.3ng/mL。
實施例2半抗原正丁酸己烯雌酚單醚(DES-CP)的合成酚鉀鹽的制備在100mL三口瓶中加入0.96g(0.0036mol)DES，15mL甲醇溶解，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入0.44g(0.0079mol)KOH，加熱至40-45℃，攪拌20min，TLC監(jiān)測。反應(yīng)完畢，減壓蒸除甲醇，得到鉀鹽。
中間體的制備鉀鹽在室溫下加10mL二甲基甲酰胺(DMF)，升溫至60-80℃，滴加γ-溴丁酸乙酯的15mL DMF溶液，約10min滴完，在此溫度下反應(yīng)2h，TLC監(jiān)測。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，倒入50g冰水中，用稀HCl調(diào)至pH7，50mL乙醚分兩次萃取水相，合并有機(jī)相，再用100mL水分兩次洗有機(jī)相，干燥，脫溶，得1.3g粗產(chǎn)物，用柱色譜分離得純品單脂。
目標(biāo)化合物的生成在反應(yīng)容器中加入1.15g單脂，含0.24gNaOH的5％NaOH水溶液，再加入15mL乙醇，加熱至60℃反應(yīng)三小時，TLC監(jiān)測。反應(yīng)完畢，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下蒸除乙醇，水溶液中出現(xiàn)的固體即為目標(biāo)物(DES-CP)，過濾，干燥，得白色固體，產(chǎn)率68％。
實施例3己烯雌酚單克隆抗體制備以混合酸酐法將半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)，將80μg免疫原溶于80uL無菌生理鹽水中，和80μL完全弗氏佐劑混合，充分乳化后Balb/c雌性小鼠腹部皮下多點注射，以后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，換用不完全弗氏佐劑與免疫原混合，免疫部位為頸背部皮下，從第三次免疫開始，每次免疫后一周從小鼠眼眶采血檢測血清效價?？偣裁庖?次，最后一次免疫后一周將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤融合，再經(jīng)過4次亞克隆，篩選到能穩(wěn)定分泌己烯雌酚單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。通過體外培養(yǎng)法，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)離心后去除細(xì)胞碎片，上清液-20℃保存?zhèn)溆?。體內(nèi)誘生腹水法，挑選經(jīng)產(chǎn)Balb/c小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油0.5mL/只，將不完全培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度調(diào)至106/mL，每只預(yù)處理后的小鼠腹腔注射1mL陽性克隆雜交瘤細(xì)胞，待7-10天后，小鼠腹部明顯增大，刺穿腹腔，采集腹水。將腹水離心，棄脂肪層和細(xì)胞層，收集中間的澄清層，-20℃保存?zhèn)溆?。?5％的飽和硫酸銨鹽析法粗提細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水，最后用DE-52陰離子交換層析法進(jìn)一步純化，獲得較純的已烯雌酚單克隆抗體。
實施例4已烯雌酚酶殘留分析酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒的組建本例中，試劑盒包含如下部分(1)包被了己烯雌酚抗原的酶標(biāo)板
(2)海綿支架(3)1mg/mL己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(4)己烯雌酚單克隆抗體(5)辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體(6)濃縮洗滌液配方為氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鈉3g、氯化鉀5g、吐溫-20 2mL、蒸餾水20mL。
(7)顯色液A液配方過氧化脲1g，10.3g檸檬酸，35.8g Na2HPO4·12H2O，吐溫-20 100μL，蒸餾水1000mL，pH5。
(8)顯色液B液配方四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g檸檬酸，蒸餾水1000mL，pH2.4。
實施例5保存期實驗將試劑盒放置于4℃保存，分別取0、10、20、30、60、90、120、150和180d的試劑盒，以1.25μg/mL抗原工作濃度和0.1μg/mL抗體工作濃度為工作濃度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測以測定其檢測效果。保存期測定結(jié)果如下表表1試劑盒保存實驗結(jié)果Tab 1 Preservation Test Results of ELISA Kit

從以上結(jié)果可以看出，IC50變化不大，試劑盒在4℃下至少可保存6個月以上。
實施例6試劑盒特異性實驗選擇己烯雌酚的結(jié)構(gòu)類似物和雌激素己烷雌酚、雙烯雌酚、17β-雌二醇、孕酮、雌酮作為待測物，測得各種物質(zhì)的抑制中濃度(IC50)，再用下式計算抗體對這些物質(zhì)的交叉反應(yīng)性；交叉反應(yīng)率愈小，則抗體對己烯雌酚的特異性愈強(qiáng)，反之則抗體的特異性差。
交叉反應(yīng)(CR％)＝IC50(己烯雌酚)/IC50(供試物)×100％。
實驗測定結(jié)果見表2，采用間接ELISA法，單克隆抗體與己烯雌酚結(jié)構(gòu)類似物存在一定的交叉反應(yīng)，如檢測樣本中己烷雌酚和雙烯雌酚濃度不是很高的話，不會對檢測造成干擾，而且己烷雌酚和雙烯雌酚都是不太常用的人工雌性激素，在動物較短的生長周期內(nèi)不會有機(jī)會全部接觸這些激素。因此可保證對樣品中己烯雌酚殘留測定結(jié)果的可靠性。
表2交叉反應(yīng)Tab 2 Cross Reactivities of Indirect ELIS A Kit

實施例7添加回收實驗水樣取適量己烯雌酚標(biāo)樣添加到樣品中，設(shè)置5μg/kg、10μg/kg、25μg/kg三個濃度，每個濃度設(shè)4個重復(fù)，進(jìn)行測定。測定結(jié)果與HPLC結(jié)果比較。
ELISA檢測樣品的前處理調(diào)節(jié)pH值和鹽離子濃度后進(jìn)行ELISA分析。鹽離子的調(diào)節(jié)的具體方法是在1體積10倍濃度的PBS加入到9體積的水樣中。
肉樣取適量己烯雌酚標(biāo)樣添加到樣品中，設(shè)置80μg/kg和120μg/kg兩個濃度，每個濃度設(shè)4個重復(fù)，進(jìn)行測定。測定結(jié)果與HPLC結(jié)果比較。
ELISA檢測樣品的前處理取兩等分絞碎的肉樣(5克/份)，充分研磨，每份加入80μg/kg和120μg/kg甲醇定容到10mL，提取3次，合并上清，60℃水浴，氮?dú)獯蹈?，加?.5mL甲醇，然后再加PBST定容到50mL后直接用于ELISA測定。
試劑盒的檢測結(jié)果見表3，水樣回收率為77.0～83.6％，變異系數(shù)5.9～8.5％，肉樣樣品回收率為71.31～77.6％，變異系數(shù)7.4～9.8％。試劑盒的回收率在允許范圍內(nèi)，符合農(nóng)藥殘留分析對精確度的要求。
表3試劑盒測定結(jié)果與HPLC測定結(jié)果的比較Tab 3 Comparison of Results between Indirect ELISA and HPLC

權(quán)利要求
1.一種己烯雌酚單克隆抗體，其特征在于，用正丁酸己烯雌酚單醚與牛血清白蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物作為免疫原來制備所述抗體。
2.一種適用于己烯雌酚殘留分析的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于包含如權(quán)利要求1所述的己烯雌酚單克隆抗體、包被了己烯雌酚抗原的酶標(biāo)板、海綿支架、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)二抗、濃縮洗滌液、顯色液和反應(yīng)終止液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，所述己烯雌酚包被抗原為正丁酸己烯雌酚單醚與卵清蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，酶標(biāo)二抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入氯化鈉7～9g、磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2～4g、氯化鉀3～6g、吐溫-20 0.5～3mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，顯色液包括A液和B液，A液配方為每1000mL水中加入過氧化脲1g，10.3g檸檬酸，35.8g Na2HPO4·12H2O，吐溫-20 100μL，pH5；B液配方為每1000mL蒸餾水中加入四甲基聯(lián)苯胺700mg，10.3g檸檬酸，pH2.4。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，終止液為2mol/L的硫酸液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于己烯雌酚殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其特征在于包括包被有己烯雌酚抗原的酶標(biāo)板、海綿支架、濃縮洗滌液(PBST)、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品、己烯雌酚單克隆抗體、酶標(biāo)二抗、顯色液和反應(yīng)終止液。檢測過程中，酶標(biāo)板孔壁上吸附的包被抗原和待測己烯雌酚相互競爭與抗體反應(yīng)，競爭結(jié)果通過顯色反應(yīng)出來。檢測已知濃度的己烯雌酚并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推算出待測己烯雌酚的濃度。本發(fā)明的優(yōu)點是能準(zhǔn)確靈敏地檢測水、肉類中己烯雌酚殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法，而且本發(fā)明試劑保存時間長，無放射性污染。
文檔編號G01N33/577GK101059511SQ20071009783
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月18日
發(fā)明者王文君, 李季, 許艇 申請人:李季