專(zhuān)利名稱(chēng)：糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法及檢測(cè)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種血液中糖化血紅蛋白的測(cè)定技術(shù)，尤其涉及一種糖化血紅蛋 白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法及檢測(cè)裝置。
背景技術(shù)：
糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是一種新陳代謝異常的疾病，其發(fā)病率和死亡 率正呈上升趨勢(shì)，成為僅次于心血管疾病和胖瘤的危害人類(lèi)身體健康的主要疾病 之一。健康人群能將碳水化合物消化和分解為葡萄糖，并進(jìn)入到血液中被細(xì)胞吸 收作為生長(zhǎng)和能量的原料。在葡萄糖由血液進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中，需要胰島素的幫 助。胰島素是一種由胰臟分泌的激素，它能令葡萄糖通過(guò)細(xì)胞膜，使其轉(zhuǎn)化為能 量或其他物質(zhì)作為儲(chǔ)存之用。健康人進(jìn)食時(shí)，胰臟能自動(dòng)地分泌適合分量的胰島 素把葡萄糖由血液帶到細(xì)胞中，但由于糖尿病病人不能分泌正常分量的胰島素或 細(xì)胞不能正常地對(duì)胰島素作出反應(yīng)而不能正常地使葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞，使葡萄糖在 血液中積聚，并從尿液中流走，因此糖尿病患者會(huì)失去大量能量來(lái)源，并導(dǎo)致一 系列并發(fā)癥。血紅蛋白(Hemoglobin)是脊推動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)的呼吸蛋白，其分子是由兩條a 和兩條p多肽鏈構(gòu)成的四聚體，每個(gè)肽鏈上各結(jié)合有一個(gè)血紅素分子，且相互接 近，形成近似球形的血紅蛋白分子，是血液中運(yùn)輸氧氣的主要物質(zhì)，在生物體內(nèi) 起到傳輸氧氣、分解&02、傳遞電子等與氧和能量代謝有關(guān)的重要活動(dòng)，在一切 生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。糖化血紅蛋白(HbAlc)是血液中葡萄糖分子與血紅 蛋白分子的fi-鏈末端氨基發(fā)生非酶反應(yīng)的產(chǎn)物，且反應(yīng)量隨著血液中葡萄糖濃度 的增加而增加。即血液中葡萄糖濃度越大，則紅血球中HbAlc的含量就越大，因 此紅血球中HbAlc含量高低反映了血液中葡萄糖的水平。由于人體內(nèi)紅血球的壽 命大約為100-120天，因此臨床上測(cè)定HbAlc含量可確定過(guò)去2-3個(gè)月內(nèi)糖尿病 患者血糖的控制水平。保持正常或接近正常的血糖水平，有助于糖尿病患者防止 由于血糖的升高引發(fā)的失明、腎、神經(jīng)以及心腦血管并發(fā)癥，因此快速、靈敏、 準(zhǔn)確可靠地檢測(cè)血液中糖化血紅蛋白的含量對(duì)糖尿病患者血糖水平的中長(zhǎng)期控制 以及糖尿病的早期預(yù)警具有重要的實(shí)踐意義。
糖化血紅蛋白測(cè)定作為醫(yī)用診斷起源于上世紀(jì)七十年代末八十年代初期，主 要測(cè)定血液中葡萄糖分子在紅血細(xì)胞上的附著能力，作為糖尿病患者在過(guò)去2-3 個(gè)月內(nèi)血糖水平控制好壞的評(píng)價(jià)。通常HbAlc的含量用HbAlc占血液中血紅蛋 白總量的百分比來(lái)表示，臨床上HbAlc含量的參考值為5-20%,并認(rèn)為4-6%是 正常的。美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)建議糖尿病患者最好每三個(gè)月做一次糖化血紅蛋白的測(cè) 定，并使其保持在7%以下的水平以避免多種并發(fā)癥的發(fā)生。目前臨床上用于 HbAlc含量測(cè)定的方法主要有免疫、離子交換色譜、硼親和色譜以及毛細(xì)管電泳 等。這些方法在光度定量測(cè)定HbAlc含量之前均包含有一個(gè)分離步驟，例如基于 HbAlc與Hb表面電荷差別的離子交換色譜和電泳分離以4于HbAlc與Hb結(jié) 構(gòu)差別的免疫和硼親和色譜方法，檢測(cè)過(guò)程需要多次洗脫和專(zhuān)用儀器檢測(cè)，檢測(cè) 周期長(zhǎng)，操作步驟繁瑣，儀器和試劑相當(dāng)昂貴，因而在糖尿病的早期預(yù)警、糖尿 病患者血糖水平的中長(zhǎng)期控制方面的應(yīng)用受到限制。發(fā)展新的檢測(cè)技術(shù)，降低檢 測(cè)成本，簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟，加快檢測(cè)速度，提高檢測(cè)手段的靈敏度、準(zhǔn)確性，是亟 待解決的問(wèn)題。發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明針對(duì)上迷技術(shù)問(wèn)題，提供一種降低檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化檢測(cè)步 驟，加快檢測(cè)速度，提高檢測(cè)手段的靈敏度、準(zhǔn)確性的血液中糖化血紅蛋白含量 的電化學(xué)檢測(cè)方法。技術(shù)方案 一種血液中糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法，將全血樣品用結(jié)合液稀釋30-70倍后，過(guò)糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器，向糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器的全血樣 品流出液中加入電活性小分子，并用化學(xué)修飾電極測(cè)定柱后溶液的電化學(xué)響應(yīng)， 得到血紅蛋白的濃度；用洗脫液對(duì)糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液的電 化學(xué)響應(yīng)，得到糖化血紅蛋白的濃度，計(jì)算得到樣品中糖化血紅蛋白的含量。糖 化血紅蛋白識(shí)別器以植物凝集素ConA或氨基苯硼酸修飾的玻璃小球、硅烷雜合 溶膠或瓊脂糖凝膠介質(zhì)的識(shí)別器。結(jié)合液為pH值7.0 ~ 8.5的Heps緩沖溶液?；?學(xué)修飾電極為半胱胺酸修飾金電極或鉑與玻碳修飾電極。電活性小分子為鐵氰化 鉀或過(guò)氧化氫。洗脫液為pH值4.5，含0.2%triton的O.lmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉 緩沖溶液。該裝置為由加樣控制裝置、分離裝置和測(cè)試裝置組成，其中加樣控制 裝置與分離裝置通過(guò)輸送管連接，分離裝置與測(cè)試裝置連接。加樣控制裝置為由 微機(jī)控制的蠕動(dòng)泵。分離裝置為糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器。測(cè)試裝置為化學(xué)修飾電極。有益效果本發(fā)明利用植物凝集素或硼酸基團(tuán)與糖化血紅蛋白的特定相互作 用，制備微分離柱，并結(jié)合電化學(xué)分析簡(jiǎn)便、易行、價(jià)廉的特點(diǎn)，建立了一種血 液中糖化血紅蛋白濃度的分離與檢測(cè)方法。該方法較現(xiàn)有的糖化血紅蛋白分析方 法，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1 )利用固定化植物凝集素或硼酸基團(tuán)對(duì)糖化血紅蛋白的識(shí)別作用，實(shí)現(xiàn)糖 化血紅蛋白與血紅蛋白的分離，并用電化學(xué)方法分別檢測(cè)其含量。分離測(cè)試過(guò)程 不需使用大型儀器如光語(yǔ)檢測(cè)或離子色譜檢測(cè)等，避免使用Drabkin試劑、TMB 等高毒性物質(zhì)，具有^艮好的應(yīng)用前景。(2) 該方法表現(xiàn)出很好的精確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，制備方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)成 4^支現(xiàn)有的測(cè)定方法，要低得多。(3) 電化學(xué)儀器操作簡(jiǎn)便靈活、成本較低、分析速度快，適用于臨床快速檢 測(cè)及開(kāi)發(fā)便攜式檢測(cè)儀器。本發(fā)明通過(guò)在微玻璃球、雜合硅凝膠、殼聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠上嫁接植物 凝集素或硼酸基團(tuán)，并填充在玻璃管內(nèi)作為糖化血紅蛋白微分離柱，利用固定化 植物凝集素或硼酸基團(tuán)對(duì)糖化血紅蛋白的識(shí)別作用，實(shí)現(xiàn)糖化血紅蛋白與血紅蛋 白的分離，該分離柱制作簡(jiǎn)單，且具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物兼容性。將它與 上述修飾電極結(jié)合，利用電活性小分子與還原態(tài)血紅蛋白分子發(fā)生氧化-還原反 應(yīng)，并根據(jù)生成的電活性物質(zhì)進(jìn)行安培檢測(cè)，建立用于血液中血紅蛋白、糖化血 紅蛋白含量的測(cè)定方法，具有高靈敏度和選擇性，具有很好的應(yīng)用前景。由于電 化學(xué)檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、成本較低、分析速度快，可望實(shí)現(xiàn)臨床糖化血紅蛋白的快速 測(cè)定以及將糖化血紅蛋白分離洗脫后進(jìn)行快速測(cè)定。


圖1為糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法的流程圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1: 糖化血紅蛋白識(shí)別器的制備(1) 粒徑微5-10微米的玻璃小球先用0.1mol/L氫氧化鈉溶液活化1小時(shí)，清 水洗凈后加入到10mmol/L三曱氧基-溶液中浸泡2小時(shí)，即得三甲氧基硅烷修飾 玻璃球，并在玻璃球表面引入-CHO這一活性基團(tuán)。洗滌離心后，將修飾過(guò)的玻 璃小球分別在10mmol/L才直物凝集素ConA(pH值7.4)或#^苯鄰酸溶液中浸泡5 小時(shí)，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，即得植物凝集素ConA或M苯硼 酸修飾糖化血紅蛋白識(shí)別介質(zhì)，填入玻璃管，固化后即得糖化血紅蛋白分離柱。(2) 按Si: H20摩爾比1: 4比例取一定量四乙氧^i^圭烷或四乙氧基硅烷與占硅 摩爾總量5,10,20,30,40%的三乙氧基-3-硅烷混合物置于定量水中，加入Si及水總
摩爾量10%的lmol/L醋酸，超聲水解3小時(shí)并在室溫下靜置2小時(shí)后，按體積 比1: 1比例加入10 mmol/L才直物凝集素ConA(pH值7.4)或#^苯硼酸溶液，充 分?jǐn)嚢杌旌虾螅钊氩ＡЧ?，固化后即得糖化血紅蛋白分離柱。 (3)在瓊脂糖凝膠中加入摩爾比1: 8的CDI， 40(:冰箱中反應(yīng)48小時(shí)，從而在 瓊脂糖凝a面嫁接上活性氨基，再加入與CDI等量的戊二醛交聯(lián)劑及tt苯硼 酸4QC水箱中搖振反應(yīng)24小時(shí)，即得硼瓊脂糖凝膠，填入玻璃管，固化后即得 糖化血紅蛋白分離柱。 血液中糖化血紅蛋白的分離檢測(cè)(l)分離條件的優(yōu)化，包括以下五個(gè)方面a) 分離介質(zhì)選擇植物凝集素或氨基苯硼酸在不同載體上的嫁接密度不同， 因此其分離效率也不相同。將上述三種識(shí)別介質(zhì)分別填入2.5x80 mm玻璃管中， 固化24小時(shí)后，用0.1M pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液洗滌至柱內(nèi)介質(zhì)填充體積不變。 用糖化血紅蛋白含量為10%的血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液循環(huán)過(guò)柱30分鐘，光譜4全測(cè)柱后 液中糖化血紅蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)用硼瓊脂糖凝膠填充的柱子分離效率最高，經(jīng)30 分鐘過(guò)柱后幾乎檢測(cè)不到糖化血紅蛋白的存在。b) 柱內(nèi)保留時(shí)間選擇含糖化血紅蛋白的血紅蛋白溶液在柱內(nèi)停留時(shí)間不 同，糖化血紅蛋白的分離效率也不同，用糖化血紅蛋白含量為10%的血紅蛋白標(biāo) 準(zhǔn)液分別在柱內(nèi)保留2、 3、 5、 10、 20、 30分鐘，光譜檢測(cè)柱后液中糖化血紅蛋 白的含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)2分鐘保留后有2%糖化血紅蛋白存在，經(jīng)3分鐘保留后有1.2 %糖化血紅蛋白存在，經(jīng)5分鐘保留后有0.8%糖化血紅蛋白存在，而經(jīng)10分鐘 保留后幾乎檢測(cè)不到糖化血紅蛋白的存在。因此保留時(shí)間以2- IO分鐘為宜。c) 柱內(nèi)徑與柱長(zhǎng)的選擇柱內(nèi)徑的大小影響到樣品在柱內(nèi)的流速，這對(duì)流動(dòng) 體系尤為重要，因此柱內(nèi)徑的選擇主要看泵速，以樣品能在柱內(nèi)勻速流動(dòng)為佳， 我們選用的蠕動(dòng)泵流速為12轉(zhuǎn)/分鐘，即0.6 mL/分鐘，選擇2.5 mm內(nèi)徑管最為 匹配。而柱的分離效率與柱長(zhǎng)有關(guān)，我們選擇2.5x25,40,60,80,100 mm的玻璃管 填充介質(zhì)，注射20微升含糖化血紅蛋白10%的血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，保留5分鐘， 發(fā)現(xiàn)40 mm柱長(zhǎng)已能完全分離糖化血紅蛋白，我們選擇80 mm柱長(zhǎng)完全可以分 離可能出現(xiàn)的更高濃度糖化血紅蛋白。d) 結(jié)合液選擇硼瓊脂糖凝膠與糖化血紅蛋白之間的特定相互作用與結(jié)合液 種類(lèi)及pH值有關(guān)，常用的結(jié)合溶液其pH值應(yīng)大于7.0,這是因?yàn)榕鹚峄鶊F(tuán)在pH 值大于7.0時(shí)具有與糖化蛋白質(zhì)最大的結(jié)合能力，將含糖化血紅蛋白10%的血紅 蛋白樣品在含蛋白酸2%的pH值分別為7.0,7.5，8.0,8.5，9.0的磷酸鹽緩沖溶液或 Tris或Heps緩沖溶液中稀釋50倍，并在上述硼瓊脂糖凝膠柱內(nèi)保留10分鐘，光 譜檢測(cè)分離效果，發(fā)現(xiàn)使用Heps緩沖溶液分離效果最好，且pH值越高，分離越
完全，當(dāng)pH值大于8.0時(shí)在柱后液中已檢測(cè)不到糖化血紅蛋白，因此我們選擇 最佳結(jié)合液為pH值8.5的Heps緩沖溶液。e)洗脫液選擇常用的洗脫液有中等酸性的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH值 4.0)溶液、山梨醇水溶液(pH值6.8)和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH值 4.5 )。我們發(fā)現(xiàn)使用含0.2%triton的0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 值4.5)洗脫效果最佳， 一次洗脫率可達(dá)98%以上，二次洗脫時(shí)基本險(xiǎn)測(cè)不到糖 化血紅蛋白的存在，因此選擇含0.2%triton的O.lmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖 溶液(pH值4.5 )為洗脫溶液，并由此說(shuō)明我們的柱子可重復(fù)使用。(2) 血紅蛋白的柱后檢測(cè)，a) 半胱胺酸"f奮飾金電極制備金盤(pán)電極(金表面直徑為1 mm)先在毛皮上用 氧化鋁漿拋光至鏡面，用二次蒸餾水超聲洗滌干凈后在含5 mmol/L半胱胺酸的 磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.0)中浸泡5小時(shí)，二次蒸餾水超聲洗滌即可，其表面 覆蓋度大于1.6xl(T1Gmol/cm-2。b) 鉑與玻碳電極修飾鉑盤(pán)電極(金表面直徑為1 mm)與玻碳電極(玻碳表 面直徑為3 mm)先在毛皮上用氧化鋁漿拋光至鏡面，用二次蒸餾水超聲洗滌干 凈，氮?dú)獯蹈珊笤谄渖腺N一醋酸纖維素薄膜并用o形圈固定^f寺用。c) 電活性小分子選擇由于血液中大約99%以上的血紅蛋白以還原態(tài)形式存 在，電活性小分子如鐵氰化鐘及過(guò)氧化氫等能擴(kuò)散至血紅蛋白電活性中心處并與 其發(fā)生交換電子的氧化-還原反應(yīng)生成還原態(tài)電化學(xué)小分子，并進(jìn)一步擴(kuò)散到電 極上發(fā)生得電子的還原反應(yīng)，從而給出還原電流，該還原電流的大小與血紅蛋白 的濃度成正比，因此可用于血液中血紅蛋白的測(cè)定。由于過(guò)氧化氫易分解，因此 我們選擇鐵氰化鉀作為電活性小分子，其加入量控制在大約10倍的血紅蛋白濃 度。d) 測(cè)量最佳電位選擇在O.lmol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液中加入等量已知 濃度的血紅蛋白如120 g/L及150 g/L,加入足量的鐵氰化鉀使其濃度為30 mmol/L， 改變不同電位，分別用修飾金電極、鉑或玻碳電極測(cè)量還原電流的值，尋找測(cè)定最 佳電位，以獲得最優(yōu)的檢測(cè)范圍和靈敏度。e) 緩沖溶液的pH值血紅蛋白在人體正常pH條件在才具有最佳活性，因此 配制血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液及測(cè)定用緩沖溶液應(yīng)盡量選用中性或微酸性溶液。(3) 測(cè)量系統(tǒng)糖化血紅蛋白測(cè)量包括分離與測(cè)試兩部分，可組合成一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)如附圖1， 其中包含有蠕動(dòng)泵，分離柱和檢測(cè)芯片，其流速和加樣量由微機(jī)控制，分離柱管 徑與流速要匹配。(4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及校正
a) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制不同修飾電極上的響應(yīng)大小不同，因此不同電極在同一血 紅蛋白濃度給出的電流信號(hào)并不相同，用同一電極測(cè)定不同濃度血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶 液的氧化電流，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最優(yōu)的線性范圍。b) 糖化血紅蛋白含量測(cè)疋在測(cè)量系統(tǒng)中加入糖化血紅蛋白樣品，測(cè)定柱后 液的電流響應(yīng)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對(duì)應(yīng)的血紅蛋白濃度。在分離柱中加入洗脫液， 用修飾電極測(cè)定其電流響應(yīng)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對(duì)應(yīng)的血紅蛋白濃度，作為糖化血 紅蛋白的濃度，以糖化血紅蛋白的摩爾量除以糖化血紅蛋白與血紅蛋白的總摩爾 量得到樣品中糖化血紅蛋白的含量。c) 標(biāo)準(zhǔn)曲線校正使用修飾電極對(duì)血液樣品中的血紅蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)，從 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出血紅蛋白濃度，通過(guò)與臨床檢測(cè)數(shù)值及標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定的數(shù)值 比較，得出相關(guān)系數(shù)并對(duì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，提高檢測(cè)的正確性與準(zhǔn)確 性。實(shí)施例2:一種糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法，將全血樣品用結(jié)合液稀釋30 - 70倍 后，過(guò)糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器，向糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器的全血樣品流出液中加入電活性 小分子，并用化學(xué)修飾電極測(cè)定柱后溶液的電化學(xué)響應(yīng)，得到血紅蛋白的濃度 a;用洗脫液對(duì)糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液的電化學(xué)響應(yīng)，得到糖 化血紅蛋白的濃度b，計(jì)算b/(b+a)得到樣品中糖化血紅蛋白的含量。糖化血紅蛋 白識(shí)別器以植物凝集素ConA或M苯硼酸修飾的玻璃小球、硅烷雜合溶膠或瓊 脂糖凝膠介質(zhì)的識(shí)別器。結(jié)合液為pH值7.0 ~ 8.5的Heps緩沖溶液?；瘜W(xué)修飾電 極為半胱胺酸修飾金電極或鉑與玻碳修飾電極。電活性小分子為鐵氰化鉀或過(guò)氧 化氫。洗脫液為pH值4.5,含0.2%triton的0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶 液。 一種實(shí)現(xiàn)糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法的裝置，該裝置為由加樣控制 裝置、分離裝置和測(cè)試裝置組成，其中加樣控制裝置與分離裝置通過(guò)輸送管連 接，分離裝置出樣口與測(cè)試裝置進(jìn)樣口連接。加樣控制裝置為由微機(jī)控制的蠕動(dòng) 泵。分離裝置為糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器。測(cè)試裝置為化學(xué)修飾電極。以下以半胱胺酸修飾金電極測(cè)定血液中糖化血紅蛋白為例 1.半胱胺酸修飾金電極制備金盤(pán)電極(金表面直徑為1 mm)先在毛皮上用氧化鋁漿拋光至鏡面，用二 次蒸餾水超聲洗滌干凈后在含5 mmol/L半胱胺酸的磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.0) 中浸泡5小時(shí)，二次蒸餾水超聲洗滌即可，其表面覆蓋度大于1.6xl(T1Q mol/cm-2.2. 測(cè)試條件的優(yōu)化a) 測(cè)量電位選擇在0.1mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液中加入等量已知濃度 的血紅蛋白如120 g/L及150 g/L,加入足量的鐵氰化鉀使其濃度為30 mmol/L,改變 不同電位,測(cè)量還原電流的值，尋找測(cè)定最佳電位，以獲得最優(yōu)的檢測(cè)范圍和靈敏 度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，施加電位在0.30V時(shí)有最大的電流響應(yīng)。b) 緩沖溶液的pH值血紅蛋白在人體正常pH條件在才具有最佳活性，實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，在稀釋液pH 6.5-7.4范圍內(nèi)電極給出最大響應(yīng)，因此我們選用pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液作為稀釋液。3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制用半胱胺酸修飾金電極，測(cè)定同一血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.30 V的還原電流， 驗(yàn)證電極的重復(fù)性。測(cè)定不同血紅蛋白濃度在0.30 V的還原電流響應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該修飾具有很好的重復(fù)性，對(duì)同一血紅蛋白濃度的測(cè)量誤差 小于7 % ，且在血紅蛋白濃度50 g/L ~ 400 g/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。4. 血液樣品中血紅蛋白含量檢測(cè)在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，將全血樣品用pH值8.5的H鄰s結(jié)合液稀釋50倍， 過(guò)2.5 80 cm硼瓊脂糖凝膠分離柱，測(cè)定柱后溶液的電化學(xué)響應(yīng)，根據(jù)電流值從 標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出血紅蛋白的濃度；用pH值4.5含0.2%triton的0.lmol/L杵檬酸-檸檬酸鈉溶液洗脫，測(cè)定洗脫液的電化學(xué)響應(yīng)，4艮據(jù)電流值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出糖 化血紅蛋白的濃度；計(jì)算求出樣品中糖化血紅蛋白的含量，并與標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定值 比較校正。利用本發(fā)明測(cè)量的100個(gè)樣品的血紅蛋白值與標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比，測(cè)定的 結(jié)果具有良好的一致性。
權(quán)利要求
1.一種糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于將全血樣品用結(jié)合液稀釋30-70倍后，過(guò)糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器，向糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器的全血樣品流出液中加入電活性小分子，并用化學(xué)修飾電極測(cè)定柱后溶液的電化學(xué)響應(yīng)，得到血紅蛋白的濃度a；用洗脫液對(duì)糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液的電化學(xué)響應(yīng)，得到糖化血紅蛋白的濃度b，計(jì)算b/(b+a)得到樣品中糖化血紅蛋白的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在 于所述的糖化血紅蛋白識(shí)別器以植物凝集素ConA或氨基苯硼酸修飾的 玻璃小球、硅烷雜合溶膠或瓊脂糖凝膠介質(zhì)的識(shí)別器。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在 于所述的結(jié)合液為pH值7.0 ~ 8.5的Heps緩沖溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在 于所述的化學(xué)修飾電極為半胱胺酸修飾金電極或鉑與玻碳修飾電極。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所迷的糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在 于所述的電活性小分子為鐵氰化鉀或過(guò)氧化氫。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在 于所述的洗脫液為pH值4.5,含0.2%triton的0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸 鈉緩沖溶液。
7. —種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法的裝 置，其特征在于該裝置為由加樣控制裝置、分離裝置和測(cè)試裝置組成， 其中加樣控制裝置與分離裝置通過(guò)輸送管連接，分離裝置出樣口與測(cè)試 裝置進(jìn)樣口連接。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法的裝置，其 特征在于所述加樣控制裝置為由微機(jī)控制的蠕動(dòng)泵。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法的裝置，其 特征在于所述分離裝置為糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法的裝置，其 特征在于所述測(cè)試裝置為化學(xué)修飾電極。
全文摘要
一種血液中糖化血紅蛋白含量的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于將全血樣品用結(jié)合液稀釋30-70倍后，過(guò)糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器，向糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器的全血樣品流出液中加入電活性小分子，并用化學(xué)修飾電極測(cè)定柱后溶液的電化學(xué)響應(yīng)，得到血紅蛋白的濃度；用洗脫液對(duì)糖化蛋白質(zhì)識(shí)別器進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液的電化學(xué)響應(yīng)，得到糖化血紅蛋白的濃度，計(jì)算得到樣品中糖化血紅蛋白的含量。由于電化學(xué)檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、成本較低、分析速度快，可望實(shí)現(xiàn)臨床糖化血紅蛋白的快速測(cè)定以及將糖化血紅蛋白分離洗脫后進(jìn)行快速測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N33/72GK101158691SQ200710135510
公開(kāi)日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者劉松琴, 吳亞峰 申請(qǐng)人:東南大學(xué)