專利名稱：鉀(離子)診斷/測定試劑盒及鉀(離子)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鉀(離子)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腎小球疾病、腎功能衰弱、糖尿病酮癥中毒、腎上腺皮質(zhì)功能減退等。當(dāng)
血鉀高達7.5 mmol/L或以上時病人將出現(xiàn)心律失常，應(yīng)考慮確定適當(dāng)?shù)闹委煼桨?。血清鉀超過10 mmol/L時，即可發(fā)生心室纖顫，心臟停搏而死亡。高鉀使心臟停跳于舒張期。
目前鉀測定常用的方法有同位素稀釋質(zhì)譜法、中子活化法、火焰光度計
法、化學(xué)測定法、離子選擇電極法、原子分光光度法、酶動力學(xué)法。
火焰光度法1950年開始使用并一直沿用至今的火焰光度法檢測血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，是一種發(fā)射光譜分析法。測定方法分為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法和外標(biāo)準(zhǔn)法兩種。外標(biāo)準(zhǔn)法操作誤差較大， 一般不采用?，F(xiàn)在主要使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法，即標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進相同濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素鋰或銫進行測定。操作時，將含鋰的溶液作為稀釋液，同時測定K、 Na和Li的濃度，以標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)液的Na/Li與K/Li比值，計算Na、 K濃度。由于血清稀釋倍數(shù)大，血清蛋白質(zhì)粘性的影響幾乎可忽略不計。
化學(xué)測定法主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚，均為離子載體進行測定，由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧原子有未共用電子對可與金屬離子結(jié)合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結(jié)合不同直徑的金屬離子，從而可達到測出離子濃度的目的。測定血清K， 一般采用普通冠醚陰離子染料進行比色定量。
離子選擇電極法ISE法是采用靈敏的特定專用電極，在專用儀器上進行
血清和尿等體液的K+、 Na+的測定，因標(biāo)本用量少，快速準(zhǔn)確，幾乎有取代其他方法的趨勢。其儀器測定原理是離子選擇電極與參比電極組合浸泡在待測
標(biāo)本溶液中，進行檢測。目前己有的電極種類為①玻璃膜電極，感應(yīng)材料
為玻璃薄膜的有pH電極、K+電極和Na+電極；②固相膜電極，由難溶性金屬物
質(zhì)加壓成型，以固體膜或單日膜作為感應(yīng)膜的電極有cr電極和F—電極；③液
態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙稀為感應(yīng)膜的Ca2+電極；④用纈氨霉素膜制成的IC電極。上述電極均有一定的壽命，因為電極使用一段時間就會自動老化，有效期長短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于檢測血清K+、 Na+，操作繁雜，誤差較大，不及火焰光度法簡便。
鉀測定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法及中子活化法。WIO推薦的方法是火焰光度計法。目前離子選擇電極法應(yīng)用較為普遍，但是電極成本昂貴。
酶測定法和火焰光度計法或離子選擇電極法均有較好的一致性，且抗干擾性強，穩(wěn)定性好，彌補了生化分析儀不能同時測定鉀鈉的不足。有較好的分析性能，易于自動化，在臨床化學(xué)分析中必定取代火焰光度計法成為常規(guī)分析項目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鉀(離子)濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的鉀(離子)診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行鉀(離子)濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明鉀(離子)濃度測定方法原理如下
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶化+ 腺苷三磷酸+
丙酮酸
丙酮酸+輔酶八+氧 丙酮酸氧化酶 過氧化氫+ 二氧化碳+
乙酰輔酶A
二氧化碳+還原型輔酶甲酸脫氫酶 甲酸+輔酶
這種方法應(yīng)用需要鉀離子激活的丙酮酸激酶(pyruvic kinase; EC2.7丄40)酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、甲酸脫氫酶(Formatedehydrogenase; EC 1.2丄2; EC 1.2.1.43)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測/速率比色法。在鉀(離子)的激活下，丙酮酸激酶酶解磷酸烯醇式丙酮酸反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算鉀(離子)的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鉀(離子)診斷/測定試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸激酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/L甲酸脫氫酶 10000 U/L
腺苷二磷酸 3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸 3mmol/L輔酶A 4 mmol/L
本發(fā)明的鉀(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、
輔酶A。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶。還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷二磷酸、磷
酸烯醇式丙酮酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶。還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷二磷酸、磷
酸烯醇式丙酮酸、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鉀(離子)濃度的方法，其還原
型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100 mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
還原型輔酶0.25 mmol/L
丙酮酸激酶6000 U/L
丙酮酸氧化酶8000 U/L
甲酸脫氫酶10000U/L
腺苷二磷酸3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸3 mmol/L
輔酶A4 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘 左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大
實施例二
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸 輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 丙酮酸激酶 丙酮酸氧化酶 甲酸脫氫酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試
10Ommol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 3 mmol/L
3 mmol/L
4 mmol/L
函mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000 U/L劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時 間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大小。
實施例三
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑
還原型輔酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸 輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶 甲酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
丙酮酸激酶
50 mmol/L 0.25 mmol/L 3 mmol/L
3 mmol/L
4 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L
畫mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用,
10測定鉀(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時
間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測鉀(離子)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達 到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.017;吸光度 時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可 達10mmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過士 6%;試劑測試的 精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.016 ± 0.008 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣 應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀(離子)濃度測定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 <u>丙酮酸激酶/K</u><u>+</u> 腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+輔酶A+氧 <u>丙酮酸氧化酶</u> 過氧化氫+二氧化碳+ 乙酰輔酶A二氧化碳+還原型輔酶 <u>甲酸脫氫酶</u> 甲酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出鉀(離子)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑還原型輔酶丙酮酸激酶丙酮酸氧化酶甲酸脫氫酶腺苷二磷酸磷酸烯醇式丙酮酸輔酶A試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A 組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫 氫酶組成。還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷 二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A 組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶組成；試 劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶組成。還原型輔酶、丙酮酸激酶、 丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A在 試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鉀(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、甲酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464300SQ20071019180
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司