專利名稱：：顆粒體蛋白-上皮素前體(gep)抗體用于檢測和抑制肝細(xì)胞癌(hcc)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及顆粒體蛋白-上皮素前體(GEP)及影響GEP在肝細(xì)胞癌(HCC)中的表達(dá)、翻譯和生物活性的方法。本發(fā)明的另一方面涉及GEP的檢測方法，其是診斷和治療HCC的可能方法。本文以括注阿拉伯?dāng)?shù)字提到了若干出版物。這些參考文獻(xiàn)的完整51用可見于權(quán)利要求書之前的說明書結(jié)尾處。這些出版物的全部內(nèi)容通過引用加入到本申請中。
背景技術(shù)：
：肝癌是全世界第五大常見癌癥并且是第三大癌癥殺手，每年大約有50萬新病例和幾乎同樣多的死亡人數(shù)(1,2)。肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)類型。在亞洲發(fā)生HCC的主要風(fēng)險(xiǎn)因素是乙型肝炎病毒(HBV)感染，而在西方國家和曰本丙型肝炎病毒(HCV)感染是主要的風(fēng)險(xiǎn)因素?；加懈渭?xì)胞癌的HCC患者的預(yù)后一般較差，中位存活時(shí)間不足l年，因?yàn)槎鄶?shù)肝細(xì)胞癌是不可切除的，不適于新的治療形式，化療有效率低。手術(shù)切除(如部分肝切除術(shù)或肝移植)對于肝細(xì)胞癌是有療效的治療(3-5)。然而，僅20%的患者適合手術(shù)，因?yàn)榇蟛糠只颊咴诟蝺?nèi)和/或肝外轉(zhuǎn)移的晚期才#皮診斷出來。在治療性手術(shù)之后常見復(fù)發(fā)，第一年的復(fù)發(fā)率為約50%(6)。因此，HCC的早期檢測是改善存活所必需的。開發(fā)可在無癥狀患者中檢測出早期癌癥的血清學(xué)診斷檢驗(yàn)應(yīng)是一個重要努力方向。目前，血清曱胎蛋白(AFP)已廣泛用于HCC診斷(7)。然而，用于共存肝病患者檢測HCC的血清AFP截取值還沒有達(dá)成一致，所述值的范圍為10-500ng/ml(8-10)。血清AFP檢驗(yàn)在以常規(guī)的500ng/ml較高截取點(diǎn)使用時(shí)，在共存肝病患者中檢測HCC的存在情況方面顯示出約50%的靈敏度和90%以上的特異性(9)。在以10-19ng/ml之間的較低截取值使用時(shí)，血清AFP檢驗(yàn)的靈敏度為45%-100%，特異性為70%-95%(10)。因此，為了更好地診斷HCC，迫切需要鑒定具有更好的靈敏度和特異性的新生物標(biāo)記。顆粒體蛋白-上皮素前體(GEP)(核苷酸序列SEQIDNo.1和氨基酸序列SEQIDNo.2)是自分泌生長因子，屬于非典型性生長因子家族。在我們較早前的cDNA微陣列研究中報(bào)道了HCC組織中的GEPmRNA水平明顯升高(ll)。本發(fā)明人已在不同患者中進(jìn)一步證實(shí)了該觀察結(jié)果，并證實(shí)GEP蛋白在HCC組織中被上調(diào)，但在它們的鄰接非腫瘤肝組織(肝炎和硬化肝)和正常肝中沒有被上調(diào)(12)。在我們的較早前的研究中，功能性研究表明，GEP控制HCC細(xì)胞增殖速率、侵襲和轉(zhuǎn)移(12)。由于GEP在HCC中特有地過表達(dá)且是重要的生長因子，所以本發(fā)明人推測，GEP在HCC腫瘤組織中的上調(diào)應(yīng)當(dāng)還導(dǎo)致HCC患者的血清GEP蛋白水平升高。就本發(fā)明人了解，不存在檢測血清GEP的測定試劑盒，因此，迄今尚未研究血清GEP水平是否具有診斷意義。GEP在HCC中的顯著升高及其增強(qiáng)癌細(xì)胞增殖的功能使GEP成為引人注目的抗體治療標(biāo)耙。實(shí)際上，耙向癌癥治療相比于化療藥物的優(yōu)勢在于限制了非特異性毒性并且提高了療效，化療藥物的主要缺點(diǎn)是缺乏選擇性、具有嚴(yán)重的副作用、療效有限和出現(xiàn)/選擇產(chǎn)生耐藥性(13)。隨著雜交瘤技術(shù)在人源化和鼠-人嵌合單克隆抗體生產(chǎn)方面的進(jìn)步，可使用單克隆抗體實(shí)現(xiàn)靶向癌癥治療(14)。單克隆抗體(mAb)治療已在臨床癌癥治療中^皮證實(shí)是有效的，例如用于B細(xì)胞淋巴瘤的抗-CD20mAB(利妥昔單抗(Rituximab))(15)、用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的抗-Her2neumAB(赫賽汀(Herceptin))(16-17)以及用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的抗-EGFR和VEGF(18,19)。然而，開發(fā)包括抗體療法在內(nèi)的用于HCC的靶向治療法是有限的，因此，迫切需要新的治療標(biāo)靶。迄今為止還沒有寺艮道血清GEP在任何人類癌癥中的診斷意義。在本研究中，本發(fā)明人已測定了HCC患者、HBV慢性攜帶者和健康個體中的血清GEP水平，以利用GEP作為HCC的新診斷標(biāo)記。而且，本發(fā)明人還研究了新近分離的抗-GEPmAb對小鼠異種移植模型的人HCC的抗腫瘤效力。已證實(shí)抗-GEPmAb在體外和體內(nèi)均能夠延遲所建立的腫瘤的生長。這些結(jié)果表明了抗-GEPmAb在HCC治療中的潛在適用性。發(fā)明概述本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，相比于肝細(xì)胞癌(HCC)患者的周圍正常肝組織和l定康個體的正常肝組織，一種蛋白質(zhì)即顆粒體蛋白-上皮素前體(GEP)在HCC中豐富而且獨(dú)特地表達(dá)。本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供檢測血清中的GEP基因產(chǎn)物的藥劑和方法。本發(fā)明的又一個目標(biāo)是提供用于診斷目的的靈敏檢測HCC患者血清中的GEP基因產(chǎn)物的藥劑和方法。本發(fā)明的又一個目標(biāo)是提供用特異性GEP肽生產(chǎn)GEP單克隆和多克隆抗體的方法。本發(fā)明的又一個目標(biāo)是提供生產(chǎn)抗-GEP單克隆抗體(例如A23)的方法。本發(fā)明的再一個目標(biāo)是利用抗-GEP單克隆抗體(例如A23)抑制HCC發(fā)展。本發(fā)明進(jìn)一步提供測定HCC患者、乙型肝炎攜帶者和健康個體的GEP水平的方法和策略。為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)并且按照本發(fā)明的目的，正如本文具體表達(dá)并適當(dāng)描述的一樣，本發(fā)明提供針對其中表現(xiàn)出GEP表達(dá)改變或GEP生物活性改變的HCC的藥劑、組合物和治療。本文使用的術(shù)語"改變的表達(dá)或者表達(dá)改變"是指相比于相應(yīng)的正常細(xì)胞或周圍的正常外周細(xì)胞，GEP的表達(dá)增加或過表達(dá)或GEP蛋白上調(diào)。術(shù)語"表達(dá)改變"還指表達(dá)不受調(diào)節(jié)，或變成組成型的而不一定升高。本文使用的術(shù)語"改變的生物活性，，是指GEP活性的改變，其可能是或不是GEP表達(dá)依賴性的。術(shù)語"改變的生物活性"還指這樣的情況其中GEP所賦予的任何生物功能(例如增殖、分化、轉(zhuǎn)移)的改變導(dǎo)致與改變的GEP表達(dá)相同或等同的狀況。本文使用的術(shù)語"GEP"是指在HCC患者的HCC細(xì)胞提取物或正常肝細(xì)胞提取物或HCC患者細(xì)胞外液體、慢性乙型肝炎攜帶者的肝細(xì)胞提取物或細(xì)胞外液體、健康個體的肝細(xì)胞提取物或細(xì)胞外液體中的顆粒體蛋白-上皮素前體。本文使用的術(shù)語"中和"是指使用抗-GEP抗體抵消GEP的活性或作用。本文描述的"免疫組織化學(xué)，，是指使用免疫組織化學(xué)方法檢測所述HCC或正常肝或鄰接的正常肝組織樣品中的GEP存在情況。本文描述的術(shù)語"免疫組織化學(xué)，，還指使用兔或小鼠抗人GEP多克隆抗體和綴合辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗以及二氨基苯(DAB)和過氧化氫的顯色檢測方法。本文描述的"蛋白質(zhì)印跡分析，，是指這樣的方法通過凝膠電泳由HCC樣品分離提取蛋白；將分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到膜上；用兔或小鼠抗人GEP抗體和綴合辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗檢測GEP;并用化學(xué)發(fā)光技術(shù)顯色檢測GEP。本文描述的"接受者操作特征(ROC)曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve)"用于檢驗(yàn)在其范圍內(nèi)的GEP性能特征。曲線下面積(AUC)用作整體測試性能的指標(biāo)，低于0.5的參比AUC表示沒有區(qū)別能力。本文描述的所有數(shù)據(jù)都通過SPSS(用于Windows的11.0版，SPSSInc.,Chicago,IL)分析。適宜的情況下使用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較分類變量。Studentt-檢驗(yàn)用于2組連續(xù)變量之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。通過Pearson關(guān)聯(lián)分析相關(guān)性。尸<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有顯著性。本申請給出的具體實(shí)施例提供了優(yōu)選實(shí)施方案的描述，尤其是抗-GEP抗體的檢測用途以及中和抗-GEP抗體用于在體外和體內(nèi)抑制HCC的GEP活性的用途。附圖簡述圖l顯示了蛋白質(zhì)印跡分析的GEP抗體特異性。(A)單克隆GEP抗體A23特異性識別來自HepG2(G2)和Hep3B(3B)的細(xì)胞裂解物的、約88kDa的GEP-糖基化形式以及重組GEP-全長(FL)。相比于其鄰接的非腫瘤肝組織(N)，GEP在腫瘤(T)中纟皮顯著上調(diào)(患者289和291)。(B)來自肝細(xì)胞癌細(xì)胞裂解物Hep3B(3B)、HepG2(G2)和Huh7(H7)的免疫沉淀。泳道l、3和5使用單克隆GEP抗體A23免疫沉淀。泳道2、4和6是使用小鼠IgG的模擬免疫沉淀。兔多克隆GEP抗體用于檢測。泳道7、8和9是來自相同肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物。A23免疫沉淀復(fù)合物的約88kDa的GEP證實(shí)了單克隆和多克隆抗體的特異性。(C)在泳道l、2和3中分別為培養(yǎng)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞Hep3B(3B)、HepG2(G2)和Huh7(H7)的上清液中的分泌性GEP的檢測情況。泳道4、5和6為來自相同肝細(xì)胞癌細(xì)月包的細(xì)胞裂解物。圖2顯示了GEP在人肝組織中的定位。(A)在瘤性肝細(xì)胞中檢測到GEP表達(dá)(以褐色染色顯現(xiàn))，但在胂瘤組分中的其它細(xì)胞類型中沒有檢測到(400x放大倍數(shù))。(B)鄰接腫瘤的非腫瘤肝組織(400x放大倍數(shù))揭示在非瘤性肝細(xì)胞中沒有GEP信號。圖3顯示了在72名健康供體、38名慢性乙型肝炎患者和107名HCC患者中的血清GEP濃度。圖4顯示關(guān)于血清GEP的接受者操作特征曲線分析(粗實(shí)線)。將"靈敏度"(真陽性系數(shù))對"1-特異性，，(假陽性系數(shù))作圖。圖5顯示，采用A23的體外治療以劑量依賴性方式抑制細(xì)胞生長。經(jīng)MTT測定檢測細(xì)胞增殖。A)HepG2細(xì)胞和B)Hep3B細(xì)胞與PBS(對照)O)、A23-50pg/mlO)或A23-100|Lig/ml(*)在P/oFBS存在下溫育5天。相比于PBS對照，差異于+P〈0.05水平時(shí)是顯著的。C)通過直接ELISA檢測到的A23(+)或PBS對照(-)處理后的HepG2和Hep3B培養(yǎng)上清液中的GEP濃度。D)Hep3B和HepG2的A23處理導(dǎo)致MAPK磷酸化降低。使HCC細(xì)胞系血清饑餓24小時(shí)，然后用A23-100pg/ml(泳道l-HepG2和泳道3-Hep3B)或PBS(對照)(泳道2-HepG2和泳道4-Hep3B)處理72小時(shí)。用兔多克隆GEP、抗石岸酸化MAPK和抗MAPK抗體免疫印跡細(xì)胞裂解物(IO嗎)，抗-j3肌動蛋白用作蛋白加樣和轉(zhuǎn)移的對照。圖6顯示了Hep3B腫瘤異種移才直物在^:小鼠中的生長抑制。以每周2次的方案用A23治療所建立的Hep3B腫瘤治療的劑量依賴性作用。以A23-50ngO)或A23-100jxg()腹膜內(nèi)注射A23抗體，PBS用作對照(固)。與PBS對照相比，差異于《P〈0.05和"P〈0.005的水平時(shí)是顯著的。圖7顯示了于A23治療后31天的小鼠血清譜。A)A23濃度。B)GEP濃度。圖8顯示了A)于A23治療后31天的200x放大倍數(shù)的Hep3B異種移植物的組織學(xué)檢查結(jié)果。B)于A23治療后31天的200x放大倍數(shù)的非胂瘤肝臟的組織學(xué)檢查結(jié)果。圖9為A23在Hep3B胂瘤中的增殖和凋亡作用的分^t斤。A)通過Ki-67染色評價(jià)異種移植胂瘤細(xì)胞的增殖。B)通過TUNEL測定評價(jià)腫瘤細(xì)胞的凋亡。圖10顯示了A23對Hep3B異種移植物的作用。用所示的針對磷酸化-p44/42MAPK(Thr202/Tyr04)和磷酸化-AKT(Ser473)抗體的磷酸化特異性抗體免疫印跡總的異種移植細(xì)胞裂解物(20pg)。總MAPK和AKT用作加樣對照。還顯示了抗-GEP印跡，并顯示了作為加樣對照的代表性的(3-肌動蛋白再探測印跡。異種移植物得自PBS對照處理小鼠(泳道1)、50嗎A23治療小鼠(泳道2)和100嗎A23治療小鼠(泳道3)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述下面詳細(xì)描述本發(fā)明的當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方案，其與后面的實(shí)施例和附圖一起用于解釋本發(fā)明的原理。本發(fā)明人由早前的cDNA微陣列分析(ll)鑒定出GEP為潛在的HCC腫瘤標(biāo)記。本發(fā)明人已進(jìn)一步驗(yàn)證了在不同的患者樣品組中的觀測結(jié)果，并證實(shí)GEP蛋白在HCC組織中^支上調(diào)(12)。另外，本發(fā)明人還證實(shí)，GEP水平正調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖和胂瘤侵襲(12)。由于GEP為分泌性自分泌生長因子，所以本發(fā)明人認(rèn)為，HCC腫瘤組織中的GEP上調(diào)還會導(dǎo)致患者的血清GEP蛋白水平升高，其因此可用作肝細(xì)胞癌的有用的診斷標(biāo)記。在本研究中，本發(fā)明人凈艮告了GEP特異性單克隆和多克隆抗體的制備。使用新近分離的單克隆抗體表明GEP蛋白水平在HCC腫瘤組織中被上調(diào)，這與先前的觀測結(jié)果一致(ll,12)。由免疫組織化學(xué)研究可知，GEP蛋白在瘤性肝細(xì)胞中表達(dá)，但在其它腫瘤組分中不表達(dá)。本發(fā)明人隨后由HCC細(xì)胞系條件培養(yǎng)基進(jìn)行免疫印跡，評價(jià)HCC細(xì)胞是否會分泌GEP蛋白。本發(fā)明人已證實(shí)，由培養(yǎng)物上清液可檢測到GEP,提示GEP可能為HCC患者血清中可檢測到的分泌性蛋白。為檢測GEP血清蛋白，使用新近分離的抗體已建立了特異性GEPELISA。針對GEP的C-末端的單克隆抗體用作捕獲抗體，針對GEP的中心部分的多克隆抗體用作檢測抗體。利用這兩種抗體組合針對GEP全長蛋白的兩種不同表位增強(qiáng)了測定的特異性，這由免疫沉淀實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)(圖1B)。盡管如此，由于HCC的異質(zhì)性(20)，在所有的HCC組織中是否會表達(dá)一種腫瘤標(biāo)記值得懷疑。然而，組合使用兩種或三種標(biāo)記將增強(qiáng)檢測的靈敏度。在本研究中，本發(fā)明人證實(shí)，血清GEP水平與HCC患者的血清AFP水平?jīng)]有關(guān)聯(lián)。任何一種標(biāo)記的HCC診斷靈敏度僅為58.0%(僅AFP)至60.7%(僅GEP)，但通過組合使用這兩種標(biāo)記，靈^:度增加至87.9%。HCC伴有的高死亡率部分原因在于其早期沒有癥狀。治療性切除僅為20%的HCC患者的治療選擇。因此，HCC的早期檢測是改善存活的重要因素。在本研究中，血清GEP在早期HCC患者中也是可檢測到的(56.6%)，提示該標(biāo)記對改善患者存活很重要的早期診斷應(yīng)當(dāng)是有用的。因此，血清GEP測定將提高HCC的早期檢測，使得可以得到更好的治療選擇和存活結(jié)果。本發(fā)明人先前已表明，使用反義方法下調(diào)GEP可顯著降低HCC在無胸腺棵小鼠模型中的致瘤性(12)。此觀測結(jié)果提示，GEP是引人注目的癌癥治療標(biāo)靶。然而，基因傳遞模式和感染/轉(zhuǎn)染效力仍是成功的癌癥基因療法的主要障礙。相比于基因療法，使用GEP抗體是對靶向癌癥療法更實(shí)用的且可行的方案。由于GEP是分泌性自分泌生長因子，因此本發(fā)明人認(rèn)為，通過GEP特異性抗體A23中和胞外GEP可以阻礙GEP的增殖功能。與反義方法的靶向不同的是，諸如赫賽汀和抗VEGF的抗體耙向療法具有較高效力和較低毒性，使靶向療法在癌癥患者中的變得切實(shí)可行。為了研究抗GEP抗體如A23的抑制作用，在1%FBS存在下，將它們添加到H印G2和Hep3B細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。與未處理對照相比，癌細(xì)胞的增殖被mAbA23以劑量依賴性方式顯著抑制(圖5A和5B)。培養(yǎng)上清液中的GEP濃度通過夾心ELISA檢測。Hep3B的培養(yǎng)上清液中的GEP濃度高于HepG2(圖5C)。在A23處理72小時(shí)后，培養(yǎng)上清液中的GEP濃度在兩種細(xì)胞系中均降低(圖5C)。該結(jié)果表明，加入A23能有效中和分泌到培養(yǎng)上清液中的GEP。還已表明，GEP在胞外調(diào)節(jié)的激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中刺激p44/42有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化。為研究抗-GEP處理的增殖抑制是否與p44/42MAPK的磷酸化相關(guān)，在用A23處理后對培養(yǎng)的細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。如圖5D所示，在培養(yǎng)上清液中加入抗-GEPA23達(dá)72小時(shí)，在HepG2和Hep3B這兩種細(xì)胞系中均顯著降低MAPK的磷酸化，提示細(xì)胞增殖的下P爭依賴于p44/42MAPK的磷酸化下降。在動物研究中，用沖直入棵小鼠的Hep3B胂瘤證實(shí)抗-GEPmAbA23的抗腫瘤作用。一旦胂瘤的大小達(dá)到約0.3cm3，就開始50貼和100嗎/注射的抗體治療。每周2次給予9劑治療，并監(jiān)測腫瘤的大小。在治療5周后，對于50昭和100路治療，用抗-GEPA23治療的小鼠的中值腫瘤體積分別為1.57cm3(范圍1.44-2.53cm3)和1.21cm3(范圍0.79-1.97cm3)，而對照小鼠的中值腫瘤體積為2.20cm3(范圍1.65-3.04cm3)。通過t-檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析證實(shí)，治療動物和未治療動物之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P〈0.05)(圖6)。該實(shí)驗(yàn)表明，在用A23治療的個體中產(chǎn)生劑量依賴性的Hep3B腫瘤生長抑制。而且，該模型模擬了臨床上大部分HCC患者在晚期才被診斷并且已經(jīng)不能手術(shù)的情形。由于抗體治療的肺瘤體積顯著下降表明，使用抗-GEP抗體中和GEP即便在所建立的腫瘤中也可顯著延遲腫瘤增殖。本研究證實(shí)，抗-GEP療法對穩(wěn)定所述疾病和/或延遲腫瘤發(fā)展是切實(shí)可行的。當(dāng)腹膜內(nèi)注射抗-GEPmAbA23時(shí)，檢測抗體效價(jià)，以便評價(jià)在小鼠血液循環(huán)中存在的實(shí)際抗體量。通過直接ELISA檢測小鼠血清中的抗-GEPmAbA23的抗體效價(jià)。正如所料，對照組中的A23水平是檢測不到的，但在治療組中仍較高。對于IOO昭治療組，A23的中值水平為74.61pg/ml(范圍為4.50pg/ml至145.48嗎/ml)。對于50嗎治療組，A23的中值水平為8.87|ng/ml(范圍為1.35-16.24pg/ml)(圖7A)。為了研究A23在血清GEP清除中的有效性，通過夾心ELISA檢測小鼠血清中的GEP濃度。對于PBS對照組，血清GEP水平是最高的，GEP的中值水平為21.46ng/ml(范圍為8.33-137.50ng/ml)。然而，在A23治療后，血清GEP水平被顯著降低(P〈0.05)。在100嗎治療后，幾乎檢測不到血清GEP水平(中值=0ng/ml,范圍為0-2.5ng/ml)。在50昭治療后，GEP的中值水平降低至7.08ng/ml(范圍為0-10.83ng/ml)(圖7B)。在治療結(jié)束時(shí)的異種移植物的組織學(xué)檢查表明，接受A23的動物的腫瘤與接受對照療法的動物的腫瘤相比具有顯著差異。在100昭A23治療組中，發(fā)現(xiàn)大塊壞死區(qū)域，相比于對照組，細(xì)胞稀少區(qū)域明顯更多(圖8A)。治療組和對照組的非腫瘤肝臟沒有明顯組織學(xué)差異(圖8B)。使用Ki-67抗體進(jìn)行異種移植物的免疫組織學(xué)檢查，在100貼A23治療小鼠中的Ki-67陽性細(xì)胞相比于對照組顯著下降(圖9A)。然而，在治療組和對照組中由TUNEL測定得到的陽性細(xì)胞數(shù)沒有差異(圖9B)。這些結(jié)果表明，A23治療的腫瘤體積下降主要由增殖下降引起的，而不是由凋亡增加引起的。為研究抗-GEP抗體對小鼠異種移植物中的腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，檢測了關(guān)鍵增殖基因MAPK和AKT的磷酸化水平。MAPK和AKT這二者在Ser473處的磷酸化在抗-GEP治療后被顯著降低，提示抗-GEP抗體治療經(jīng)MAPK和AKT途徑延遲腫瘤細(xì)胞增殖(圖10)。這些觀測結(jié)果表明，抗-GEP在體外和體內(nèi)均延遲腫瘤細(xì)胞增殖。其以劑量依賴性方式抑制p44/42MAPK磷酸化和AKT磷酸化。總之，本發(fā)明人已證明，GEP是HBV相關(guān)性HCC的新血清標(biāo)記。AFP和GEP組合提高處于早期和晚期腫瘤的HCC診斷靈敏度。這種簡單且可靠的免疫測定對檢測血清GEP濃度的可用性可以提供一種有價(jià)值的工具，以進(jìn)一步評價(jià)血清GEP對HCC管理的臨床可用性。而且，本發(fā)明人已表明，抗-GEP抗體能夠抑制所建立的HCC腫瘤的生長。這些結(jié)果表明GEP是HCC治療標(biāo)靶，并表明了抗-GEP抗體治療HCC的潛在用途。實(shí)施例1患者樣本研究方案由香港大學(xué)倫理審查委員會(theInstitutionalReviewBoardofTheUniversityofHongKong)批準(zhǔn)，并獲得患者和對照個體簽署的同意書。在1999年3月至2004年10月之間，由107名被診斷為原發(fā)性HCC的患者、38名慢性乙型肝炎患者(只有那些在2年以上的隨訪期內(nèi)沒有惡性疾病征兆的患者才被納入本研究)和72名乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陰性的健康供體獲得血樣。血清HBsAg在96名(89.7%)HCC患者中為陽性，因此對照組包括慢性乙型肝炎患者和健康志愿者。將血清樣品冷凍于-70。C直至使用。由HCC患者收集腫瘤和鄰"l妄的非腫瘤肝組織，在液氮中急凍，并儲存于-70。C直至使用。對平行切片進(jìn)行福爾馬林固定，并石蠟包埋，用于組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)研究。前瞻性收集包括所有患者和對照受試者的血清AFP水平在內(nèi)的臨床和病理學(xué)數(shù)據(jù)。實(shí)施例2細(xì)胞系將人HCC細(xì)胞系Hep3B、HepG2和Huh7(美國組織培養(yǎng)物保藏中心((AmericanTissueCultureCollection),Manassas,VA)和曰本健康科學(xué)研究資源庫((JapanHealthScienceResearchResourcesBank),Osaka,Japan))保持在補(bǔ)加10。/。胎牛血清(GibcoBRL,Carlsbad，CA)的Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。實(shí)施例3建立抗體通過用33將綴合匙孔蜮血藍(lán)蛋白(KLH)的定制GEP特異性肽SEQIDNo:3連同弗氏完全佐劑(Sigma-Aldrich,Dorset,UK)皮下免疫接種BALB/c小鼠以產(chǎn)生GEP-特異性抗體。對于隨后的加強(qiáng)免疫，每周2次腹膜內(nèi)注射在弗氏不完全佐劑中的相同量的抗原。在每次加強(qiáng)免疫后，使用針對肽抗原的ELISA監(jiān)測針對免疫抗原的血清抗體活性。對于顯示出針對所述抗原的高血清抗體效價(jià)的小鼠，給予最后1次靜脈內(nèi)注射抗原的加強(qiáng)免疫，3天后采集脾臟。抗-GEP單克隆抗體A23的產(chǎn)生由其血清中顯示出高抗體效價(jià)的小鼠采集脾臟。按照最初來源于Kohler和Milstein(21)的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行脾細(xì)胞與非生產(chǎn)性骨髓瘤細(xì)胞系NS0的融合。NS0保持在補(bǔ)加10。/。胎牛血清(GibcoBRL,Carlsbad,CA)的DMEM中。簡而言之，由小鼠脾臟收集淋巴細(xì)胞，并使用聚乙二醇1500(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)與NS0融合。通過鋪板入含HAT和20%FBS的DMEM培養(yǎng)基中選擇雜交瘤。通過ELISA選擇分泌抗體的雜交瘤，隨后通過有限稀釋亞克隆，使用小鼠MonoABID試劑盒(HRP)(ZymedLaboratories,Inc.，SanFrancisco,CA)測定單克隆抗體的同種型。開發(fā)針對GEP的多克隆抗體用100貼綴合匙孔蜮血藍(lán)蛋白(KLH)的GEP特異性肽SEQIDNo:4(ZymedLaboratories,Inc.,SanFrancisco,CA)使用標(biāo)準(zhǔn)方案(22)免疫接種新西蘭白兔。使用固定化抗原柱親和純化兔抗血清，對lxPBS透才斤，并濃縮至1mg/ml。單克隆抗體的產(chǎn)生和檢驗(yàn)為產(chǎn)生GEP單克隆抗體，使用在GEP并i基末端的16個氨基酸的合成肽SEQIDNO:3作為免疫原，以產(chǎn)生抗體。然后針對全長重組GEP和Hep3B細(xì)胞裂解物對克隆進(jìn)行另一輪ELISA篩選。然后對這些克隆的上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，并通過有限稀釋亞克隆?？寺23被鑒定為識別得自GEP重組蛋白(FL)、HCC培養(yǎng)細(xì)胞裂解物(Hep3B和HepG2)和患者組織裂解物的88-Kda的GEP糖基化形式的唯一抗體(圖1A)。為增加夾心ELISA對全長GEP的特異性，本發(fā)明人定制了另一種特異性識別OEP的中心部分SEQIDNO:4的GEP特異性多克隆抗體。為測定多克隆GEP抗體和單克隆GEP抗體的特異性，進(jìn)行免疫沉淀。單克隆GEP抗體和多克隆GEP抗體識別得自培養(yǎng)裂解物的88-kDa的糖基化GEP(圖IB)。為確定GEP是否為分泌性蛋白，使用GEP單克隆抗體檢驗(yàn)HCC細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中的GEP。如圖1C所示，在HCC細(xì)胞的上清液中可檢測到88-kDa的糖基化GEP。通過對腫瘤組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)揭示GEP定位。發(fā)現(xiàn)蛋白信號一律與瘤性肝細(xì)胞相關(guān)，但與腫瘤組織中的內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞不相關(guān)，而在非腫瘤組織中的肝細(xì)胞沒有顯示出信號(圖2)。實(shí)施例4蛋白質(zhì)提取、蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀對HCC細(xì)胞系、HCC和鄰近的非腫瘤肝組織進(jìn)行蛋白印跡分析。通過在含有1mMPMSF的緩沖液A(8M尿素，50mMTris-HClpH8.0)中勻漿急凍的患者樣品提取總蛋白。通過10%SDS-PAGE凝膠繼之以蛋白質(zhì)印跡分離總共10昭蛋白提取物。用5%脫脂乳的PBS/0.1%Tween20溶液封閉印跡，并用適宜的單克隆抗體〗笨測。多克隆山羊抗(3-肌動蛋白抗體以1:1000稀釋度使用(DAKO，Glostmp,Denmark)。綴合辣根過氧化物酶(HRP)的抗小鼠和抗山羊二抗分別以1:3000稀釋度使用(APbiotech,ChalfontSt,Giles,UK)。按照生產(chǎn)商的說明(APbiotech,ChalfontSt.Giles,UK)進(jìn)行ECL。用500嗎細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀，并與1|iig純化的單克隆抗體溫育。在SDS-PAGE上分離免疫復(fù)合物，并用多克隆抗-GEP抗體免疫印跡。實(shí)施例5免疫組織4匕學(xué)對石蠟包埋的HCC和鄰接的非腫瘤肝臟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。方案先前已描述，并有修改(12)。通過微波進(jìn)行抗原修復(fù)，切片浸沒在檸檬酸鹽緩沖液中，接著浸沒在內(nèi)源過氧化物酶封閉試劑和生物素封閉試劑(DAKO,Glostrup,Denmark)中。適宜的單克隆抗體以2昭/ml使用。通過綴合HRP的抗小鼠二抗檢測信號，并用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為色原顯色。用蘇木精反染色組織切片。實(shí)施例6測定受試者血清中的GEP水平以每孔0.5貼抗-GEPmAbA23的50plPBS溶液包被96孔ELISA板(NalgeNuncInternational,Rochester,NY)。用300pl封閉緩沖液(lxPBS,1%BSA,5%蔗糖，0.05。/。NaN3)封閉板l小時(shí)，然后加入50pl1:5稀釋的血清樣品，并于室溫溫育2小時(shí)。在用0.05%Tween20的lxPBS溶液洗滌未結(jié)合的物質(zhì)后，使用親和純化的抗-GEP兔多克隆抗體(1:2000,1mg/ml)，接著使用TMB(PierceBiotechnologyInc.，Rockford，IL)作為底物與綴合辣根過氧化物酶的山羊抗兔IgG(ZymedLaboratories,Inc，SanFrancisco,CA.)溫育，從而檢測結(jié)合的GEP。為定量存在于血清中的GEP，平行進(jìn)行以含10%胎牛血清的PBS稀釋的純化GEP的校準(zhǔn)曲線。每個樣品都以一式四份檢測3次。GEP夾心ELISA的動態(tài)范圍為469pg/ml至30ng/ml。將合并的患者血清樣品納入每個測定，用于調(diào)整板與板之間的偏差。測定之內(nèi)和之間的偏差分別為2.9%(范圍1.1-5.5%)和5.0%(范圍1.3-10.8%)。通過特異性ELISA檢測107名HCC患者、72名健康個體和38名慢性乙型肝炎患者的血清GEP蛋白水平(圖3)。健康受試者的中值和平均血清GEP水平分別為4.59ng/ml和5.63ng/ml(范圍0-20.46ng/ml)。慢性乙型肝炎患者的血清GEP的中值和平均濃度分別為6.03ng/ml和6.85ng/ml(范圍0.17-28.36ng/ml)。HCC患者的中值水平和平均血清GEP水平分別為10.53ng/ml和l6.09ng/ml(范圍0-113.59ng/ml)。在HCC患者中檢測的血清GEP水平顯著高于健康對照(尸<O.OOl)和慢性乙型肝炎患者(戶<O.OOl)的該水平。還建立了GEP的ROC曲線(圖4),表明AUC為0.74(95%CI0.67-0.81,P<0.001)。為辨別HCC與包括慢性乙型肝炎攜帶者和健康個體在內(nèi)的對照，使用Youden指數(shù)確定類別預(yù)測的最佳截取值。最佳截取值為9.07ng/ml，其分別達(dá)到了60.7%的靈敏度和82.5%的特異性。實(shí)施例7用血清AFP和GEP的組合篩選診斷HCC還檢測了同一組樣品的血清AFP水平，并與血清GEP數(shù)據(jù)相比較。在使用血清AFP水平進(jìn)行HCC診斷時(shí)，使用100ng/ml的截取值，其^皮視為相對高的和特異性的(表1和2)。還檢驗(yàn)了20ng/ml的較低血清AFP截取值，與血清GEP比較的數(shù)據(jù)在補(bǔ)充表1和2中提供。通過血清AFP(58.0%,62/107，截取值為100ng/ml)和血清GEP(60.7%,65/107，截取值9.07ng/ml)進(jìn)行HCC診斷的靈敏度相當(dāng)(表1)。在HCC患者中，GEP和AFP血清水平之間沒有關(guān)聯(lián)(r--0.113;P=0.243)。大部分HCC患者(87.9%，94/107)表現(xiàn)出血清GEP(〉9.07ng/ml)或AFP(>100ng/ml)升高。重要之處在于，同時(shí)使用這兩個標(biāo)記將HCC診斷的靈敏度由58.0%(僅AFP升高)增加至87.9%(AFP或GEP或這二者的升高)。實(shí)施例8用血清AFP和GEP的組合篩選早期診斷HCC早期診斷是能使HCC患者接受有效治療和改善存活的關(guān)鍵。按照胂瘤階段檢驗(yàn)血清標(biāo)記的性能。在早期HCC患者中，通過血清GEP(56.6%,43/76)和血清AFP(55.3%,42/76)進(jìn)行檢測的靈敏度是相似的(表2)。在晚期患者中，通過血清GEP進(jìn)行HCC檢測的靈敏度(71.0%,22/31)稍好于血清AFP(64.5%,20/31)。在84.2%(64/76)的早期患者和96.8%(30/3l)的晚期HCC患者中觀察到血清GEP或AFP升高。因此，在早期和晚期HCC患者中使用兩個標(biāo)記均應(yīng)增加診斷靈敏度。實(shí)施例9細(xì)胞增殖測定經(jīng)由3-(4,5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)測定檢測細(xì)胞增殖。簡而言之，如所示將5x103個細(xì)胞接種至含有1%FBS、有或沒有mABA23的100plDMEM培養(yǎng)基的96孔板。每24小時(shí)用含有0.5mg/mlMTT的100plDMEM更換培養(yǎng)基，并于37°C溫育3小時(shí)。以100plMTT溶劑(O.lNHC1的異丙醇溶液)溶解晶體，吸光度以540nm的檢測值減去650nm的背景吸光度作圖。每個數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，每個實(shí)驗(yàn)以一式三份進(jìn)行。在1%FBS存在下，將抗-GEPmAbA23加至HepG2和Hep3B細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中，與未處理的對照相比，癌細(xì)胞增殖受到所述mAb的顯著抑制(圖5A和B)。這種抑制為劑量依賴性方式(圖5B)。培養(yǎng)上清液的GEP濃度通過夾心ELISA檢測。Hep3B在培養(yǎng)上清液中的GEP濃度高于H印G2(圖5C)。在A23處理72小時(shí)后，培養(yǎng)上清液中的GEP濃度在兩個細(xì)胞系中均降低(圖5C)。該結(jié)果表明，加入A23可有效中和分泌到培養(yǎng)上清液中的GEP。實(shí)施例10抗-GEP抗體處理對MAPK磷酸化的作用在含有1mMPMSF的細(xì)胞裂解緩沖液(CellSignalingTechnologyInc.,Beverly,MA)中勻漿小鼠異種移植物和Hep3B細(xì)胞以提取總蛋白。通過10。/oSDS-PAGE凝膠繼之以蛋白質(zhì)印跡分離總共10昭蛋白提取物。用5%脫脂乳的PBS/0.1%Tween20溶液封閉印跡，并用適宜的抗體探測。多克隆山羊抗|3-肌動蛋白抗體以1:1000稀釋度使用(DAKO,Glostr邵，Denmark)。多克隆兔抗-GEP抗體以l:500稀釋度使用(12)。針對p44/p42MAPK和磷酸化-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)的抗體按照生產(chǎn)商的說明(CellSignalingTechnology,Inc.,Beverly,MA)使用。綴合HRP的抗小鼠、抗兔和抗山羊二抗分別以1:3000稀釋度使用(APbiotech，ChalfontSt.Giles,UK)。按照生產(chǎn)商說明(APbiotech,ChalfontSt.Giles,UK)進(jìn)行ECL。業(yè)已表明，GEP在胞外調(diào)節(jié)的激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中刺激p44/42有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化(23)。為研究抗-GEP處理的增殖抑制是否與p44/42MAPK的磷酸化相關(guān)，在用A23處理后對培養(yǎng)細(xì)胞的裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。如圖5D所示，在培養(yǎng)上清液中加入抗-GEPA23達(dá)72小時(shí)，在HepG2和Hep3B這兩個細(xì)胞系中均顯著降低MAPK的磷酸化，提示細(xì)胞增殖的降低依賴于p44/42MAPK的磷酸化降低。實(shí)施例11棵小鼠的HCC異種移植物和皮下異種移植物的治療本研究方案由香港大學(xué)關(guān)于教學(xué)和研究中活體動物的使用的委員會批準(zhǔn)。將小鼠(11=15)關(guān)在12小時(shí)晝夜循環(huán)的柵欄實(shí)驗(yàn)室中，并接受食物和水。所有的操作都在小鼠處于異氟烷氣體麻醉之下時(shí)進(jìn)行。沒有小鼠顯示出消瘦跡象或其它毒性跡象。將Hep3B細(xì)胞(2x106個細(xì)胞/小鼠)皮下注射至5至6周齡的雄性無胸腺棵小鼠。用游標(biāo)卡尺測量測定腫瘤的大小，按照式(axb2)/2計(jì)算腫瘤體積，其中a和b分別為最大和最小直徑(24)。在腫瘤體積達(dá)到約0.3cn^的平均腫瘤體積時(shí)開始治療，將小鼠隨機(jī)分為3組(11=5)。在研究過程中每周2次腹膜內(nèi)注射抗體。據(jù)我們初步研究，在腹膜內(nèi)注射后血清A23抗體在小鼠中的半衰期時(shí).間(丁1/2)長于72小時(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)，因此，選擇每周2次腹膜內(nèi)注射100嗎和50貼的治療方案。第1組小鼠用100昭純化的小鼠IgG(Zigma-Aldrich，SaintLouis,MO)或PBS治療。在初步研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，小鼠IgG或PBS對腫瘤生長沒有差異。第2組和第3組小鼠分別用50嗎和100貼A23mAb治療。檢驗(yàn)抗-GEPmAbA23對植入棵小鼠的Hep3B肺瘤的抗胂瘤作用。一旦腫瘤的大小達(dá)到約300mm3，就開始50昭和100pg/注射的抗體治療。每周2次給予9劑治療，并監(jiān)測腫瘤的大小。在5周治療后，對于50昭和IOO昭治療，用抗-GEPA23治療的小鼠的中值腫瘤體積分別為1.57cm3(范圍為1.44-2.53cm3)和1.21cm3(范圍為0.79-1.97cm3)，而對照小鼠的中值腫瘤體積為2.20cm3(范圍1.65-3.04cm3)。通過t-檢驗(yàn)方差分析證實(shí)，治療動物和未治療動物之間的差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P〈0.05)(圖6)。用A23治療產(chǎn)生劑量依賴性的Hep3B腫瘤生長抑制。實(shí)施例12定量A23治療后小鼠血清中的GEP收集小鼠血清，使用ELISA檢測抗體濃度和血清GEP濃度。當(dāng)腹膜內(nèi)注射抗-GEPmAbA23時(shí)，檢測抗體效價(jià)，以便評價(jià)小鼠血液循環(huán)中存在的實(shí)際抗體量。小鼠血清中的抗-GEPmAbA23的抗體效價(jià)通過直接ELISA檢測。正如所料，對照組的A23水平檢測不到，但治療組中仍然較高。對于100pg治療組，A23的中值水平為74.61jig/ml(范圍為4.50pg/ml至145.48昭/ml)。對于50將治療組，A23的中值水平為8.87ng/ml(范圍為1.35-16.24pg/ml)(圖7A)。為了檢驗(yàn)A23在血清GEP清除中的有效性，通過夾心ELISA檢測小鼠血清的GEP濃度。對于PBS對照組，血清GEP水平是最高的，GEP的中值水平為21.46ng/ml(范圍為8.33-137.50ng/ml)。然而，在A23治療后，血清GEP水平被顯著降低(P<0.O5)。在100嗎治療后，幾乎檢測不到血清GEP水平(中值-Ong/ml，范圍為0-2.5ng/ml)。在50嗎治療后，GEP的中值水平降低至7.08ng/ml(范圍為0-10.83ng/ml)(圖7B)。實(shí)施例13安樂死和l且織處理至第5周末使小鼠安樂死。收集異種移植物和肝組織，在液氮中急凍，并儲存于-70。C直至使用。對平行切片進(jìn)行福爾馬林固定，并石蠟包埋，用于組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)研究。A23治療后的異種移植物的組織學(xué)檢查治療結(jié)束時(shí)的異種移植物的組織學(xué)檢查表明，給予A23的動物的腫瘤相比于接受對照治療的動物的腫瘤有顯著差異。在100pgA23治療組中，發(fā)現(xiàn)大塊壞死區(qū)域，相比于對照組有顯著更多的細(xì)胞稀少區(qū)域(圖8A)。治療組和對照組的非腫瘤肝臟沒有明顯組織學(xué)差異(圖8B)。使用Ki-67抗體進(jìn)行異種移植物的免疫組織學(xué)檢查，在100嗎A23治療小鼠中的Ki-67陽性細(xì)胞相比于對照組顯著下降(圖9A)。然而，在治療組和對照組中由TUNEL測定得到的陽性細(xì)胞數(shù)沒有差異(圖9B)。這些結(jié)果表明，A23治療的腫瘤體積下降主要是由增殖下降引起的，而不是由凋亡增加引起的。實(shí)施例14體內(nèi)抗-GEP抗體治療的作用為研究A23作用于細(xì)胞增殖的機(jī)制，使用得自治療后的小鼠腫瘤異種移植物的總蛋白裂解物檢查關(guān)鍵增殖蛋白MAPK和AKT的磷酸化水平。按照生產(chǎn)商的說明(CellSignalingTechnology,Inc.,Beverly,AKT和磷酸化-AKT(ser473)的抗體。MAPK和AKT在Ser473處的磷酸化在抗-GEP治療下被降低(圖10)，提示抗-GEP抗體治療在小鼠腫瘤異種移植物中經(jīng)由MAPK和AKT途徑延遲腫瘤細(xì)月包增殖。實(shí)施例15抗-GEP抗體的開發(fā)用位于SEQIDNo.5、6、7、8、9、10、11、12或13及其周圍的GEP特異性肽序列免疫接種BALB/c小鼠或新西蘭白兔產(chǎn)生GEP特異性抗體(圖11)。使用抗-GEP單克隆抗體或抗-GEP多克隆抗體檢測血清GEP水平或抑制胂瘤生長。參考文獻(xiàn)1.El-SeragHB:Hepatocellularcarcinoma:Anepidemiologicview.(肝細(xì)胞癌流行病學(xué)觀察)JClinGastroenterol2002;35:S72隱8.2.MontaltoG,CervelloM,GiannitrapaniL等Epidemiology,riskfactors,andnaturalhistoryofHepatocellularcarcinoma.(肝纟田月包癌的';t行病學(xué)、風(fēng)險(xiǎn)因子和自然史)AnnNYAcadSci2002;963:13-20.3.BefelerAS,DiBisceglieAM:Hepatocellularcarcinoma:diagnosisandtreatment.(肝細(xì)月包癌i貪斷和治療)Gastroenterology2002;122:1609-19.4.YuAS,KeeffeEB:ManagementofHepatocellularcarcinoma.(肝細(xì)胞癌的管理)RevGastroenterolDisord2003;3:8-24.5.FanST,LoCM,LiuCL等HepatectomyforHepatocellularcarcinoma:Towardzerohospitaldeaths.(肝細(xì)月包癌的肝切除術(shù)醫(yī)院零死亡目標(biāo))AnnSurg1999;229:322-30.6.NgKK,LamCM,PoonRT等Thermalablativetherapyformalignantlivertumors:acriticalappraisal.(惡性肝腫瘤的熱消融療法關(guān)4t評價(jià))JGastroenterolHepatol2003;18:616國29.7.MacDonaldDJ,KellyAM:Therapidquantitationofserumalpha-fetoproteinbytwo-sitemicroenzymeimmunoassay.(雙位微酶免疫測定快速定量血清甲胎蛋白)ClinChimActa1978;87:367-72.8.TaketaK:Alpha-fetoprotein:reevaluationinhepatology.(曱月臺蛋白在肝臟病學(xué)中的重新評價(jià))Hepatology1990;12:1420-32.9.JohnsonPJ:Theroleofserumalpha-fetoproteinestimationinthediagnosisandmanagementofHepatocellularcarcinoma.(評估血清曱月臺蛋白在肝細(xì)胞癌的診斷和管理的作用)ClinLiverDis2001;5:145-59.10.GeboKA,ChanderG,JenckesMW等ScreeningtestsforHepatocellularcarcinomainpatientswithchronichepatitisC:asystematicreview.(用于慢性丙型肝炎患者的肝細(xì)胞癌的篩選測試系統(tǒng)性綜述)Hepatology2002;36:S84畫92.11.ChenX,CheungST,SoS等Geneexpressionpatternsinhumanlivercancers.(人肝癌的基因表ii^莫式)MolBiolCell2002;13:1929-39.12.CheungST，WongSY，LeungKL等Granulin誦ep池elinprecursoroverexpressionpromotesgrowthandinvasionofHepatocellularcarcinoma.(顆粒體蛋白-上皮素前體過表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的生長和侵襲)ClinCancerRes2004;10:7629-36.13.GuillemardV,SaragoviHU.Novelapproachesfortargetedcancertherapy.(革巴向癌癥療法的新途徑)CurrCancerDrugTargets2004;4:313-326.14.AdamsGP,WeinerLM.Monoclonalantibodytherapyofcancer.(癌癥的單克隆抗體療法)NatBiotechnol2005;23:1147-1157.15.vonSchillingC.Immunotherapywithanti-CD20compounds.(采用抗CD20化合物的免疫療法)SeminCancerBiol.2003;13:211-22.16.ShakS.Overviewofthetmstuzumab(Herceptin)anti-HER2monoclonalantibodyclinicalprograminHER2畫overexpressingmetastaticbreastcancer.(曲妥珠單抗(赫賽汀)抗HER2單克隆抗體臨床計(jì)劃在HER2過表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳癌中的綜述)HerceptinMultinationalInvestigatorStudyGroup(赫賽汀多國調(diào)查研究小組).SeminOncol,1999:71-717.WillemsA,GaugerK,HenrichsC,HarbeckN.Antibodytherapyforbreastcancer.(乳癌的抗體療法)AnticancerRes.2005;25:1483-9.18.VanhoeferU，TewesM，RojoF,DirschO,SchleucherN,RosenO,TillnerJ，KovarA,BraunAH,TrarbachT,SeeberS,HarstrickA,BaselgaJ.PhaseIstudyofthehumanizedantiepidermalgrowthfactorreceptormonoclonalantibodyEMD72000inpatientswithadvancedsolidtumorsthatexpresstheepidermalgrowthfactorreceptor.(人源化抗表皮生長因子受體單克隆抗體EMD72000在表達(dá)表皮生長因子受體的晚期實(shí)體瘤患者中的I期研究)JClinOncol.2004,22:175-84.19.FernandoNH,HurwitzHI.Targetedtherapyofcolorectalcancer:clinicalexperiencewithbevacizumab.(結(jié)腸直腸癌的革巴向治療采用貝伐單抗的臨床實(shí)驗(yàn))Oncologist.2004;9:11-8.20.ThorgeirssonSS，GrishamJW:Molecularpathogenesisofhumanhepatocellularcarcinoma.(人肝細(xì)月包癌的分子致病才幾理)NatGenet2002;31:339-46.21.KohlerG,MilsteinC:Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.(分泌預(yù)定特異性的抗體的融合細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng))Nature1975;256:495-7.22.CampbellAM:Productionandpurificationofantibodies.(4元體的生產(chǎn)和純化)栽于DiamandisEP,ChristopoulosTK編輯，Immunoassay.95-15頁.SanDiego,CA:AcademicPress,1996.23.Zanocco-MaraniT,BatemanA,RomanoG,ValentinisB，HeZH,BasergaR.Biologicalactivitiesandsignalingpathwaysofthegranulin/epithelinprecursor.(顆粒體蛋白/上皮素前體的生物活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)CancerRes.1999;59:5331-40.24.ShimadaN,IshiiT,ImadaT,TakabaK，SasakiY，Maruyama-TakahashiK,Maekawa-TokudaY，KusakaH，AkinagaS，TanakaA,ShitaraK.Aneutralizinganti-fibroblastgrowthfactor8monoclonalantibodyshowspotentantitumoractivityagainstandrogen-dependentmousemammarytumorsinvivo.(中和抗成纖維纟田胞生長因子8單克隆抗體顯示出在體內(nèi)抗雄激素依賴性小鼠乳房腫瘤的有效抗腫瘤活性)ClinCancerRes2005;11:3897-904.表1.顆粒體蛋白-上皮素前體(GEP)和甲胎蛋白(AFP)在肝細(xì)胞癌患者(n-107)中的診斷靈敏度<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表2.顆粒體蛋白-上皮素前體(GEP)和曱胎蛋白(AFP)在不同肺瘤階段的肝細(xì)胞癌患者中的診斷靈敏度早期AFPGEP<100ng/ml〉100ng/ml總計(jì)<9.07ng/ml12(15.8%)21(27.6%)33(43.4%)>9.07ng/ml22(28.9%)21(27.6%)43(56.6%)總計(jì)34(44.7%)42(55.3%)76(100%)晚期AFPGEP<100ng/ml〉100ng/ml總計(jì)<9.07ng/ml1(3.2%)8(25.8%)9(29.0%)>9.07ng/ml10(32.3%)12(38.7%)22(71.0%)總計(jì)11(35.5%)20(64.5%)31(100%)28補(bǔ)充表1.顆粒體蛋白-上皮素前體(GEP)和曱胎蛋白(AFP)在肝細(xì)胞癌患者(n=107)中的診斷靈敏度AFPGEP<20ng/ml〉20ng/ml總計(jì)<9.07ng/ml9(8.4%)33(30,8%)42(39.3%)〉9.07ng/ml24(22.4%)41(38.3%)65(60.7%)總計(jì)33(30.8%)74(69.2%)107(100%)補(bǔ)充表2.顆粒體蛋白-上皮素前體(GEP)和甲胎蛋白(AFP)在不同腫瘤階段的肝細(xì)胞癌患者中的診斷靈敏度早期AFPGEP<20ng/ml〉20ng/ml總計(jì)<9.07ng/ml〉9.07ng/ml9(11.8%)16(21.1%)24(31.6%)27(35.5%)33(43.4%)43(56.6%)總計(jì)25(32.9%)51(67.1%)76(100%)晚期AFPGEP<20ng/ml〉20ng/ml總計(jì)<9.07ng/ml>9.07ng/ml0(0%)8(25.8%)9(29.0%)14(45.2%)9(29.0%)22(71.0%)總計(jì)8(25.8%)23(74.2%)31(100%)權(quán)利要求1.一種檢測生物樣品中的GEP蛋白的方法，包括以下步驟在包被抗-GEP單克隆抗體的ELISA板中溫育所述樣品；將所述板與抗-GEP多克隆抗體溫育；和將所述板與綴合辣根過氧化物酶的抗兔IgG溫育；與TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺)溫育；和記錄樣品的光密度。2.權(quán)利要求1的方法，其中抗-GEP單克隆抗體由GEP特異性肽在小鼠中產(chǎn)生。3.權(quán)利要求1的方法，其中抗-GEP單克隆抗體由SEQIDNo.3所示的GEP特異性肽產(chǎn)生。4.權(quán)利要求1的方法，其中抗-GEP多克隆抗體由GEP特異性肽在兔中產(chǎn)生。5.權(quán)利要求1的方法，其中抗-GEP多克隆抗體由SEQIDNo.4所示的GEP特異性肽產(chǎn)生。6.—種確定患者是否患有肝細(xì)胞癌(HCC)的方法，包括以下步驟由所述患者收集生物樣品；在包祐^抗-GEP單克隆抗體的ELISA板中溫育所述樣品；將所述板與抗-GEP多克隆抗體溫育；將所述板與綴合辣根過氧化物酶的抗兔IgG溫育；將所述板與TMB(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)溫育；記錄所迷樣品的光密度，相對于純化的GEP的校準(zhǔn)曲線確定GEP水平；和將GEP水平與已知標(biāo)準(zhǔn)品比豐支確定所述樣品的HCC風(fēng)險(xiǎn)。7.權(quán)利要求6的方法，其中抗-GEP單克隆抗體在小鼠或兔中由GEP特異性肽產(chǎn)生。8.權(quán)利要求6的方法，其中抗-GEP單克隆抗體由SEQEDNo.3所示的GEP特異性肽產(chǎn)生。9.權(quán)利要求6的方法，其中抗-GEP多克隆抗體由在兔中免疫接種的GEP特異性肽產(chǎn)生。10.權(quán)利要求6的方法，其中抗-GEP多克隆抗體由SEQIDNo.4所示的GEP特異性肽產(chǎn)生。11.一種在患有肝細(xì)胞癌的患者中抑制肝細(xì)胞癌生長的方法，包括給予所述患者在藥學(xué)上有效的溶媒中的有效量的抗-GEP抗體。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述抗-GEP抗體可以腹膜內(nèi)、靜界K內(nèi)或腫瘤內(nèi)給予。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-GEP單克隆抗體由SEQIDNo.2中的GEP特異性肽產(chǎn)生，所述GEP特異性肽位于SEQIDNo.4、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示的區(qū)域或所述區(qū)域周圍。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-GEP多克隆抗體由SEQIDNo.2中的GEP特異性肽產(chǎn)生，所述GEP特異性肽位于SEQIDNo.3、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示的區(qū)域或所述區(qū)域周圍。15.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗-GEP單克隆抗體由SEQIDNo.2中的GEP特異性肽產(chǎn)生，所述GEP特異性肽位于SEQIDNo.4、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示的區(qū)域或所述區(qū)域周圍。16.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗-GEP兔多克隆抗體由SEQIDNo.2中的GEP特異性肽產(chǎn)生，所述GEP特異性肽位于SEQIDNo.3、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示的區(qū)域或所述區(qū)域周圍。17.—種抑制患者肝細(xì)胞癌(HCC)生長的方法，包括給予所述患者有效量的權(quán)利要求15所述的抗-GEP單克隆抗體以抑制HCC生長。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗-GEP單克隆抗體可以通過腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)給予。19.一種使用權(quán)利要求16所述的抗-GEP多克隆抗體抑制患者肝細(xì)月包癌生長的方法。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗-GEP多克隆抗體可以腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或胂瘤內(nèi)給予。21.—種藥物組合物，其在藥學(xué)上可接受的溶i某中含有有效量的抗-GEP單克隆抗體A23以抑制HCC細(xì)胞增殖或生長。22.—種抑制患有HCC的哺乳動物的HCC細(xì)胞增殖或生長的方法，包括給予所述哺乳動物有效量的抗-GEP單克隆抗體以抑制HCC細(xì)J包增殖或生長。23.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品可以為血液、血清、血漿或尿。24.權(quán)利要求6的方法，其中所述生物樣品可以為血液、血清、血漿或尿。25.權(quán)利要求l的方法，其中所述抗-GEP抗體由涉及SEQIDNo.1中的GEP特異性區(qū)域的試劑產(chǎn)生，所述GEP特異性區(qū)域位于SEQIDNo.3a、4a、5a、6a、7a、8a、9a、10a、lla、12a或13a中所示的區(qū)域或所述區(qū)域周圍。26.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗-GEP抗體由涉及SEQIDNo.1中的GEP特異性區(qū)域的試劑產(chǎn)生，所述GEP特異性區(qū)域位于SEQIDNo.3a、4a、5a、6a、7a、8a、9a、10a、lla、12a或13a中所示的區(qū)域或所述區(qū)域周圍。27.權(quán)利要求11的方法，其中所述抗-GEP抗體由涉及SEQIDNo.1中的特異性區(qū)域的試劑產(chǎn)生，所述特異性區(qū)域位于SEQIDNo.3a、4a、5a、6a、7a、8a、9a、10a、lla、12a或13a中所示的區(qū)域或所述區(qū)域周圍。全文摘要本發(fā)明提供檢測血清GEP水平的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過檢測血清GEP水平確定患者是否患有肝細(xì)胞癌(HCC)的方法。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用抗-GEP單克隆抗體A23治療患者從而在體外和體內(nèi)均抑制HCC生長和發(fā)展的方法。文檔編號G01N33/535GK101553728SQ200780040670公開日2009年10月7日申請日期2007年11月28日優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日發(fā)明者何頌怡,張兆恬,范上達(dá)申請人:香港大學(xué)